張?chǎng)卫?毅

山西省運(yùn)城市中心醫(yī)院，山西 運(yùn)城 043100

小細(xì)胞肺癌（Small Cell Lung Cancer）是肺癌的一種特殊類型，在所有肺癌亞型中惡性程度最高，分化程度最低。在全球范圍內(nèi)，小細(xì)胞肺癌占所有肺癌的15%，是全球男性癌癥死亡的主要原因，也是女性癌癥死亡的第二大原因［1］。令人遺憾的是，超過一半的小細(xì)胞肺癌患者在最初診斷時(shí)即顯示出局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者確診后5年的生存率僅有7%［2］。引起小細(xì)胞肺癌的危險(xiǎn)因素主要是吸煙［3］，煙草致癌物誘導(dǎo)的小細(xì)胞肺癌有大量體細(xì)胞突變［4］。

由于小細(xì)胞肺癌對(duì)放化療高度敏感，常采用全身化療，并結(jié)合放療和手術(shù)治療。這種治療可以降低小細(xì)胞肺癌患者的局部復(fù)發(fā)率，約25%的患者能夠獲得長(zhǎng)期生存率和改善預(yù)后［4］。與非小細(xì)胞肺癌的治療方法相比，小細(xì)胞肺癌的治療選擇在過去的40年中并沒有明顯的改善，也沒有靶向治療被批準(zhǔn)。因此，闡明小細(xì)胞肺癌發(fā)病機(jī)制的進(jìn)展可能是小細(xì)胞肺癌治療方法發(fā)展的基礎(chǔ)。探討關(guān)鍵信號(hào)通路相關(guān)基因及其介導(dǎo)信號(hào)通路的發(fā)病機(jī)制是分析小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的重要過程，這可能有利于早期診斷及發(fā)現(xiàn)靶向治療的分子標(biāo)志物，也可能為治療提供分子基礎(chǔ)。

近年來，隨著高通量測(cè)序的發(fā)展，生物信息學(xué)分析在生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，已被廣泛用于預(yù)測(cè)各種疾病的發(fā)生機(jī)制及潛在治療靶點(diǎn)［5］。本研究借助基因表達(dá)綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)分析進(jìn)一步探究小細(xì)胞肺癌與正常組織之間的差異表達(dá)基因及相關(guān)的信號(hào)通路，蛋白互作（Protein-protein interaction，PPI）分析，以期從分子水平預(yù)測(cè)可能在小細(xì)胞肺癌疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用的相關(guān)基因，利用藥物數(shù)據(jù)庫篩選相關(guān)靶向藥物，為小細(xì)胞肺癌發(fā)作的預(yù)防及靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

進(jìn)入GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），在搜索欄輸入檢索詞“Small Cell Lung Cancer”，搜索后獲得符合研究需求的基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)集GSE149507，由Ling Cai 等［6］于2020 年12 月上傳至GEO 數(shù)據(jù)庫的公共芯片數(shù)據(jù)集。GSE149507 以GPL23270 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 為平臺(tái)，通過全轉(zhuǎn)錄本微陣列芯片Microarray 將收集的肺組織樣本進(jìn)行基因表達(dá)分析，其中包含18對(duì)小細(xì)胞肺癌及配對(duì)癌旁組織樣本。

1.2 原始數(shù)據(jù)的處理和差異基因的篩選

將原始數(shù)據(jù)分Normal 組和Tumor 組，使用GEO2R 在線工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。差異基因以校正P＜0.01，以｜log2FC｜＞3 為上、下調(diào)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)。使用ggplot2繪制差異表達(dá)基因的火山圖和熱圖。

1.3 差異表達(dá)基因的GO富集及KEGG信號(hào)通路富集分析

提取上述篩選的差異表達(dá)基因，運(yùn)用DAVID在線數(shù)據(jù)庫［7］（https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行背景為Homo sapiens的基因本體論（Geno ontology，GO）功能富集分析，其中包括生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）；KEGG（kyoto encyclopedia of genes andgenomes）信號(hào)通路富集分析篩選相關(guān)的生物學(xué)通路，調(diào)整后以P＜0.05 為閾值篩查差異基因的主要富集功能和通路。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和模塊分析

