金美 巴桑 次仁

(日喀則市人民醫(yī)院,西藏 日喀則 857000)

結(jié)直腸癌是全球第三大常見惡性腫瘤,是導致癌因性死亡的第二大原因[1],對人類健康造成了極大的影響,我國近年來的結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率均持續(xù)升高,造成了嚴重的癌癥負擔[2-3]。因惡性腫瘤發(fā)生早期無特異性的癥狀,且受健康檢查意識薄弱、漏診及結(jié)腸鏡檢查覆蓋不全等綜合因素影響,多數(shù)結(jié)直腸癌患者就診時已失去最佳手術(shù)時機,預后不佳。因此探索結(jié)直腸癌的發(fā)病機制,尋找新的治療靶點對于結(jié)直腸癌的防治有重要意義。多項研究證實,非編碼RNA參與癌癥表型,關(guān)于非編碼RNA的干預研究為結(jié)直腸癌的治療提供了新的前景[4-6]。環(huán)狀核糖核苷酸(circRNA)作為非編碼RNA,能夠調(diào)節(jié)微小RNA(miRNA)和信使RNA(mRNA),并充當miRNAs的分子海綿和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,與RNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合翻譯蛋白,影響細胞的生命活動[7]。研究發(fā)現(xiàn)circ_胞質(zhì)分裂作用因子1(Dedicator of cytokinesis 1,circ_DOCK1)在結(jié)直腸癌中表達異常,且能影響人腦血管平滑肌細胞的增殖和凋亡[8-9]。miR-122-5p作為小型非編碼RNA已經(jīng)被證實參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展[10-11]。肽酰脯氨基順反異構(gòu)酶B(Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase,PPIB)有肽酰脯氨基順反異構(gòu)催化活性,在miRNA調(diào)控下能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用,促進細胞的生長和增殖[12]。故本研究探討circ_DOCK1通過調(diào)節(jié)miR-122-5p/PPIB軸對結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響,以期為結(jié)直腸癌的靶向治療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 選取2020年5月—2021年5月收治的經(jīng)病理診斷證實且術(shù)前未接受化療的30例結(jié)直腸癌患者癌組織與癌旁組織標本(距離癌組織5 cm),患者年齡36～80歲,男性18例,女性12例,平均(64.69±10.58)歲;分化程度:高分化4例,中分化15例,低分化11例;TNM分期:I/II期12例,III/IV期18例。研究項目經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,且患者均簽署知情同意書。

1.2 實驗材料 人結(jié)直腸癌細胞SW480株(中國科學院上海細胞庫),10%胎牛血清、1%雙抗(鏈霉素+青霉素)(南京科佰生物科技有限公司)DMEM培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2密閉式孵箱內(nèi)培養(yǎng)。Trizol RNA抽提試劑、熒光素酶檢測試劑盒、LipofectamineTM3000陽離子脂質(zhì)體(美國Invitrogen公司),circ_DOCK1干擾質(zhì)粒(sh-circ_DOCK1),miR-17-5p反義寡核苷酸重組質(zhì)粒(anti-miR-17-5p)和miR-17-5p模擬物(miR-17-5p mimics)(蘇州吉瑪基因股份有限公司);3550UV酶標儀、7500實時熒光定量PCR儀、電泳儀、CheniDoc XRS化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(Bio-rad公司),徠卡生物倒置顯微鏡(德國Leica公司)。

1.3 實時熒光定量PCR檢測circ_DOCK1、miR-122-5p、PPIB表達水平 結(jié)腸癌組織和癌旁組織加入液氮中研磨,以Trizol試劑盒提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA,分別擴增circ_DOCK1、miR-122-5p、PPIB和內(nèi)參U6及β-actin基因,引物序列設(shè)計由上海生工生物工程有限公司合成,制備PCR反應體系,2×Sybgreen預混合物10 μL,cDNA模板8.8 μL,上下游引物各0.6 μL,總體積20 μL,嚴格按照試劑盒說明書操作,在PCR結(jié)束后直接獲取目的基因相對表達水平(本研究細胞實驗均重復3次)。

