羅儀山　陳璐珊　潘藝朝　李韶南　劉震　陳平安

【摘要】? 目的? ? 探討腎交感神經(jīng)消融術(shù)（RDN）后不同時(shí)間腎動(dòng)脈降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）的表達(dá)情況。方法? ? 采用腹主動(dòng)脈結(jié)扎方法制備犬慢性心力衰竭模型，并行RDN。觀察RDN術(shù)后不同時(shí)間心力衰竭犬血漿及腎動(dòng)脈CGRP的表達(dá)情況。結(jié)果? ? 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（QT-PCR）顯示，與心力衰竭組（HF組）相比，RDN術(shù)后3.5個(gè)月CGRP表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），RDN術(shù)后9個(gè)月CGRP表達(dá)量高于術(shù)后3.5個(gè)月但低于心力衰竭（HF）組（P<0.05）。免疫組織化學(xué)染色顯示RDN術(shù)后3.5個(gè)月組光密度值低于HF組和RDN術(shù)后9個(gè)月（P<0.05）。結(jié)論? ? RDN術(shù)后隨著時(shí)間的推移腎動(dòng)脈中存在CGRP表達(dá)水平上調(diào)，腎交感神經(jīng)可能存在一定程度恢復(fù)。

【關(guān)鍵詞】? 心力衰竭； 動(dòng)物模型； 犬； 交感神經(jīng)消融術(shù)； 降鈣素基因相關(guān)肽

Variation of calcitonin gene related peptide in dogs with heart failure after renal devervationLuo Yishan，Chen Lushan，Pan Yichao，Li Shaonan，Liu Zhen，Chen Ping'an*. The First People's Hospital of Guangzhou， Guangzhou，Guangdong? ? 510180

【Abstract】? Objective? To investigate the expression of calcitonin gene related peptide in the different periods after renal devervation in dogs with heart failure. Methods? ? After induced by abdominal aortaconstriction，the dogs were divided into three groups according to whether they underwent renal devervation or the period after renal devervation. Relativegene or protein expression of calcitonin gene related peptide（CGRP）in the renal artery tissues was analyzed by quantitative real time polymerase chain reaction or Western-blot respectively. Plasma levels of CGRP were also detected. Results? ? Compared with the heart failure group， the expression of CGRP in the RDN 1 group（3.5 months after RDN）was significantly decreased（P<0.05）. The expression of CGRP in the RDN 2 group（9 months after RDN）was higher than that in the RDN 1 group， but still lower than in the heart failure group（P<0.05）.Semi-quantitative analysis of immunohistochemistry staining， indicated asthe values of the average optical density（AOD）measured by Image Pro Plus 6.0， showed that values of AOD was lower in the RDN 1 group than in the RDN 2 and heart failure groups（P<0.05）. Conclusion? ? The expression of CGRP in the renal artery increased with the extent of time after RDN.

【Key Words】? Heart failure； Animal model； Dogs； RDN； Calcitonin gene related peptide

中圖分類(lèi)號(hào)：R544.1? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1672-1721（2023）25-0008-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.25.003

腎交感神經(jīng)消融術(shù)（renal devervation，RDN）通過(guò)阻斷腎動(dòng)脈周?chē)桓猩窠?jīng)可起到降低全身交感神經(jīng)活性的作用。有研究顯示，RDN對(duì)難治性高血壓、心力衰竭等交感神經(jīng)活性增加性疾病具有一定的療效[1-3]。然而也有研究顯示RDN的降壓療效不確切[4]，推測(cè)可能與術(shù)者經(jīng)驗(yàn)，術(shù)中消融次數(shù)、部位及其釋放的能量，特定的亞組人群不同等諸多因素有關(guān)。資料顯示腎交感神經(jīng)損傷后可能存在再生[5]，若RDN后存在腎交感神經(jīng)再生，勢(shì)必會(huì)影響到RDN的療效。本研究從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的角度探討RDN后不同時(shí)間腎動(dòng)脈降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）的表達(dá)情況，通過(guò)神經(jīng)相關(guān)肽的變化了解RDN術(shù)后腎動(dòng)脈神經(jīng)的變化。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組? ? 成年健康雜種雄性犬（普通級(jí)）14只，體質(zhì)量12.42～13.01 kg，平均體質(zhì)量（12.57±1.70）kg，購(gòu)自廣州龍歸興科動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。采用腹主動(dòng)脈結(jié)扎方法建立犬慢性心力衰竭（HF）模型后（造模術(shù)中及術(shù)后共死亡2只）行RDN（術(shù)中及術(shù)后共死亡3只）。術(shù)后分為3組：HF組3只，RDN 1組3只（RDN術(shù)后3.5個(gè)月），RDN 2組3只（RDN術(shù)后9個(gè)月）。

