劉小金,劉日群,鄭 琴,楊 明,胡鵬翼,李字棋,肖淑華

江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南昌 330004

現(xiàn)代社會(huì),繁重的工作和生活壓力致使人們白天犯困、易疲勞的現(xiàn)象越發(fā)嚴(yán)重,警覺(jué)度和認(rèn)知功能下降是該癥狀的主要表現(xiàn),短期服用興奮劑類藥物如咖啡因、莫達(dá)非尼等可緩解疲勞困倦,提高警覺(jué)性[1]。但長(zhǎng)期攝入咖啡因會(huì)引起抑郁、易怒、心律失常、焦慮、失眠等不良癥狀;此外,咖啡因的利尿作用也可導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)間脫水,體溫調(diào)節(jié)能力下降[2]、心率加快和心臟負(fù)擔(dān)[3];而莫達(dá)非尼會(huì)引起頭痛、惡心和血壓升高等不良反應(yīng),也有潛在的成癮性與依賴性[4]。因此研究開(kāi)發(fā)效果好、不良反應(yīng)少的提神醒腦產(chǎn)品顯得尤為迫切。

芳香療法作為近年來(lái)興起的一種補(bǔ)充替代療法,是一種回歸自然類似于整體治療的方法。芳香療法中所用的芳香物質(zhì)或精油已有研究報(bào)道具有提神醒腦效果,如迷迭香精油、蘇合香精油、薄荷精油、石菖蒲精油、冰片和檸檬精油等[5]。本文基于芳香療法理論為指導(dǎo),選擇芳香開(kāi)竅的薄荷醇、丁香精油、青檸檬精油等植物精油進(jìn)行組方,經(jīng)鼻吸入研究自制復(fù)方精油對(duì)小鼠自主活動(dòng)及睡眠的影響,評(píng)價(jià)其提神醒腦的藥效。采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)、Western blot技術(shù)檢測(cè)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸、多巴胺及其受體研究作用機(jī)制,并采用GC-MS分析復(fù)方精油化學(xué)成分,以期分析精油中可能產(chǎn)生興奮作用的成分。另一方面,精油雖然具有較好的療效,但有臨床研究報(bào)道精油可能會(huì)引起不良反應(yīng)[6],為確保臨床用藥安全,本文還研究自制復(fù)方精油經(jīng)鼻吸入對(duì)小鼠進(jìn)行初步安全性研究,以期為其安全使用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

昆明小鼠(KM,SPF),雄性,體重為20±2 g,購(gòu)買于江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物科技中心,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(贛)2022-0002,本實(shí)驗(yàn)經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),審批號(hào):JZLLSC20210043。動(dòng)物飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物科技中心屏障級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi),晝夜12 h交替,恒溫(22±2)℃,相對(duì)濕度40%～70%,動(dòng)物統(tǒng)一適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥品及試劑

復(fù)方精油,江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供,批號(hào)20220322,主要成分為薄荷醇、丁香精油、青檸檬精油等;咖啡因(批號(hào)PS11544,北京譜析科技有限公司);酒精消毒劑(南昌利康制藥機(jī)械有限公司);PBS緩沖液(Solarbio);多巴胺酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(批號(hào)H170-1-2,Andygene);谷氨酸酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(批號(hào)H168-1-2,Andygene);多巴胺受體D1R抗體(批號(hào)ab279713,Abcam)。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)方精油對(duì)小鼠提神醒腦的作用研究

1.3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥

40只昆明雄性小鼠,隨機(jī)分成5組,每組8只。實(shí)驗(yàn)由對(duì)照組、咖啡因組和復(fù)方精油低(2×10-7mL/cm3)、中(5×10-7mL/cm3)、高劑量(8×10-7mL/cm3)組,為增加精油霧化效率,采用蒸餾水對(duì)復(fù)方精油進(jìn)行適當(dāng)稀釋。對(duì)照組每天霧化吸入等量蒸餾水,陽(yáng)性藥組灌胃咖啡因57 mg/kg,前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,復(fù)方精油霧化吸嗅給藥15 min后能顯著提高小鼠自主活動(dòng)能力,本研究選擇復(fù)方精油霧化吸入15 min,實(shí)驗(yàn)時(shí)間每日8∶00～16∶00,1次/d。精油給藥劑量=霧化器復(fù)方精油加入體積(mL)/動(dòng)物香薰室空間體積(cm3)。