在STRING（version 11.0）數(shù)據(jù)庫［8］（https://string-db.org/）的檢索工具中上傳上述篩選的差異表達(dá)基因，設(shè)置綜合交互得分0.7 為顯著性閾值。下載PPI 數(shù)據(jù)，使用Cytoscape對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化和關(guān)聯(lián)性分析。采用MCODE插件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)中的子模塊進(jìn)行分析，篩選出關(guān)鍵的蛋白表達(dá)分子。

1.5 潛在藥物篩選

以“CDK1”為關(guān)鍵詞在Drugbank 數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.ca/） 和Herb 數(shù) 據(jù) 庫［9］（http://herb.ac.cn/）“Target name”項(xiàng)下，檢索與CDK1相互作用的小分子化合物、中藥及其單體化合物，作為小細(xì)胞肺癌的潛在治療化合物。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因

在GEO2R 平臺(tái)內(nèi)對(duì)小細(xì)胞肺癌組（n=18）及其癌旁對(duì)照組（n=18）基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，共獲得10 676個(gè)差異基因，火山圖如圖1所示。以｜log2FC｜＞3、P＜0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有基因進(jìn)行篩選，最終獲得153 個(gè)符合上述條件的基因，其中上調(diào)基因共104 個(gè)，下調(diào)基因共49個(gè)，見表1。排名前10的上調(diào)基因和下調(diào)基因，見圖2。

圖1 小細(xì)胞肺癌組與其癌旁對(duì)照組差異表達(dá)基因火山圖

圖2 差異表達(dá)最明顯的前20位基因

表1 小細(xì)胞肺癌組與其癌旁對(duì)照組之間的差異表達(dá)基因

2.2 差異表達(dá)基因的GO 富集分析和KEGG 信號(hào)通路富集分析

運(yùn)用DAVID在線數(shù)據(jù)庫對(duì)篩選得到的共同差異表達(dá)基因進(jìn)行背景為Homo sapiens 的GO 富集分析和KEGG 信號(hào)通路富集分析。結(jié)果顯示，差異基因富集到的BP 主要包括細(xì)胞分裂、有絲分裂姐妹染色單體分離和有絲核分裂等過程，見圖3。在CC 方面，差異基因主要富集在紡錘體、染色體著絲粒和中間體等區(qū)域，見圖4。而MF方面，則提示差異基因主要與微管結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合等生物大分子的結(jié)合相關(guān)，見圖5。在KEGG 信號(hào)通路富集分析中顯示，差異基因的KEGG 通路主要涉及細(xì)胞周期通路和P53 信號(hào)通路等，見圖6。

圖3 差異表達(dá)基因GO生物學(xué)過程分析

圖4 差異表達(dá)基因GO細(xì)胞組分分析

圖5 差異表達(dá)基因GO分子功能分析

圖6 差異表達(dá)基因KEGG信號(hào)通路富集分析

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵基因模塊

用STRING 對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。并將得到的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析與篩選。所得的PPI 網(wǎng)絡(luò)如圖7 所示。并利用Cytoscape 的MCODE 插件精確構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因模塊，結(jié)果顯示，共篩選出1 個(gè)關(guān)鍵基因模塊，見圖8。這表明了該模塊內(nèi)基因均與小細(xì)胞肺癌關(guān)系較為密切。進(jìn)一步采用CentiScaPe 插件在該模塊中篩選出與小細(xì)胞肺癌相關(guān)性最大的基因是CDK1。

圖7 差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

圖8 PPI網(wǎng)絡(luò)中最顯著的基因模塊

2.4 數(shù)據(jù)庫中作用于CDK1受體的潛在藥物

以CDK1 為靶點(diǎn)在數(shù)據(jù)庫中篩選潛在藥物。Herb 數(shù)據(jù)庫中一共有4個(gè)中藥及9個(gè)中藥單體作用于CDK1受體，包括草莓車軸草、大蒜和火炭母草等中藥，還有葫蘆素E、阿片堿和去氧地膽草素等中藥單體。DrugBank數(shù)據(jù)庫一共有9 個(gè)化學(xué)藥物作用于CDK1 受體，包括Alsterpaullone、Alvocidib、 Hymenialdisine、 Indirubin-3'-monoxime、 Olomoucine、SU9516、AT-7519、Seliciclib和Fostamatinib。