1.2? ? 動(dòng)物心力衰竭模型的制備? ? 采用腹主動(dòng)脈結(jié)扎方法制備犬慢性心力衰竭模型。3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉成功后在雙腎動(dòng)脈分叉處上段游離腹主動(dòng)脈，用軟管環(huán)繞此處腹主動(dòng)脈一周測(cè)出血管周徑，用手術(shù)縫合線雙線結(jié)扎腹主動(dòng)脈，使其周徑減少約50%，結(jié)扎后手指尖觸及結(jié)扎處下方腹主動(dòng)脈壁有血流增速感和沖擊感。術(shù)后標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)[6]。

1.3? ? RDN? ? 經(jīng)犬股動(dòng)脈插入8F指引導(dǎo)管行腎

動(dòng)脈造影明確腎動(dòng)脈位置后經(jīng)股動(dòng)脈植入消融導(dǎo)管（Biosense Webster Ltd，Israel），腹部放置消融電極片并連接射頻消融儀（SmartAblate，Germany），消融溫度為45 ℃，功率為4 W。分別對(duì)左右兩側(cè)腎動(dòng)脈采用螺旋式消融6個(gè)不同位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)持續(xù)1～2 min。HF組行股動(dòng)脈穿刺并送入造影導(dǎo)管行雙側(cè)腎動(dòng)脈造影后再送入消融導(dǎo)管，不行腎動(dòng)脈消融術(shù)[6]。

1.4? ? 蛋白質(zhì)印跡法（Western-blot）法測(cè)定腎動(dòng)脈中CGRP蛋白表達(dá)? ? 將腎動(dòng)脈組織裂解后測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，先后加入第一抗體（上海江萊生物）、第二抗體孵育，化學(xué)發(fā)光法顯色，采用β-actin作為內(nèi)參，Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.5? ? 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polywerase chain reaction，QT-PCR）檢測(cè)腎動(dòng)脈CGRP的表達(dá)? ? 采用Trizol試劑提純腎動(dòng)脈組織總RNA，并檢測(cè)RNA含量和純度，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complernentary DNA，cDNA）。按文獻(xiàn)方法設(shè)計(jì)CGRP引物序列，CGRP的信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）相對(duì)表達(dá)的定量結(jié)果依據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.6? ? 免疫組織化學(xué)染色? ? 取1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm新鮮腎動(dòng)脈組織塊放入10%甲醛溶液中固定，制成石蠟切片，進(jìn)行CGRP免疫組織化學(xué)染色。

1.7? ? 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immuno- sorbent assay，ELISA）血漿CGRP含量? ? 取標(biāo)本前采取3組動(dòng)物股靜脈血液2 mL，3 000 r/min離心10 min后分離出血漿-80 ℃低溫保存，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)采用ELISA法檢測(cè)血漿CGRP含量（上海江萊生物）。

1.8? ? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? ? 使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? ? 結(jié)果

