曾曉倩,周笑如,劉春環(huán),劉 學(xué),楊 成

江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院 合成與生物膠體教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,無(wú)錫 214122

寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.),茄科枸杞屬植物,是被載入2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》(后文簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)的中國(guó)傳統(tǒng)藥用植物[1],因其富含多酚、生物堿等活性物質(zhì),抑菌抗炎等效果良好[2],食用與藥用價(jià)值高,被我國(guó)食藥監(jiān)局列入首批藥食同源目錄,在國(guó)內(nèi)外保健品商品市場(chǎng)中備受青睞。由于溫度、濕度等氣象因子對(duì)枸杞品質(zhì)的影響[3],寧夏、青海等省一直是枸杞主產(chǎn)區(qū),但傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、人工調(diào)控難等問(wèn)題仍突出,植物組織培養(yǎng)技術(shù)為這一難題提供了解決方案。

植物組織培養(yǎng)是一種在無(wú)菌及人工控制的條件下,使離體的植物器官、細(xì)胞等在適宜的培養(yǎng)基上再生細(xì)胞或成為完整植物的技術(shù)[4],愈傷組織就是離體的植物器官較易誘導(dǎo)出的一種呈無(wú)定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。而根據(jù)植物細(xì)胞的全能性,枸杞愈傷組織與天然枸杞植株具有相同的遺傳信息,其化學(xué)成分與生物活性也將具有高度相似性。且與傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)種植相比,通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)枸杞愈傷組織的條件更可控,愈傷組織生長(zhǎng)周期較人工種植的枸杞也更短,因此通過(guò)植物組織培養(yǎng)誘導(dǎo)枸杞愈傷組織拓寬了枸杞資源的獲取途徑,利于滿足枸杞市場(chǎng)與日增長(zhǎng)的需求。代謝組學(xué)是研究生命體中分子質(zhì)量在1 500 Da以內(nèi)的代謝物種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的科學(xué),在黃芪、人參等[5]藥食兩用的天然植物的成分分析中應(yīng)用廣泛,但目前對(duì)枸杞的成分分析仍局限于自然條件下生長(zhǎng)的枸杞果實(shí)、花、葉等[6]。

本研究從枸杞種子出發(fā)建立了穩(wěn)定的枸杞愈傷組織培養(yǎng)體系,比較不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)出的愈傷組織抗氧化活性并對(duì)其進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè),分析愈傷組織物質(zhì)組成與代謝途徑,探究枸杞愈傷組織抗氧化活性代謝物來(lái)源,為枸杞資源深入開(kāi)發(fā)與多元化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

寧夏枸杞干燥果實(shí),產(chǎn)自寧夏銀川,購(gòu)于百瑞源枸杞股份有限公司。

Murashige and Skoog培養(yǎng)基(MS)(青島海博生物技術(shù)有限公司,批號(hào):20220307,純度:BR);2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)(批號(hào):B2222178,純度:≥97%)、1-萘乙酸(NAA)(批號(hào):I2008068,純度:96%)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)(批號(hào):I1924138,純度:≥98%)、6-芐氨基嘌呤(6-BA)(批號(hào):I2104107,純度:≥99%)、激動(dòng)素(KT)(批號(hào):I2023136,純度:99%)(均購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

OSE-Y50組織研磨器(北京天根生化科技有限公司);Triple TOF 6600質(zhì)譜儀(美國(guó)愛(ài)博才思公司);1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司);ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm,美國(guó)沃特世公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 枸杞無(wú)菌苗培育

將大小均一的枸杞果實(shí)在水中浸泡12 h后去除果肉,清洗種子3次后再浸泡12 h,2% NaClO溶液浸泡30 min,無(wú)菌水沖洗5次,濾紙吸干水分,接種于無(wú)菌MS固體培養(yǎng)基上培育無(wú)菌苗,溫度25±1 ℃,濕度50%,光照16 h,黑暗8 h,培養(yǎng)45 d。