1.4 人結(jié)直腸癌細胞SW480的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期人結(jié)直腸癌細胞SW480,1×104/孔密度接種于96孔板中,至細胞融合率達到70%,按照LipofectamineTM3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作,分別轉(zhuǎn)染sh-circ_DOCK1(sh-circ_DOCK1組)、干擾對照載體(NC-circ_DOCK1組)和sh-circ_DOCK1+anti-miR-17-5p(挽救組)。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖能力 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)0 h、24 h、48 h和72 h時分別在培養(yǎng)孔中加入10 μL的CCK-8工作液,37 ℃孵育2 h,酶標儀檢450 nm處的吸光度(A)值,繪制生長曲線。

1.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 轉(zhuǎn)染后的細胞以1×104/孔密度接種于6孔板中,24 h待細胞貼壁生長后以10 μL移液槍頭在培養(yǎng)板中劃直線,更換為含10%血清的新鮮培養(yǎng)液,37 ℃、5%CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng),48 h后倒置顯微鏡下觀察細胞遷移情況。

1.7 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 轉(zhuǎn)染后的細胞1×105個接種于Transwell小室上室,加入200 μL無血清培養(yǎng)液,下室加入500 μL的DMEM培養(yǎng)基,孵育箱培養(yǎng)48 h,去除上室細胞,4%多聚甲醛固定,0.1%結(jié)晶紫染色15 min,晾干后拍照計算穿模細胞數(shù)。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?細胞接種于24孔板,貼壁后待轉(zhuǎn)染,將含有miR-122-5p潛在結(jié)合位點的circ_DOCK13′非翻譯區(qū)(3′-untranslated region,3′UTR)和UPF1 3′-UTR熒光素酶報告質(zhì)粒(PmirGLO)和結(jié)合位點突變的熒光素酶質(zhì)粒與anti-miR-17-5p、miR-17-5p mimics共轉(zhuǎn)染至人結(jié)直腸癌細胞SW480,孵育48 h,按照熒光素酶報告系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 臨床標本circ_DOCK1、miR-122-5p、PPIB表達水平比較 與癌旁組織比較,癌組織的circ_DOCK1、PPIB mRNA表達量升高,miR-122-5P表達量下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1、2。

圖1 癌組織與癌旁組織circ_DOCK1、PPIB mRNA表達量比較

圖2 癌組織與癌旁組織circ_DOCK1、miR-122-5p、PPIB mRNA表達電泳圖

2.2 人結(jié)直腸癌細胞SW480 circ_DOCK1、miR-122-5p、PPIB表達水平比較 與挽救組和NC-circ_DOCK1組比較,sh-circ_DOCK1組的circ_DOCK1和PPIB mRNA表達量下降,miR-122-5p表達量升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);挽救組和NC-circ_DOCK1組的circ_DOCK1、miR-122-5p及PPIB mRNA表達量比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖3、4。

圖3 Circ_DOCK1、miR-122-5p、PPIB表達水平比較

2.3 人結(jié)直腸癌細胞SW480增殖情況比較 3組轉(zhuǎn)染后0 h、24 h的A值比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),sh-circ_DOCK1組的48 h和72 h的A值低于挽救組和NC-circ_DOCK1組(P<0.05),挽救組和NC-circ_DOCK1的A值比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5。

圖4 人結(jié)直腸癌細胞circ_DOCK1、miR-122-5p、PPIB mRNA表達電泳圖

圖5 人結(jié)直腸癌細胞SW480增殖情況比較

2.4 人結(jié)直腸癌細胞SW480遷移和侵襲情況比較sh-circ_DOCK1組的細胞遷移率和穿膜細胞數(shù)均低于挽救組和NC-circ_DOCK1組(P<0.05),挽救組和NC-circ_DOCK1的細胞遷移率和穿膜細胞數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1、圖6、7。

表1 人結(jié)直腸癌細胞SW480遷移和侵襲情況比較

圖6 細胞遷移情況

圖7 細胞侵襲情況

2.5 circ_DOCK1與miR-122-5p的靶向關(guān)系驗證 利用生物信息學軟件TargetScan、miRwalk初步預測circ_DOCK1與miR-122-5p 3′UTR的結(jié)合位點,顯示circ_DOCK1序列中含有與miR-122-5p互補的核苷酸序列,見圖8。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示,轉(zhuǎn)染miR-122-5p mimics后,circ_DOCK1的野生型熒光素酶報告質(zhì)粒相對活性降低,轉(zhuǎn)染anti-miR-122-5p后,circ_DOCK1的野生型熒光素酶報告質(zhì)粒相對轉(zhuǎn)錄活性增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),轉(zhuǎn)染miR-122-5p mimics、anti-miR-122-5p的circ_DOCK1突變型熒光素酶報告質(zhì)粒相對活性值無明顯變化(P>0.05)。見表2。