2.1? ? 一般情況及RDN? ? 腹主動(dòng)脈結(jié)扎后，犬出現(xiàn)不同程度倦怠、消瘦等情況。后進(jìn)行RDN，RDN術(shù)中及術(shù)后共死亡3只HF模型犬，可能與消融溫度過(guò)高或消融時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有關(guān)。造影導(dǎo)管行犬腎動(dòng)脈造影如圖1所示，消融導(dǎo)管行犬RDN術(shù)如圖2所示。

2.2? ? Western-blot法測(cè)定腎動(dòng)脈中CGRP蛋白表達(dá)水平? ? RDN 2組CGRP蛋白表達(dá)較RDN 1組增高，見(jiàn)圖3。

2.3? ? QT-PCR檢測(cè)腎動(dòng)脈CGRP-mRNA表達(dá)? ? 與HF組相比，RDN 1組、RDN 2組的CGRP-mRNA表達(dá)水平均明顯降低（P<0.05），但RDN 2組表達(dá)水平高于RDN 1組（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.4? ? CGRP陽(yáng)性染色細(xì)胞吸光度（A）值比較? ? 將3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腎動(dòng)脈標(biāo)本制成石蠟切片后行免疫組織化學(xué)，利用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算陽(yáng)性染色細(xì)胞的A值并作單因素分析。HF組、RDN 2組的A值均大于RDN 1組（P<0.05），但HF組和RDN 2組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

2.5? ? ELISA檢測(cè)血漿CGRP含量? ? 3組中HF組血漿CGRP含量最高，RDN 1組其次，RDN 2組血漿CGRP含量最低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3。

3? ? 討論

交感神經(jīng)在心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。腎交感神經(jīng)的激活對(duì)心力衰竭可產(chǎn)生不利影響[7]，因此，采用RDN降低腎臟交感神經(jīng)活性，對(duì)慢性心力衰竭、高血壓等交感神經(jīng)活性增加性疾病有利。

RDN主要通過(guò)降低腎交感神經(jīng)活性起到影響全身交感神經(jīng)活性的作用，故RDN后腎交感神經(jīng)乃至全身交感神經(jīng)活性降低程度是影響RDN療效的重要因素。然而有資料顯示腎交感神經(jīng)損傷后可能存在再生，MULDER J等[5]研究表明采用外科手術(shù)切除腎交感神經(jīng)后12周，能觀察到腎交感神經(jīng)的再生。GAZDAR A F等[8]在腎移植患者的腎組織中也觀察到神經(jīng)再生，BOOTH L C等[9]對(duì)羊行RDN，術(shù)后也觀察到羊腎動(dòng)脈出現(xiàn)了交感神經(jīng)再支配現(xiàn)象。RDN后腎交感神經(jīng)的再生勢(shì)必會(huì)影響到RDN的去神經(jīng)療效。

相對(duì)于外科手術(shù)切除腎交感神經(jīng)，RDN只是對(duì)局部腎交感神經(jīng)起損傷作用，目前尚不知心力衰竭時(shí)RDN術(shù)后是否存在腎交感神經(jīng)再生現(xiàn)象。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法觀察了RDN術(shù)后不同時(shí)間反映神經(jīng)分布情況或再生的相關(guān)肽類(lèi)CGRP的表達(dá)量的變化情況，QT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示，RDN 2組腎動(dòng)脈CGRP的表達(dá)量比RDN 1組增加；免疫組化結(jié)果也顯示RDN 2組CGRP陽(yáng)性染色細(xì)胞A值高于RDN 1組，低于HF組（P<0.05）。這表明隨著RDN時(shí)間的延長(zhǎng)反映神經(jīng)再生的CGRP表達(dá)出現(xiàn)增加，提示RDN后隨著時(shí)間的推移腎交感神經(jīng)可能存在再生。CGRP是一種廣泛分布于神經(jīng)組織的肽類(lèi)，具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，CGRP水平高低可間接反映神經(jīng)的生長(zhǎng)情況。有研究顯示CGRP能夠作用于雪旺細(xì)胞促進(jìn)周?chē)窠?jīng)再生[10]。故心力衰竭時(shí)RDN術(shù)后CGRP表達(dá)增加可能有利于腎動(dòng)脈周?chē)窠?jīng)的再生。本研究中RDN 2組血漿CGRP含量低于RDN1組，與Western-blot、適時(shí)定量PCR及病理結(jié)果有一定差異，這可能與血漿CGRP含量影響因素較多，一些心腦血管疾病對(duì)血漿CGRP含量有影響有關(guān)[11-12]，也可能與本研究樣本量小有關(guān)，需大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，對(duì)心力衰竭犬行RDN術(shù)后隨著時(shí)間的推移腎動(dòng)脈中反應(yīng)神經(jīng)再生的相關(guān)肽類(lèi)物質(zhì)CGRP表達(dá)水平出現(xiàn)上調(diào)，提示RDN術(shù)后可能存在腎交感神經(jīng)數(shù)量的部分恢復(fù)并影響其療效，這為今后優(yōu)化RDN的心力衰竭療效提供了相關(guān)實(shí)驗(yàn)資料。