3 討論

本研究通過生物信息學(xué)分析，篩選出小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中表達(dá)顯著變化的153 個(gè)基因，對(duì)差異基因的GO 富集分析主要集中在細(xì)胞分裂、有絲分裂姐妹染色單體分離和有絲核分裂等過程，主要富集在紡錘體、染色體著絲粒和中間體等區(qū)域，提示差異基因主要與微管結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合等生物大分子的結(jié)合相關(guān)。本研究通過KEGG 信號(hào)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)與小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號(hào)通路：細(xì)胞周期和P53 信號(hào)通路。細(xì)胞周期失調(diào)是腫瘤的關(guān)鍵特征之一。研究表明，在沒有細(xì)胞周期阻滯時(shí)，DNA 損傷將無法修復(fù)，細(xì)胞將帶著受損的DNA 進(jìn)入有絲分裂，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。腫瘤細(xì)胞必須突破控制細(xì)胞分裂的細(xì)胞周期阻滯。細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因在多種人類腫瘤中均有高表達(dá)，表明細(xì)胞周期在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。腫瘤抑制基因P53 是正常細(xì)胞中關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，在G1 和G2/M 期觀察到P53在監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期中的調(diào)節(jié)作用。P53 基因在所有被發(fā)現(xiàn)的基因中與人類癌癥病例的相關(guān)性排名第一，研究［10-11］發(fā)現(xiàn)50%的惡性腫瘤顯示出P53 基因的突變，P53 異常表達(dá)可以導(dǎo)致腫瘤形成或細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而且是小細(xì)胞肺癌中最常見的基因突變。

研究通過STRING 進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，得到了最可能與小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因CDK1。該蛋白屬于Ser/Thr蛋白激酶家族的成員，在真核細(xì)胞周期控制中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［12］。CDK1 是多效性最強(qiáng)的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，CDK1 在整個(gè)細(xì)胞周期中與9 種不同的細(xì)胞周期蛋白相互作用。這些與細(xì)胞周期蛋白的相互作用對(duì)于激活其激酶活性，以及下游蛋白的招募和選擇都很重要［13］。因此，選擇性抑制CCNB1 或CDKs 可以限制細(xì)胞周期的進(jìn)展和/或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。已有多項(xiàng)研究表明，P53 的下游分子包括CDK1，通過腫瘤細(xì)胞中的p53/Bax凋亡通路，抑制CCNB1 或CDK1 的表達(dá)可抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4，14］。因此，CDK1可能是抗腫瘤治療的治療靶點(diǎn)。

近年來，相對(duì)于非小細(xì)胞肺癌靶向藥物發(fā)展迅速，小細(xì)胞肺癌靶向藥物研究進(jìn)展緩慢，難點(diǎn)在于尚未找到直接的治療靶點(diǎn)［15］。因此，研究小細(xì)胞肺癌的治療方案具有重要意義?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析為篩選和發(fā)現(xiàn)多靶點(diǎn)藥物提供了一種新的方法［16］。研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，可以抑制CDK1 表達(dá)的潛在藥物有：草莓車軸草、大蒜、火炭母草等中藥，葫蘆素E、阿片堿、去氧地膽草素等中藥單體，Alsterpaullone、Alvocidib、Hymenialdisine等化學(xué)藥物。有研究［17］報(bào)道，來源于火炭母草的酚類化合物抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)其凋亡。多篇研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可抑制肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、增殖及誘導(dǎo)其凋亡［18-19］。同時(shí)，有研究［20］發(fā)現(xiàn)葫蘆素E 通過靶向EGFR/MAPK信號(hào)通路對(duì)A549細(xì)胞具有抗增殖作用。在小鼠模型中，葫蘆素E 可抑制Yes 相關(guān)蛋白信號(hào)通路并抑制人類非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移［21］。

綜上所述，本研究通過對(duì)GEO 小細(xì)胞肺癌芯片數(shù)據(jù)GSE149507 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)P53 和細(xì)胞周期可能參與小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展過程，這可能有助于了解小細(xì)胞肺癌發(fā)生的潛在機(jī)制。構(gòu)建差異表達(dá)基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)，并鑒定了關(guān)鍵基因CDK1，并以此為靶點(diǎn)篩選治療小細(xì)胞肺癌的潛在藥物，為小細(xì)胞肺癌的治療提供新的思路。