1.2.2 愈傷組織培養(yǎng)體系建立

以枸杞無(wú)菌苗莖段為外植體,接種于添加了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上,其中以0.25 mg/L NAA+0.125 mg/L 6-BA為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)出的枸杞愈傷組織記為NB,以0.25 mg/L 2,4-D+0.125 mg/L KT為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)出的枸杞愈傷組織記為DK。每皿4節(jié)莖段,每段0.5～1 cm,每一培養(yǎng)條件設(shè)5個(gè)平行。溫度25±1 ℃,濕度50%,黑暗培養(yǎng),45 d后記錄出愈率、愈傷組織生長(zhǎng)量與生長(zhǎng)形態(tài)。取1 g枸杞愈傷組織,接種于繼代培養(yǎng)基上,每7 d稱重并繪制愈傷組織生長(zhǎng)曲線,確定繼代周期。

1.2.3 愈傷組織與枸杞種子、果實(shí)、根皮提取

取冷凍干燥后的愈傷組織、枸杞種子、果實(shí)、根皮各2 mg于研磨器中,70%乙醇1 mL,10 000 r/min提取1 min,40 ℃超聲提取30 min,8 000 r/min離心15 min,取上清液待測(cè)。

1.2.4 抗氧化活性檢測(cè)

將40 μL愈傷組織上清液與160 μL 0.1 mmol/L DPPH溶液加入96孔板中,振板1 min,避光反應(yīng)30 min后,于517 nm測(cè)吸光度(A)。對(duì)照組為提取溶劑+DPPH溶液,空白組為愈傷組織上清液+Tris-HCl緩沖液。

1.2.5 代謝組學(xué)檢測(cè)

通過(guò)UHPLC-Q-TOF-MS對(duì)NB、DK愈傷組織提取物上清液檢測(cè),分析其代謝物變化,每組6個(gè)重復(fù)。其中NB記為NB-1、NB-2、NB-3、NB-4、NB-5、NB-6,DK為DK-1、DK-2、DK-3、DK-3、DK-4、DK-5、DK-6。

色譜條件:1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng);ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm);柱溫40 ℃;流速0.4 mL/min;進(jìn)樣量2 μL;流動(dòng)相為25 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.5%甲酸)(A)、甲醇(B)。流動(dòng)相洗脫程序?yàn)?～0.5 min,5% B;0.5～10 min,5%→100% B;10～12 min,100% B;12～12.1 min,100%→5% B;12.1～16 min,5% B。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子化(ESI)源條件為離子源溫度600 ℃,霧化氣輔助加熱氣60 psi,輔助加熱氣60 psi,氣簾氣30 psi,噴霧電壓±5 500 V(正負(fù)兩種模式);一級(jí)質(zhì)荷比檢測(cè)范圍為60～1 000 Da,一級(jí)質(zhì)譜掃描累積時(shí)間0.20 s,二級(jí)子離子質(zhì)荷比檢測(cè)范圍為25～1 000 Da,二級(jí)質(zhì)譜在峰強(qiáng)度值篩選模式采用數(shù)據(jù)依賴型采集模式IDA獲得,去簇電壓為±60 V(正、負(fù)兩種模式),碰撞能量為35±15 eV。

1.2.6 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理與分析方法

原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件由Wiff格式轉(zhuǎn)換為mzXML格式,用MSDAIL軟件進(jìn)行峰對(duì)齊、保留時(shí)間校正與提取峰面積操作。將MSDAIL提取得到的數(shù)據(jù)與中科新生命植物代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)中代謝物的分子質(zhì)量(誤差<10 ppm)、保留時(shí)間、二級(jí)碎裂譜圖等信息進(jìn)行匹配,鑒定代謝物結(jié)構(gòu)。利用主成分分析、正交偏最小二乘法判別分析進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析獲取差異代謝物并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織培養(yǎng)體系建立