1.3.1.2 復(fù)方精油對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響

連續(xù)給藥3 d,每天各給藥組霧化吸入15 min,休息15 min后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。有研究表明,小鼠灌胃咖啡因后,在30～60 min 能達(dá)到最高血藥濃度,小鼠灌胃咖啡因30 min 后活動(dòng)能力顯著增強(qiáng)[7],選擇咖啡因組灌胃30 min后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。小鼠適應(yīng)環(huán)境3 min,檢測(cè)5 min內(nèi)行為學(xué)參數(shù):運(yùn)動(dòng)距離(cm)、平均速度(cm/s)、休息時(shí)間占比(%)。

1.3.1.3 戊巴比妥鈉閾上睡眠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

另取30只昆明雄性小鼠,隨機(jī)分成5組,每組6只。對(duì)照組和復(fù)方精油低、中、高劑量組小鼠均在實(shí)驗(yàn)第一天末次霧化吸入15 min,休息15 min,陽(yáng)性藥組灌胃咖啡因30 min后,均進(jìn)行腹腔注射戊巴比妥鈉閾上值55 mg/kg[8]。觀察并記錄各組小鼠的睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間,注射給藥后,小鼠的翻正反射消失1 min,為入睡指標(biāo)。從注射藥物到翻正反射消失的時(shí)間為睡眠潛伏期,翻正反射消失至恢復(fù)的時(shí)間為睡眠持續(xù)時(shí)間,記錄睡眠時(shí)間的潛伏期和睡眠時(shí)間。

1.3.2 復(fù)方精油對(duì)小鼠腦和血清GLU、DA含量的影響

吸嗅3 d,曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,各組小鼠摘眼球取血,后頸椎脫位處死,取出完整腦組織,PBS緩沖液清洗,濾紙吸干。血液室溫靜置1 h,3 500 r/min離心15 min,取上清液血清、腦組織暫存于-80 ℃。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作檢測(cè)小鼠腦組織和血清中谷氨酸(glutamic acid,GLU)和多巴胺(dopamine,DA)含量。

1.3.3 復(fù)方精油對(duì)小鼠腦內(nèi)DA受體D1R的影響

另取一批昆明小鼠按“1.3.1.2”方法重復(fù)實(shí)驗(yàn),吸嗅給藥第3 d結(jié)束后,各組小鼠迅速頸椎脫位處死,取出全腦組織,用PBS緩沖液洗去血漬,在冰面上分離前額皮層、海馬、下丘腦和其他腦組織,EP管分裝存于-80 ℃用于Western blot分析。將冷凍組織(20 mg)在20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4、0.9% NaCl、0.5% Nonidet P40、1 mmol/L EDTA、129 mmol/L乙二醇四乙酸(EDTA)、1 mmol/L苯基甲基磺酰氟、1 000 KIU/mL 抑肽酶和10 μg/mL亮肽)中勻漿,并在冰上孵育15 min。在12 000 r/min和4 ℃下離心10 min后,使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑測(cè)量上清液的蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離上清液,然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,加入一抗(D1R 1∶1 000),然后將膜與辣根過(guò)氧化物酶綴合的次級(jí)抗體(1∶2 000)孵育。轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)底物溶液孵育,并用圖像J程序(Bio-Rad,Richmond,CA,USA)可視化。通過(guò)使用Quantity One軟件(BioRad Laboratories)對(duì)相對(duì)水平進(jìn)行密度量化,并根據(jù)GAPDH的條參考帶進(jìn)行計(jì)算。

1.3.4 復(fù)方精油GC-MS的化學(xué)成分分析

氣相色譜條件:采用Agilent DB-624(30 m×320 μm×1.8 μm)毛細(xì)管柱,載氣為高純度He(99.999%),進(jìn)樣量l μL,分流比50∶1,流速1 mL/min;程序升溫:初始溫度45 ℃(保持0 min),以3 ℃/min升溫至70 ℃,保持3 min;再以1.5 ℃/min升溫至90 ℃,保持3 min;再以1.5 ℃/min升溫至140 ℃,保持3 min;再以1.5 ℃/min升溫至180 ℃,保持3 min;再以5 ℃/min升溫至180 ℃,保持3 min;再以3 ℃/ min升溫至220 ℃,保持5 min;再以5 ℃/min升溫至280 ℃,保持5 min,進(jìn)樣口溫度280 ℃,接口溫度為250 ℃。

質(zhì)譜條件:EI離子源,電子能量70 eV,離子源溫度230 ℃,MS四極桿溫度150 ℃;界面溫度250 ℃,溶劑延遲3.0 min,質(zhì)譜掃描模式全掃描,掃描范圍(m/z)30～650。標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)NIST11檢索,采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分含量的相對(duì)百分比。

1.3.5 單次吸嗅復(fù)方精油對(duì)昆明小鼠安全性研究

因受試藥物濃度、體積和霧化效率的限制,無(wú)法測(cè)定受試藥物的半數(shù)致死量,提示其安全性較高,為進(jìn)一步評(píng)價(jià)其安全性,進(jìn)行最大給藥量試驗(yàn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)復(fù)方精油濃度達(dá)到2.07×10-4mL/cm3時(shí),老鼠毛發(fā)濕潤(rùn)較嚴(yán)重,且該濃度下部分老鼠存在呼吸不適,可能是霧氣濃度過(guò)高影響老鼠正常呼吸,即以復(fù)方精油濃度2.07×10-4mL/cm3為最大給藥濃度劑量。

昆明小鼠雌雄各半,根據(jù)體重隨機(jī)分成為雄鼠對(duì)照組(control of male mice,Con-M)、雌鼠對(duì)照組(control of female mice,Con-F)、雄鼠復(fù)方精油劑量1組(compound essential oil dose 1 of male mice,Dose 1-M)、雌鼠復(fù)方精油劑量1組(compound essential oil dose 1 of female mice,Dose 1-F)、雄鼠復(fù)方精油劑量2組(compound essential oil dose 2 of male mice,Dose 2-M)、雌鼠復(fù)方精油劑量2組(compound essential oil dose 2 of female mice,Dose 1-F),每組8只。復(fù)方精油劑量1和劑量2的濃度為1.48×10-4、2.07×10-4mL/cm3,分別為復(fù)方精油有效劑量(5×10-7mL/cm3)的296倍和414倍。對(duì)照組吸嗅等量蒸餾水,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始1 d,單次吸嗅15 min(30 cm×30 cm×30 cm箱體),為確保規(guī)定時(shí)間內(nèi)精油完全霧化,采用多個(gè)霧化器同時(shí)霧化。

給藥當(dāng)天仔細(xì)觀察并記錄動(dòng)物的中毒表現(xiàn),癥狀出現(xiàn)和消失的時(shí)間及死亡時(shí)間。給藥當(dāng)日連續(xù)觀察,其后每日1次,連續(xù)觀察14 d。觀察期間記錄小鼠的體重變化、外觀征、行為活動(dòng)、呼吸,飲食,排泄物等及其他中毒表現(xiàn),若有動(dòng)物死亡,進(jìn)行肉眼觀察和尸檢,必要時(shí)病理學(xué)檢查。觀察期結(jié)束第14 d,對(duì)各組小鼠眼眶取血并進(jìn)行血常規(guī)分析和谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酐和尿素氮含量檢測(cè),取各組小鼠腦、肺、鼻黏膜、肝、腎進(jìn)行組織病理學(xué)切片分析。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方精油吸嗅對(duì)小鼠自主活動(dòng)能力的影響

如圖1所示,給藥1 d,與對(duì)照組比較,陽(yáng)性藥組(咖啡因)和復(fù)方精油組(低、中、高劑量組)小鼠的運(yùn)動(dòng)總距離均顯著增加(P<0.01,P<0.01),平均速度均顯著提高(P<0.01),休息時(shí)間顯著縮短(P<0.01),表明不同劑量復(fù)方精油可以顯著提高昆明小鼠的自主活動(dòng)能力,具有振奮精神的作用。給藥2 d,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與給藥1 d基本一致。給藥3 d,與對(duì)照組比較,陽(yáng)性藥組小鼠的運(yùn)動(dòng)總距離、平均速度和休息時(shí)間均無(wú)顯著性差異(P>0.05),復(fù)方精油組(低、中、高劑量組)運(yùn)動(dòng)距離均顯著增加(P<0.01),平均速度顯著提高(P<0.01),休息時(shí)間顯著縮短(P<0.01)。

圖1 復(fù)方精油對(duì)昆明小鼠自主活動(dòng)能力的影響Fig.1 Effect of compound essential oils on autonomic activity of Kunming mice 注:a:對(duì)照組,b:陽(yáng)性藥組,c:復(fù)方精油低劑量組,d:復(fù)方精油中劑量組,e:復(fù)方精油高劑量組。與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01,下同。Note:a:Control group,b:Positive drug group,c:Compound essential oil low dose group,d:Compound essential oil medium dose group,e:Compound essential oil high dose group.Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01,the same below.

2.2 戊巴比妥鈉閾上睡眠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖2所示,與對(duì)照組比較,陽(yáng)性藥組(咖啡因)和復(fù)方精油組(低、中、高劑量組)對(duì)小鼠的睡眠潛伏期無(wú)顯著性差異(P>0.05,P>0.05);陽(yáng)性藥組(咖啡因)和復(fù)方精油組(低、中、高劑量組)均能顯著縮短小鼠睡眠時(shí)間(P<0.05,P<0.01),說(shuō)明復(fù)方精油吸嗅具有良好的促醒作用。

圖2 戊巴比妥鈉睡眠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of sleep induction experiment with pentobarbital

2.3 復(fù)方精油對(duì)小鼠腦內(nèi)和血清GLU、DA含量的影響

如圖3所示,與對(duì)照組相比,復(fù)方精油組(低、中、高劑量組)顯著增加腦內(nèi)多巴胺水平(P<0.05),咖啡因?qū)δX內(nèi)多巴胺水平?jīng)]有顯著影響(P>0.05),陽(yáng)性藥組(咖啡因)和復(fù)方精油組(低、中、高劑量)均顯著提高腦內(nèi)谷氨酸水平(P<0.05,P<0.05),復(fù)方精油組(低、中、高劑量組)顯著增加血清多巴胺水平(P<0.05),咖啡因?qū)ρ宥喟桶匪骄哂猩仙厔?shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),陽(yáng)性藥組(咖啡因)和復(fù)方精油組(中、高劑量)均顯著提高血清谷氨酸水平(P<0.05,P<0.05)。DA和GLU含量的增加可能是復(fù)方精油吸嗅促進(jìn)小鼠自主活動(dòng)能力、提神醒腦的重要作用機(jī)制。

圖3 復(fù)方精油對(duì)昆明小鼠血、腦組織GLU、DA的影響Fig.3 Effect of compound essential oil on GLU and DA in blood and brain of Kunming

2.4 復(fù)方精油對(duì)昆明小鼠不同腦區(qū)多巴胺受體D1R表達(dá)的影響

如圖4所示,與對(duì)照組比較,復(fù)方精油組(低、中、高劑量組)顯著提高昆明小鼠不同腦區(qū)(海馬、下丘腦、前額皮層和其他腦組織)的D1R表達(dá)(P<0.05),陽(yáng)性藥組(咖啡因)對(duì)海馬、下丘腦組織中的D1R表達(dá)無(wú)顯著影響,陽(yáng)性藥組(咖啡因)顯著提高前額皮層和其他腦組織的D1R表達(dá)(P<0.05)。

圖4 復(fù)方精油對(duì)昆明小鼠不同腦區(qū)多巴胺受體D1R表達(dá)的影響Fig.4 Effect of compound essential oil on the expression of dopamine receptor D1R in different brain regions of Kunming