參考文獻(xiàn)

[1] KANDZARI D E，KARIO K，MAHFOUD F，et al.The SPYRAL HTN global clinical trial program：rationale and design for studies of renal denervation in the absence（SPYRAL HTN OFF-MED）and presence（SPYRAL HTN ON-MED）of antihy-pertensive medications[J].Am Heart J，2016，171（1）：82-91.

[2] DAVIES J E，MANISTY C H，PETRACO R，et al.First-in-man safty evaluation of renal devervation for chronic systolic heart failure：primary outcome from REACH-Pilot study[J].Int J Car-diol，2013，162（3）：189-192.

[3] CHEN P，LENG S，LUO Y，et al.Efficacy and safety of renal sympathetic denervation on dogs with pressure overload-induced heart failure[J].Heart Lung Circ，2017，26（2）：194-200.

[4] BHATT D L，KANDZARI D E，O'NEILL W W，et al.A controlled trial of renal denervation for resistant hypertension[J].N Engl J Med，2014，370（15）：1393-1401.

[5] MULDER J，H？魻KFELT T，KNUEPFER M M，et al.Renal sensory and sympathetic nerves reinnervate the kidney in a similar time-dependent fashion after renal denervation in rats[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2013，304（8）：R675-682.

[6] 陳平安，陳璐珊，羅儀山，等.經(jīng)皮腎交感神經(jīng)射頻消融術(shù)對(duì)慢性心力衰竭犬腎胺酶活性的影響[J].中國(guó)醫(yī)師雜志，2017，19（7）：1007-1009，1013.

[7] PINKHAM M I，WHALLEY G A，GUILD S J，et al.Arterial baroreceptor reflex control of renal sympathetic nerve activity following chronic myocardial infarction in male，female，and ovariectomized female rats[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2015，309（2）：R169-178.

[8] GAZDAR A F，DAMMIN G J.Neural degeneration and regeneration in human renal transplants[J].N Engl J Med，1970，283（5）：222-224.

[9] BOOTH L C，NISHI E E，YAO S T，et al.Reinnervation of renal afferent and efferent nerves at 5.5 and 11 months after catheter-based radiofrequency renal denervation in sheep[J].Hypertension，2015，65（2）：393-400.

[10] TOTH C C，WILLIS D，TWISS J L，et al.Locally synthesized calcitonin gene-related peptide has a critical role in peripheral nerve regeneration[J].J Neuropathol Exp Neurol，2009，68（3）：326-337.

[11] GHADHANFAR E，AL-BADER M，TURCANI M.Wistar rats resistant to the hypertensive effects of ouabain exhibit enhanced cardiac vagal activity and elevated plasma levels of calcitonin gene-related peptide[J].PLoS One，2014，9（10）：e108909.

[12] KEE Z，KODJI X，BRAIN S D.The role of calcitonin gene related peptide（CGRP）in neurogenic vasodilation and its cardioprotective effects[J].Front Physiol，2018，9：1249.

（收稿日期：2023-06-07）