NB生長(zhǎng)量與出愈率均高于DK且兩者的生長(zhǎng)形態(tài)存在一定差異(見(jiàn)表1),這是由于培養(yǎng)基中添加的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不同。作為啟動(dòng)愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵條件,植物細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞分裂素含量較生長(zhǎng)素高時(shí)形成新芽,生長(zhǎng)素含量較細(xì)胞分裂素含量高時(shí)促進(jìn)生根[4],當(dāng)生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素比例不當(dāng)時(shí)會(huì)抑制愈傷組織生長(zhǎng)甚至無(wú)法誘導(dǎo)出愈傷組織,只有生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素處于一定水平時(shí)有利于愈傷組織生長(zhǎng)、分化并影響其次生代謝物質(zhì)如黃酮類物質(zhì)花青素[7]或咖啡酸、綠原酸等酚類物質(zhì)[8]的生成。枸杞愈傷組織繼代培養(yǎng)情況如圖1所示,NB與DK繼代生長(zhǎng)曲線呈“S”型,在繼代后的7 d內(nèi)愈傷組織生長(zhǎng)最慢,在7～21 d內(nèi)進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期,愈傷組織生長(zhǎng)量增速最快,培養(yǎng)基養(yǎng)分被大量消耗,加速愈傷組織中代謝物的合成,21～28 d,培養(yǎng)基趨于耗盡,愈傷組織質(zhì)量增長(zhǎng)減緩,因此以28 d作為枸杞愈傷組織的最佳繼代周期。

圖1 NB與DK枸杞愈傷組織繼代生長(zhǎng)曲線Fig.1 Subculture growth curve of L.barbarum callus of NB and DK

表1 枸杞愈傷組織生長(zhǎng)量、出愈率及生長(zhǎng)形態(tài)

2.2 枸杞愈傷組織抗氧化活性檢測(cè)

抗氧化活性是枸杞具有的眾多生物活性之一,DPPH自由基清除法是一種常用的檢測(cè)天然產(chǎn)物抗氧化活性的方法,DPPH自由基清除率高低能在一定程度反映物質(zhì)的抗氧化能力強(qiáng)弱。NB、DK以及枸杞植株不同部位提取物DPPH自由基清除率結(jié)果如圖2所示,NB在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)DPPH自由基清除率最高達(dá)74.8%,DK在相同質(zhì)量濃度時(shí)的DPPH自由基清除率僅為38.6%,NB的DPPH自由基清除率是DK的1.9倍,說(shuō)明NB更易積累抗氧化活性物質(zhì)。在質(zhì)量濃度2 mg/mL時(shí),NB的DPPH自由基清除率較自然條件生長(zhǎng)的枸杞種子、果實(shí)、根皮更高,可見(jiàn)枸杞愈傷組織抗氧化性能良好。

圖2 枸杞愈傷組織與植株不同部位提取物DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH radical scavenging rate of L. barbarum callus and different part of L. barbarum extract注:與DK相比,*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。Note:Compared with DK,*P < 0.05;**P < 0.01;***P < 0.001.

2.3 代謝組學(xué)分析

2.3.1 代謝物數(shù)量與分類

采用UHPLC-Q-TOF-MS檢測(cè)分析枸杞愈傷組織中代謝物。正、負(fù)離子模式合并后共鑒定出752種代謝物,其中正離子模式431種,負(fù)離子模式321種,常見(jiàn)種類代謝物統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。愈傷組織中類脂的含量較高達(dá)17.6%,而自然生長(zhǎng)的枸杞也富含亞麻酸等必需多不飽和脂肪酸[9]。枸杞中糖類含量豐富,其中含量最高的是葡萄糖,其次為果糖、蔗糖[10],甜菜堿與一類特定的多糖在《中國(guó)藥典》中被作為枸杞合格標(biāo)準(zhǔn)的生物標(biāo)志物[1],而在枸杞愈傷組織中也檢測(cè)到甜菜堿與大量糖類物質(zhì)。此外,枸杞根皮中主要活性成分地骨皮乙素[11]也存在于愈傷組織中,可見(jiàn)枸杞愈傷組織與天然枸杞植株代謝物組成具有較高的相似性。

表2 枸杞愈傷組織代謝物在各化學(xué)分類的數(shù)量及含量占比

2.3.2 主成分分析

主成分分析反映組間樣本的總體分布趨勢(shì)和組間樣本的差異度。正、負(fù)離子模式下,NB與DK主成分分析結(jié)果如圖3所示,NB與DK各自的6個(gè)生物學(xué)重復(fù)聚集在一起,說(shuō)明組內(nèi)樣品重復(fù)性良好,兩種類型的點(diǎn)分離,說(shuō)明NB與DK樣品之間代謝物存在較明顯差異。經(jīng)7次循環(huán)交互驗(yàn)證,正、負(fù)離子模式下PCA模型解釋率R2X分別為0.694、0.871,兩者均接近1,表明模型穩(wěn)定。

圖3 正(A)、負(fù)(B)離子模式下NB與DK的PCA圖Fig.3 PCA diagram of NB and DK in positive (A) and negative (B) ion mode

2.3.3 正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)

正交偏最小二乘判別分析通過(guò)濾除與分類信息無(wú)關(guān)的噪音,將組間差異最大化,提高模型解析能力與有效性。正、負(fù)離子模式下,NB與DK正交偏最小二乘判別分析結(jié)果如圖4所示,兩種類型的點(diǎn)組內(nèi)聚集,組間分散,說(shuō)明NB與DK具有明顯差異。經(jīng)7次循環(huán)交互驗(yàn)證,正、負(fù)離子下模型預(yù)測(cè)能力Q2分別為0.955、0.990,兩者均大于0.5,表明模型可靠。

圖4 正(A)、負(fù)(B)離子模式下NB與DK的OPLS-DA圖 Fig.4 OPLS-DA diagram of NB and DK in positive (A) and negative (B) ion mode

為避免過(guò)度擬合,保證模型的有效性,對(duì)模型進(jìn)行200次響應(yīng)的置換檢驗(yàn),正、負(fù)離子模式下,NB與DK正交偏最小二乘判別分析置換檢驗(yàn)結(jié)果如圖5所示,隨著置換保留度逐漸降低,隨機(jī)模型的R2和Q2均下降,說(shuō)明原模型未過(guò)度擬合,模型穩(wěn)定。

圖5 正(A)、負(fù)(B)離子模式下NB與DK的OPLS-DA置換檢驗(yàn)Fig.5 OPLS-DA permutation test of NB and DK in positive (A) and negative (B) ion mode

2.3.4 差異代謝物分析

以O(shè)PLS-DA模型獲得的變量權(quán)重值(VIP)衡量代謝物在模型解釋中貢獻(xiàn)情況,將VIP>1和P<0.05作為顯著性差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)并對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行分析,正、負(fù)離子模式下,NB與DK差異代謝物統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正、負(fù)離子模式下NB與DK差異代謝物統(tǒng)計(jì)結(jié)果

正、負(fù)離子模式下,顯著性差異代謝物層次聚類熱圖如圖6所示,圖中右側(cè)編號(hào)對(duì)應(yīng)的代謝物見(jiàn)表3,圖內(nèi)顏色種類與深淺程度反映NB、DK代謝物富集情況差異,其中橙紅色代表代謝物富集,紅色越深富集程度越高,藍(lán)色相反。NB較DK共有55種差異代謝物,其中22種差異代謝物含量上調(diào)且差異倍數(shù)超1倍,上調(diào)代謝物中2種肉桂酸及其衍生物(阿魏酰O-甲基多巴胺、順式-咖啡酸),1種木質(zhì)素苷(8-羥基松脂醇 4′-葡萄糖苷)等次生代謝物均有一定的抗氧化作用,(+/-)-格羅沙酰胺可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中自由基與氧化損傷的產(chǎn)生[12],提升了NB的抗氧化能力,而NB較DK高11倍的乳糖、乳果糖,雖然都是初生代謝物,不直接參與次生代謝物合成,但通過(guò)糖酵解、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑、莽草酸途徑等初生代謝途徑也可以促進(jìn)次生代謝物質(zhì)生成,Zhong等[13]也發(fā)現(xiàn)碳水化合物的積累能夠促進(jìn)次生代謝物穿心蓮內(nèi)酯的生物合成。此外,NB中咖啡酸乙酯含量比DK高55倍(VIP>1,P=0.087),而咖啡酸乙酯抗氧化能力強(qiáng)[14],且具有高于原兒茶醛的α淀粉酶抑制活性,可減緩碳水化合物分解成單糖[15],降糖活性良好,是一種潛在的植物源活性物。

圖6 正(A)、負(fù)(B)離子模式下顯著性差異代謝物層次聚類熱圖Fig.6 Hierarchical clustering heat map of differential metabolites in positive (A) and negative (B) ion mode

KEGG分析結(jié)果如圖7所示,NB中顯著性差異代謝物蔗糖、D-氨基葡萄糖、谷氨酰胺、亮氨酸、環(huán)磷酸腺苷、膽堿等主要富集在氨基酸的生物合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、甘油磷脂代謝、氨酰-tRNA生物合成等20條通路。氣泡大小表示該通路在拓?fù)浞治鲋械挠绊懸蜃哟笮?氣泡越大代表影響因子越大,氣泡顏色反映富集分析的P值大小,顏色越深,P值越小,富集程度越顯著。由此可見(jiàn),ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氨酰-tRNA生物合成、氨基酸的生物合成通路富集程度最為顯著,對(duì)愈傷組織物質(zhì)合成影響最大。其中,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是植物中最大的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族之一,位于植物液泡、線粒體和葉綠體膜上,由ATP直接供能[16],參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)生長(zhǎng)、發(fā)育以及對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取、對(duì)生物和非生物脅迫的耐受性、植物激素、初生與次生代謝物質(zhì)的運(yùn)輸?shù)榷喾N生物學(xué)過(guò)程[17]。顯著性差異代謝物谷氨酰胺、亮氨酸、蔗糖、谷氨酰胺、膽堿富集于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路上,谷氨酰胺、亮氨酸、色氨酸富集于氨酰-tRNA生物合成以及氨基酸的生物合成通路上。

圖7 KEGG富集通路圖Fig.7 KEGG enrichment pathway diagram

谷氨酰胺作為無(wú)機(jī)氮源氮同化的主要產(chǎn)物,也是植物氮代謝的核心代謝產(chǎn)物[18],由葡萄糖經(jīng)多個(gè)初生代謝途徑合成,是生物體內(nèi)含量豐富的氨基酸,NB高蔗糖水平或是導(dǎo)致其谷氨酰胺的水平較DK更高的原因。谷氨酰胺與植物體內(nèi)的氮調(diào)節(jié)密切相關(guān),不同形態(tài)的氮促進(jìn)藥用植物不同種類代謝物的生物合成,但具體作用機(jī)制仍有待研究。由于調(diào)節(jié)氮代謝可減少碳水化合物的消耗,對(duì)植物生長(zhǎng)與代謝物合成積累具有協(xié)同作用[13],枸杞愈傷組織中的谷氨酰胺可能對(duì)地骨皮乙素這一重要含氮代謝物的生物合成具有重要調(diào)控作用。Sun等[19]發(fā)現(xiàn)亮氨酸可以通過(guò)改善氧化損傷從而增強(qiáng)抗氧化活性。此外,色氨酸在高等植物中廣泛存在,作為前體物質(zhì)可合成內(nèi)源生長(zhǎng)素吲哚乙酸來(lái)間接調(diào)控代謝物合成,Kahveci等[20]發(fā)現(xiàn)外源色氨酸促進(jìn)酚類物質(zhì)的合成。

上述三條代謝通路中富集的代謝物多為初生代謝物,初生代謝物在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氨酰-tRNA生物合成以及氨基酸的生物合成代謝通路上的顯著富集反映出NB活躍的初生代謝物物質(zhì)合成、運(yùn)輸水平,它們可以直接參與植物生命活動(dòng)過(guò)程,為其提供能量,也可進(jìn)一步生成次生代謝物所需的原料與前體,間接調(diào)控具有良好生物活性的酚類、生物堿等代謝物的生成,從而對(duì)愈傷組織的抗氧化活性產(chǎn)生影響。雖然植物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)動(dòng)態(tài)且復(fù)雜過(guò)程,其具體的作用機(jī)制仍未明確,但已有研究表明,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不僅在植物營(yíng)養(yǎng)和生殖發(fā)育中發(fā)揮作用,還可以參與調(diào)控次生代謝物花青素的積累[21],因?yàn)锳BC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)是花青素積累的重要限速步驟,轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的向內(nèi)和向外交替的構(gòu)象結(jié)構(gòu)被認(rèn)為可以調(diào)節(jié)底物結(jié)合或釋放[22]。因此,初步推斷ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能差異可能是導(dǎo)致不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)出的枸杞愈傷組織抗氧化活性差異顯著的主要原因。

3 討論與結(jié)論

從枸杞種子培育無(wú)菌苗獲取莖段作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體,建立了穩(wěn)定的枸杞愈傷組織培養(yǎng)體系,并得到高抗氧化活性枸杞愈傷組織NB。通過(guò)非靶向代謝組學(xué)分析了枸杞愈傷組織的物質(zhì)成分及其代謝通路差異,發(fā)現(xiàn)枸杞愈傷組織共有752種化合物,與天然植株在活性成分上也具有相似性且抗氧化活性較天然植株更佳。與DK相比,NB中55種代謝物存在顯著差異,其中22種代謝物含量上調(diào),包括抗氧化活性良好的甜菜堿[23]等次生代謝物。此外,NB的乳糖、乳果糖較DK高11倍,這些糖類作為初生代謝物,可以利用糖苷酶水解作用轉(zhuǎn)化為單糖,通過(guò)糖異生途徑生成重要抗氧化劑谷胱甘肽的前體物質(zhì)谷氨酰胺等[24],間接地促進(jìn)枸杞愈傷組織次生代謝產(chǎn)物的生成及抗氧化能力的增強(qiáng)。KEGG結(jié)果表明,顯著差異代謝物富集于20條代謝通路中,主要通過(guò)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、甘油磷脂代謝、氨酰-tRNA生物合成、氨基酸的生物合成通路直接或間接調(diào)控枸杞愈傷組織生長(zhǎng)及代謝物合成。

在已檢測(cè)出的55種差異代謝物中,甜菜堿與有機(jī)酸研究廣泛,而表小檗堿等次生代謝物鮮見(jiàn)研究,且表小檗堿具有良好的減少脂質(zhì)積累[25]的作用,對(duì)人體健康極具益處。目前,通過(guò)控制外源條件對(duì)愈傷組織代謝物進(jìn)行定向誘導(dǎo),可以富集特定代謝物并利用分離純化手段獲取安全可靠的植物源天然活性物。Khanam等[26]通過(guò)添加化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑提高了薄荷油的產(chǎn)量,可見(jiàn)植物次生代謝產(chǎn)物調(diào)控具有可行性,植物組織培養(yǎng)有望成為枸杞資源的重要獲取途徑,為枸杞資源的開(kāi)發(fā)尤其是次生代謝產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)提供借鑒。