圖8 circ_DOCK1與miR-122-5p的結(jié)合位點

表2 circ_DOCK1熒光素酶活性

3 討論

隨著基因檢測、篩查等技術(shù)的進步,尋找惡性腫瘤的基因治療靶點成為研究熱點。circRNA作為新型的內(nèi)源性非編碼RNA,是由前mRNA和非編碼RNA的非規(guī)范反向剪接產(chǎn)生的單鏈RNA的共價環(huán),較線性的RNA更為穩(wěn)定,在真核細胞中廣泛存在,參與控制細胞周期、腫瘤發(fā)生和化學抗性[13-14]。有研究證實,circRNA調(diào)節(jié)的主要機制之一是作為競爭性內(nèi)源性RNA或RBP分子海綿調(diào)控靶基因的表達,影響惡性腫瘤的進展[15]。

DOCK1屬于胞質(zhì)分裂貢獻因子家族成員,具有鳥嘌呤核苷酸交換因子活性,而DOCK1異常是多種免疫缺陷疾病的重要原因。DOCK1在甲狀腺癌、肝癌、骨肉瘤等多種惡性腫瘤中具有促癌基因?qū)傩?參與腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學過程。研究發(fā)現(xiàn)來自circRNA的DOCK1能過抑制甲狀腺細胞中的miR-124的表達,阻斷anus激酶/信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子/腺苷5′-單磷酸活化蛋白激酶信號通路的信號轉(zhuǎn)導,并參與通過下調(diào)miR-124導致甲狀腺癌的發(fā)生;還可通過miR-654-5p/SMAD同源物2軸抑制肝癌的進展,并能調(diào)節(jié)miR-339-3p/胰島素樣生長因子1受體軸促進成骨肉瘤的腫瘤發(fā)生和順鉑耐藥[16-18]。一項動物實驗發(fā)現(xiàn),miR-122-5p能通過細胞分裂周期和細胞凋亡調(diào)控因子1增強腸上皮細胞放射敏感性,加重小鼠放射性直腸損傷[19]。Yin等[20]一項細胞實驗中,miR-122-5p亦能受circ_0007142的調(diào)節(jié),啟動下游CDC25A促進結(jié)直腸癌的進展。以上研究說明一種circRNA可調(diào)控多種靶基因,而一個靶基因受多種circRNA的調(diào)控。PPIB具有肽酰脯氨基順反異構(gòu)催化活性,當其順反異構(gòu)的催化活性被阻斷,則作為細胞外基質(zhì)主要成分的膠原蛋白成熟被延遲,而細胞外基質(zhì)是癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移需要突破的第一道屏障[21]。在本研究中發(fā)現(xiàn)circ_DOCK1、PPIB mRNA在結(jié)直腸癌組織中高表達,miR-122-5p低表達;在SW480細胞中抑制circ_DOCK1的表達,而miR-122-5p表達升高,PPIB mRNA表達下降,且SW480細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力下降,說明circ_DOCK1和PPIB在結(jié)直腸癌中高表達,而miR-122-5p低表達,敲低circ_DOCK1能影響miR-122-5p和PPIB表達,并抑制結(jié)直腸癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究為了評估circ_DOCK1在SW480細胞能夠由miR-122-5p介導,將敲低circ_DOCK1的細胞共轉(zhuǎn)染anti-miR-17-5p,結(jié)果逆轉(zhuǎn)了敲低circ_DOCK1的作用效應。此外通過雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-122-5p mimics后,circ_DOCK1的野生型熒光素酶報告質(zhì)粒相對活性降低,轉(zhuǎn)染anti-miR-122-5p后circ_DOCK1的野生型熒光素酶報告質(zhì)粒相對轉(zhuǎn)錄活性增加,說明過表達miR-122-5p能結(jié)合circ_DOCK1抑制報告基因熒光素酶活性,證明了兩者的靶向關(guān)系,即circ_DOCK1在結(jié)直腸癌中充當miR-122-5p的分子海綿,競爭性結(jié)合miR-122-5p,調(diào)節(jié)PPIB,影響結(jié)直腸癌的進展。

4 結(jié)論

綜上所述,circ_DOCK1在結(jié)直腸癌組織中的表達異常升高,并可通過調(diào)節(jié)miR-122-5p/PPIB軸影響結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲。