吳茜茜,徐詩靚,趙玥昕,王凌霞,王波,楊歡,2(1.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院a.檢驗科,b.腫瘤科,江蘇蘇州215004;2.蘇州大學(xué)放射醫(yī)學(xué)與輻射防護國家重點實驗室,江蘇蘇州215004)

乳腺癌(BC)是危害女性生命健康的主要腫瘤之一,其發(fā)病率居女性惡性腫瘤首位[1]。放射治療是乳腺癌治療中不可或缺的一環(huán),它與手術(shù)治療相輔相成,可進一步提高患者治愈率。然而放療抵抗仍是獲得理想臨床應(yīng)用效果的主要障礙[2]。研究發(fā)現(xiàn),長鏈非編碼 RNA(LncRNA)在乳腺癌患者中的異常表達導(dǎo)致部分患者產(chǎn)生了放療抵抗的現(xiàn)象,影響了乳腺癌患者的放射治療效果[3-4]。因此,探討LncRNA在乳腺癌中的調(diào)控功能,對于乳腺癌放射治療有效性的提高具有至關(guān)重要的作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),LncRNA RP3-340B19.3在乳腺癌患者中呈高表達,可促進乳腺癌細胞增殖、遷移等惡性生物學(xué)行為。目前關(guān)于RP3-340B19.3在乳腺癌放療中的作用尚未明確。本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上以人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231作為研究對象,進一步探討RP3-340B19.3對乳腺癌細胞放療后抵抗的生物學(xué)影響,以期為改善乳腺癌放射治療療效提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞系、主要儀器與試劑 人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231(中國科學(xué)院上海細胞庫),高糖DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM無血清培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技公司),Lipofectamine 2000、Trizol試劑(美國Invitrogen公司),細胞周期試劑盒(北京蘭杰柯科技公司),細胞凋亡試劑盒(美國BD公司),RP3干擾片段(蘇州吉瑪基因股份有限公司)。CO2細胞培養(yǎng)箱(日本三洋公司),QuantStudio 3定量PCR儀(美國ABI公司),CytoFLEX流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司),高速低溫離心機(德國Eeppendorf公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 取生長狀態(tài)良好的乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231接種于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2細胞輻照 收集生長狀態(tài)良好的MCF-7細胞、MDA-MB-231細胞并進行輻照。輻照條件設(shè)置為:靶源距100 cm,輻照場大小為 10 cm×10 cm,照射的劑量率設(shè)定為3 Gy/min。

1.2.3引物設(shè)計及qRT-PCR 根據(jù)Trizol試劑說明書提取各組乳腺癌細胞總RNA,使用 NanoDrop 2000微量分光光度計檢測RNA濃度與純度,選取吸光度比值(A260 nm/A280 nm)在1.8～2.0之間的樣本用于后續(xù)試驗。參照HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書將1 μg 總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,樣本置于-20 ℃保存。使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計引物,引物由上海生工公司合成。GAPDH(NM_001357943.2)上游引物序列(F):5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′,下游引物序列(R):5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′,擴增片段長度為138 bp,退火溫度為60 ℃。LncRNA RP3-340B19.3(XR-007076734.1)上游引物序列(F):5′-AGGTGCGTCCATGTCTGTCT-3′,下游引物序列(R):5′-TCCCTTGGGCTGGAGATTGG-3′,擴增片段長度為147 bp,退火溫度為60 ℃。按照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒說明書以cDNA為模板進行qRT-PCR。qRT-PCR反應(yīng)總體積為20 μL,包括:2×SYBR Green Master Mix 10 μL,10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 7.2 μL。循環(huán)參數(shù):95 ℃預(yù)變性 10 min,95 ℃變性 10 s,60 ℃退火30 s,共40次循環(huán)。使用ABI QuantStudio 3定量PCR儀進行擴增,QuantStudio 3 Real-time PCR System軟件分析擴增曲線和熔解曲線。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算 RP3-340B19.3 的相對表達量,公式:ΔΔCt=(ΔCt實驗組-ΔCt對照組),ΔCt= Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.2.4細胞轉(zhuǎn)染與輻照 取生長狀態(tài)良好的MCF-7、MDA-MB-231細胞,以每孔(15～20)×104個/孔的細胞密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板,待培養(yǎng)細胞密度達60%～70%時進行轉(zhuǎn)染。首先將10 μL si-NC、si-RP3分別溶于240 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中,另取5 μL Lipofectamine 2000溶于245 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基,靜置5 min。將Lipofectamine 2000溶液與si-NC/si-RP3溶液混合,si-NC/si-RP3的最終濃度為250 nmol/L,靜置20 min,分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)孔,6 h后更換為含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后,對各組細胞進行放射處理,輻照劑量為6 Gy,分別記為si-NC組、si-RP3組、si-NC+6 Gy組、si-RP3+6 Gy組。繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h后,各組細胞用于后續(xù)試驗。

1.2.5克隆形成試驗 收集各組轉(zhuǎn)染的MCF-7、MDA-MB-231細胞,制備細胞懸液,根據(jù)不同放射劑量,接種不同細胞數(shù)至6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)(放射劑量分別為0、2、4、6、8 Gy,接種細胞數(shù)分別為1 000、2 500、5 000、6 000、8 000個/孔)。第二天待細胞貼壁后置于放射裝置下予以0、2、4、6、8 Gy不同劑量放射。放射結(jié)束后繼續(xù)置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3～5 d更換一次新鮮的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基,待出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)。采用4%多聚甲醛固定20 min,0.5%結(jié)晶紫染色15 min,PBS清洗,干燥后置于顯微鏡下,以觀察單個克隆團中細胞數(shù)>50個為有效克隆數(shù),計算克隆形成率。計算公式:克隆形成率(PE)=集落數(shù)/細胞接種數(shù)×100%;細胞存活分數(shù)(SF)=照射后細胞形成集落數(shù)/(接種細胞數(shù)×未照射細胞集落形成率)×100%。采用SigmaPlot軟件擬合出細胞的存活分數(shù)曲線,設(shè)定計算函數(shù)Y=1-[1-exp(-k×X)]N進行單擊多靶模型擬合分析生存曲線,計算放射增敏比(SER)。

1.2.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡變化 使用不含EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶消化并收集si-NC組、si-RP3組、si-NC+6 Gy組、si-RP3+6 Gy組細胞。各組細胞處理步驟如下:預(yù)冷PBS洗滌細胞2次,用1×Binding Buffer將細胞濃度調(diào)整為1×106/mL。取100 μL細胞懸液與5 μL PE 和5 μL 7-AAD混合,室溫避光溫育15 min。加入400 μL 1×Binding Buffer混勻,檢測。結(jié)果判讀:右上象限(Annexin V+/7-AAD+)為晚凋細胞;右下象限(Annexin V+/7-AAD-)為早凋細胞?？偟蛲黾毎?早凋細胞+晚凋細胞。

1.2.7流式細胞術(shù)檢測細胞周期 用含EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶消化,收集si-NC組、si-RP3組、si-NC+6 Gy組、si-RP3+6 Gy組細胞,預(yù)冷的PBS洗滌細胞1～2次,1 000×g離心5 min收集細胞(細胞數(shù)約為1×105～1×106個)。細胞沉淀用300 μL預(yù)冷PBS重懸,后滴加700 μL無水乙醇,4 ℃固定過夜;第二天加入1 mL預(yù)冷PBS重懸。再次1 000×g離心5 min沉淀細胞。小心吸棄上清。輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞,避免細胞成團。每管中加入0.5 mL碘化丙啶(PI)染色液,輕輕混勻重懸細胞沉淀,37 ℃避光溫育30 min。流式細胞儀在激發(fā)波長488 nm波長處檢測紅色熒光,通過設(shè)門排除黏連細胞與細胞碎片帶來的干擾,計數(shù)10 000個細胞,結(jié)果用細胞周期擬合軟件ModFitLT5分析。

2 結(jié)果

2.1輻照乳腺癌細胞后RP3-340B19.3的表達水平 經(jīng)6 Gy輻照后,MCF-7細胞RP3-340B19.3的表達量顯著高于0 Gy組(1.330±0.060 vs 1.030±0.074,t=5.56,P=0.005),MDA-MB-231細胞RP3-340B19.3的表達量亦高于0 Gy組(2.900±0.372 vs 1.000±0.110,t=8.48,P=0.001)。而經(jīng)8 Gy輻照后,MCF-7細胞RP3-340B19.3的表達量(1.480±0.136)顯著高于0 Gy組(t=5.04,P=0.007),MDA-MB-231細胞RP3-340B19.3的表達量(2.620±0.176)亦高于0 Gy組(t=13.5,P=0.000 2)。

2.2siRNA對乳腺癌細胞RP3-340B19.3敲減效率驗證結(jié)果 qRT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染si-RP3后MCF-7細胞中RP3-340B19.3的相對表達量(0.236±0.154)顯著低于對照組(1.030±0.059),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.36,P=0.001)。在MDA-MD-231細胞中,轉(zhuǎn)染si-RP3組RP3-340B19.3的相對表達水平(0.363±0.037)顯著低于對照組(1.010±0.166),差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.28,P=0.003)。

2.3抑制RP3-340B19.3表達對乳腺癌細胞克隆形成能力及細胞存活分數(shù)的影響 轉(zhuǎn)染si-NC、si-RP3至MCF-7、MDA-MB-231細胞,以0、2、4、6、8 Gy不同劑量照射細胞后的克隆形成試驗結(jié)果顯示,在 MCF-7細胞中,與si-NC組比較,si-RP3組克隆形成率下降,細胞存活分數(shù)下降,細胞SER為1.240±0.119。在MDA-MB-231細胞中,與si-NC組比較,si-RP3組克隆形成率下降,細胞存活分數(shù)下降,細胞SER為1.210±0.059(圖1～3,表1～2)。

表1 不同劑量輻照后的細胞克隆形成率(PE)

表2 不同劑量輻照后的細胞存活分數(shù)(SF)

圖1 輻照后MCF-7細胞克隆形成

圖2 輻照后MDA-MB-231細胞克隆形成

注:A,MCF-7細胞擬合存活曲線;B,MDA-MB-231細胞擬合存活曲線。

2.4抑制RP3-340B19.3表達對乳腺癌細胞凋亡的影響 轉(zhuǎn)染si-NC、si-RP3至MCF-7、MDA-MB-231細胞后,通過流式細胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn),在MCF-7細胞中,與si-NC組比較,敲減RP3-340B19.3后細胞凋亡率(%)顯著增加(1.97±0.19 vs 3.42±0.28,P=0.000 8);與si-NC+6 Gy組比較,si-RP3+6 Gy組凋亡率(%)顯著增加(4.93±0.49 vs 7.02±0.33,P<0.000 1);si-RP3+6 Gy聯(lián)合組與si-RP3組相比,凋亡率顯著增加(P<0.000 1,圖4A)。MDA-MB-231細胞中,與si-NC組比較,si-RP3組細胞凋亡率(%)顯著增加(1.38±0.41 vs 5.57±0.52,P<0.000 1);與si-NC+6 Gy組比較,si-RP3+6 Gy組細胞凋亡率(%)顯著增加(6.89±0.30 vs 8.62±0.41,P<0.001);si-RP3+6 Gy聯(lián)合組與si-RP3組相比,細胞凋亡率顯著增加(P<0.000 1,圖4B)。

注:A,MCF-7 細胞凋亡率;B,MDA-MB-231細胞凋亡率

2.5抑制RP3-340B19.3表達對乳腺癌細胞周期的影響 流式細胞儀檢測結(jié)果表明,使用si-RP3轉(zhuǎn)染MCF-7細胞后,si-RP3組S期細胞百分比(%)顯著低于si-NC組(9.57±0.65 vs 13.30±0.72,P=0.000 4);si-RP3+6 Gy組S期細胞百分比(%)顯著低于si-NC+6 Gy組(3.34±1.10 vs 7.80±0.63,P<0.001)。si-RP3+6 Gy聯(lián)合組與si-RP3組相比,S期細胞比例顯著降低(P<0.000 1)。在MDA-MB-231細胞中,si-RP3組S期細胞百分比(%)顯著低于si-NC組(15.50±0.71 vs 20.60±0.66,P=0.000 3);si-RP3+6 Gy組S期細胞百分比(%)顯著低于si-NC+6 Gy組(8.56±1.15 vs 12.60±0.83,P<0.000 1)。而si-RP3+6 Gy聯(lián)合組與si-RP3組相比,S期細胞比例顯著降低(P<0.000 1)。

3 討論

研究表明,LncRNA與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、臨床治療和預(yù)后密切相關(guān),一些異常表達的LncRNA可促進腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移并產(chǎn)生治療抵抗性[5-6]。例如,LINC00504對乳腺癌細胞的生長起到了促進作用,并增加乳腺癌放療抵抗性[7]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)LncRNA TUG1對乳腺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移起到促進作用,敲減TUG1后可以提高乳腺癌細胞的放射敏感性[8]。以上結(jié)果均表明,LncRNA是參與乳腺癌惡性進展及調(diào)控乳腺癌放射治療的重要一環(huán)。目前關(guān)于LncRNA RP3-340B19.3的研究甚少,至今還未證實該分子在乳腺癌放療過程中的作用機制。在前期研究基礎(chǔ)上,筆者發(fā)現(xiàn)RP3-340B19.3在乳腺癌中呈高表達。為了探究RP3-340B19.3是否可以調(diào)控乳腺癌放療過程中的細胞生物學(xué)功能變化,本研究首先通過不同劑量的射線對MCF-7、MDA-MB-231細胞進行輻照,結(jié)果發(fā)現(xiàn)輻照后乳腺癌細胞中RP3-340B19.3的表達水平顯著升高。由此推測,放療后高表達的RP3-340B19.3可對乳腺癌細胞產(chǎn)生放療抵抗。結(jié)合細胞培養(yǎng)24 h后的細胞形態(tài),由于8 Gy照射的細胞狀態(tài)不佳,故選用6 Gy作為后續(xù)實驗劑量。

為了進一步探究RP3-340B19.3對乳腺癌細胞放療過程中生物學(xué)特性的影響。首先筆者通過克隆形成試驗發(fā)現(xiàn)敲減RP3-340B19.3表達后,乳腺癌細胞克隆形成率降低。進一步使用SigmaPlot軟件進行單擊多靶模型擬合分析生存曲線,結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲減RP3-340B19.3可提高細胞放射敏感性。當腫瘤細胞接受放療時,一些異常表達的分子可通過激活信號通路和靶向基因來誘導(dǎo)細胞進程的改變,如上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、凋亡、自噬、細胞周期、代謝等,從而調(diào)控放射治療反應(yīng)[9]。細胞周期失調(diào)與凋亡是放療抵抗的重要因素。筆者通過流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)敲減RP3-340B19.3可提高乳腺癌細胞凋亡率,并降低細胞S期比例。上述結(jié)果證實RP3-340B19.3通過調(diào)控細胞周期和凋亡促使乳腺癌放療抵抗。但本研究尚未證實RP3-340B19.3通過何種蛋白質(zhì)影響乳腺癌細胞周期與凋亡進程,以及是否可參與某種信號通路以誘導(dǎo)乳腺癌的凋亡。后續(xù)研究將進一步明確RP3-340B19.3參與細胞周期與凋亡調(diào)控的具體機制。

綜上所述,本研究通過構(gòu)建低表達RP3-340B19.3的乳腺癌細胞進行一系列生物學(xué)特性檢測,發(fā)現(xiàn)RP3-340B19.3參與了乳腺癌細胞惡性生物學(xué)行為,輻照后高表達的RP3-340B19.3對乳腺癌細胞產(chǎn)生放療抵抗性,敲減RP3-340B19.3可以促進乳腺癌細胞的凋亡,抑制乳腺癌細胞的增殖,增強放射敏感性。