2.5 復(fù)方精油GC-MS成分分析

GC-MS分析的復(fù)方精油主要化學(xué)成分及相對(duì)百分比見(jiàn)表1,總離子流圖見(jiàn)圖5。共鑒定并核實(shí)31種化學(xué)成分,占揮發(fā)油總成分的84.41%,其中含量最高的為L(zhǎng)-薄荷醇(24.54%),其次為丁香酚(16.25%)、L-薄荷酮(7.78%)、冰片(7.30%)、1-石竹烯(5.29%)、1,8-桉葉素(3.40%)等。

圖5 復(fù)方精油總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of compound essential oil

2.6 復(fù)方精油高濃度單次吸嗅對(duì)小鼠安全性研究

2.6.1 復(fù)方精油高濃度單次吸嗅小鼠外觀表征

實(shí)驗(yàn)觀察,在高濃度吸嗅過(guò)程中,復(fù)方精油劑量1組和復(fù)方精油劑量2組小鼠均存在跳躍行為,吸嗅5 min左右最為明顯。吸嗅15 min后,對(duì)照組、復(fù)方精油劑量1組和復(fù)方精油劑量2組小鼠除毛發(fā)較為濕潤(rùn)外,無(wú)其他明顯異常表現(xiàn),呼吸和運(yùn)動(dòng)正常。

2.6.2 復(fù)方精油高濃度單次吸嗅對(duì)小鼠體重的影響

結(jié)果見(jiàn)表2,與對(duì)照組比較,復(fù)方精油高濃度單次吸嗅,觀察期14 d內(nèi),復(fù)方精油不同劑量給藥組小鼠體重?zé)o顯著性差異。

表2 復(fù)方精油高濃度單次吸嗅對(duì)小鼠體重的影響

2.6.3 復(fù)方精油高濃度單次吸嗅對(duì)小鼠血細(xì)胞的影響

結(jié)果見(jiàn)表3,與對(duì)照組比較,復(fù)方精油高濃度單次吸嗅,復(fù)方精油不同劑量給藥組對(duì)小鼠血細(xì)胞無(wú)顯著性差異。

表3 復(fù)方精油高濃度單次吸嗅對(duì)小鼠血細(xì)胞的影響

2.6.4 復(fù)方精油高濃度單次吸嗅對(duì)小鼠肝腎功能的影響

結(jié)果見(jiàn)表4,與對(duì)照組比較,復(fù)方精油高濃度單次吸嗅,不同給藥小鼠組谷草轉(zhuǎn)氨酶、胱抑素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酐和尿素氮無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 復(fù)方精油高濃度單次吸嗅對(duì)小鼠肝腎功能的影響

2.6.5 復(fù)方精油高濃度單次吸嗅對(duì)小鼠腦、鼻黏膜、肺、肝、腎的影響

結(jié)果見(jiàn)圖6～10,與對(duì)照組正常小鼠比較,復(fù)方精油劑量1和復(fù)方精油劑量2對(duì)雄性或雌性小鼠的腦、鼻黏膜、肺、肝、腎等組織無(wú)明顯病理性損傷,各組織細(xì)胞核明顯,未見(jiàn)炎性浸潤(rùn)、細(xì)胞破裂等細(xì)胞組織損傷。

圖6 腦組織HE染色病理切片(×200)Fig.6 HE stained pathological section of brain tissue (×200)注:A:Con-M;B:Dose 1-M;C:Dose 2-M;D:Con-F;E:Dose 1-F;F:Dose 2-F,下同。Note:A:Con-M;B:Dose 1-M;C:Dose 2-M;D:Con-F;E:Dose 1-F;F:Dose 2-F,the same below.

圖7 鼻黏膜HE染色病理切片(×200)Fig.7 HE staining pathological section of nasal mucosa (×200)

圖8 肺HE染色病理切片(×200)Fig.8 HE staining pathological section of lung (×200)

圖9 肝HE染色病理切片(×200)Fig.9 HE stained pathological section of liver (×200)

圖10 腎HE染色病理切片(×200)Fig.10 HE stained pathological section of kidney (×200)

3 討論與結(jié)論

自主活動(dòng)是評(píng)價(jià)動(dòng)物情緒興奮性的重要方法,自主活動(dòng)的增加表明興奮性增強(qiáng)[9]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自主活動(dòng)的減少、睡眠時(shí)長(zhǎng)的增加、睡眠潛伏期的縮短被用于評(píng)價(jià)藥物的鎮(zhèn)靜安神抗失眠作用,而與該表征相反的結(jié)果則被認(rèn)為具有提神醒腦、促醒的功效[5]。咖啡因是目前運(yùn)用最廣且普遍認(rèn)可的精神興奮劑,具有中樞興奮和提神醒腦的作用,同時(shí)咖啡因也是多種提神功能性飲料的主要藥效成分,給藥方式的不同,藥效及起效時(shí)間存在差異,相比于吸嗅給藥,口服給藥起效較慢,本文預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明咖啡因灌胃給藥后30 min較為興奮,自主活動(dòng)能力顯著增強(qiáng),戊巴比妥鈉閾上睡眠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)也表明給藥30 min后睡眠總時(shí)長(zhǎng)顯著縮短,因此本文中陽(yáng)性藥組咖啡因選擇灌胃給藥后30 min進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。吸嗅發(fā)揮藥效的速度較快,預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)方精油吸嗅15 min后自主活動(dòng)能力顯著增強(qiáng),因此選擇吸嗅15 min后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。有文獻(xiàn)選擇薄荷油吸嗅為陽(yáng)性對(duì)照組,但是因復(fù)方精油中含有薄荷油,因此本文沒(méi)有選擇薄荷油作為陽(yáng)性藥,而選擇公認(rèn)具有提神醒腦功效的咖啡因作為陽(yáng)性藥。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,復(fù)方精油單次或多天給藥均能顯著提高小鼠自主活動(dòng)能力,具體表現(xiàn)為提高正常小鼠運(yùn)動(dòng)距離和平均速度,縮短休息時(shí)間,同時(shí),與陽(yáng)性藥咖啡因比較,復(fù)方精油提高小鼠自主活動(dòng)能力藥效更顯著、更持久。戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,復(fù)方精油不同劑量組均能夠顯著減少昆明小鼠的睡眠時(shí)間,具有促醒的作用。分析以上結(jié)果可知,復(fù)方精油吸嗅能有效促進(jìn)正常小鼠自主活動(dòng)、縮短戊巴比妥鈉睡眠誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng),發(fā)揮持續(xù)提神醒腦的功效。

DA和GLU是重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),多巴胺被認(rèn)為是一種促進(jìn)覺(jué)醒和興奮的物質(zhì)[10],多巴胺的增加有利于維持清醒和增強(qiáng)興奮性,多巴胺激動(dòng)劑和多巴胺再攝取抑制劑是治療發(fā)作性睡病的重要藥物類型,DA還參與運(yùn)動(dòng)、動(dòng)機(jī)和獎(jiǎng)勵(lì)機(jī)制的調(diào)節(jié)[11]。谷氨酸神經(jīng)元是喚醒和睡眠回路中主要神經(jīng)元的重要組成部分,GLU含量的增加有助于喚醒和興奮,GLU水平的高低在一定程度上反映小鼠的神經(jīng)活動(dòng)興奮性的強(qiáng)弱[11]。本研究發(fā)現(xiàn),復(fù)方精油吸嗅能顯著提高小鼠血、腦內(nèi)DA、GLU含量,與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致。據(jù)報(bào)道,大麻二酚和莫達(dá)非尼精神興奮劑可通過(guò)增加腦組織DA等神經(jīng)遞質(zhì)水平,促進(jìn)燈開(kāi)啟期間誘導(dǎo)大鼠覺(jué)醒[12],咖啡因、大麻及它們的組合在治療后增加大腦組織中的GLU水平,GLU水平的增加可能會(huì)激活小鼠骨髓細(xì)胞核中的組胺神經(jīng)細(xì)胞,并增加其活力[13]。因此,DA、GLU含量的增加可能是復(fù)方精油促進(jìn)小鼠興奮的重要原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)咖啡因?qū)A無(wú)顯著影響,咖啡因與復(fù)方精油對(duì)GLU和DA的差異可能為機(jī)制上的差異。據(jù)報(bào)道,咖啡因的興奮作用主要通過(guò)腺苷受體拮抗、蘭尼堿受體結(jié)合激活蘭尼堿敏感型鈣通道、抑制γ-氨基丁酸(GABA)與受體結(jié)合和抑制環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的活性等4種途徑實(shí)現(xiàn)。D1R是DA的重要受體之一,參與運(yùn)動(dòng)、獎(jiǎng)賞和學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)[14]。DA對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元興奮性的大部分影響歸因于D1R的激活[15],因此復(fù)方精油提高小鼠自主活動(dòng)可能與上調(diào)D1R蛋白水平有關(guān)。另外,DA在喚醒中起著重要作用,因此復(fù)方精油導(dǎo)致小鼠睡眠時(shí)間縮短的原因可能是D1R介導(dǎo)的喚醒機(jī)制的激活[16]。

GC-MS成分分析結(jié)果表明,L-薄荷醇、丁香酚、L-薄荷酮、冰片、1-石竹烯和1,8-桉葉素等成分是復(fù)方精油的主要成分。薄荷醇是薄荷精油的主要有效成分,約占薄荷精油33%～60%,薄荷醇可以有效改善認(rèn)知和緩解精神疲勞,Zhang等[17]的研究表明,單獨(dú)使用薄荷醇不會(huì)影響大鼠伏隔核中DA的水平,而尼古丁和薄荷醇聯(lián)合使用與單獨(dú)使用尼古丁相比,顯著提高了DA的水平,因此復(fù)方精油中的薄荷醇與精油中的其他成分聯(lián)合應(yīng)用提高小鼠腦內(nèi)DA水平發(fā)揮興奮作用。丁香酚為丁香精油的主要成分,丁香酚具有強(qiáng)抗氧化活性,能有效緩解機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷,能有效提高機(jī)體抗氧化酶活性,丁香酚還具有學(xué)習(xí)記憶功能改善作用。L-薄荷酮在抗抑郁和抗炎方面具有相關(guān)報(bào)道[18],冰片作為開(kāi)竅醒腦的常用藥,具有引藥上行和神經(jīng)保護(hù)作用,1-石竹烯具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用,Han等[19]研制的復(fù)方精油具有緩解大鼠中樞疲勞的作用,其中精油中含有33.8%的1,8-桉葉素。因此復(fù)方精油吸嗅提神醒腦改善疲勞可能是多種成分共同作用的結(jié)果。

單次給藥急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)是考察藥物安全性的重要手段之一[20]。為評(píng)價(jià)精油吸嗅的安全性,我們?cè)谟行┝康幕A(chǔ)上進(jìn)一步提高給藥劑量,進(jìn)行單次吸嗅給藥急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,復(fù)方精油高濃度單次吸嗅對(duì)小鼠體重、血細(xì)胞、谷草轉(zhuǎn)氨酶、胱抑素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酐和尿素氮無(wú)顯著性影響,同時(shí)對(duì)小鼠的腦、鼻黏膜、肺、肝和腎等重要組織器官無(wú)病理?yè)p傷,說(shuō)明復(fù)方精油吸嗅安全性良好。

綜上所述,復(fù)方精油通過(guò)提高小鼠血、腦組織DA、GLU含量,上調(diào)小鼠海馬、下丘腦、前額皮層和其他腦組織D1R的蛋白水平表達(dá),發(fā)揮提高小鼠自主活動(dòng)能力以及促醒的作用。復(fù)方精油的主要有效成分可能為L(zhǎng)-薄荷醇、丁香酚、L-薄荷酮、冰片、1-石竹烯和1,8-桉葉素。單次給藥急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,復(fù)方精油吸入對(duì)昆明小鼠體重、血細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)、肝腎功能均無(wú)顯著性影響,對(duì)腦、鼻、肺、肝、腎等組織無(wú)病理性損傷,說(shuō)明復(fù)方精油吸入安全性良好,可以作為提神醒腦的安全性產(chǎn)品使用。