宿偉鵬 趙化榮 李晨曦 劉攀 張洋 龔忠誠

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院1.腫瘤中心;2.頜面腫瘤外科,新疆 烏魯木齊 830011)

口腔癌是一種總生存率較低的惡性腫瘤,50歲以上人群的發(fā)病率較高且近年來趨于年輕化[1]。口腔癌發(fā)病機制復雜,治療選擇包括手術(shù)、放療和化療,但晚期患者進行手術(shù)切除可能需要重建部分口腔或面部特征,而放療和化療通常會引起一系列嚴重不良反應[2-3]。微小RNA(miRNA)是包含19-24個核苷酸的單鏈非編碼RNA,可以通過與3′-非翻譯區(qū)堿基配對,與匹配的靶基因mRNA特異性結(jié)合,介導靶基因特異位點的切割或抑制翻譯,從而調(diào)節(jié)基因的表達水平[4]。miRNA在癌癥中的生物學作用及其與臨床相關(guān)性方面的研究取得了顯著進展,從而為癌癥診療開辟了新途徑。miR-217在多種癌癥中表達下調(diào),如肺癌、結(jié)腸癌、胃癌和胰腺癌,并作為腫瘤抑制基因發(fā)揮作用[5-8]。但關(guān)于miR-217在口腔癌中的表達以及對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激過程的影響尚未明確。本研究通過檢測幾種口腔癌細胞系中miR-217表達變化,探究其對口腔癌細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響,旨在闡明miR-217調(diào)節(jié)口腔癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人口腔癌細胞系HSC3、SAS、SCC15、FaDu和人正常口腔角質(zhì)形成細胞系HNOK購于美國ATCC。4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)購于北京康瑞納生物公司,胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗、DMEM培養(yǎng)液及牛血清白蛋白購于美國Gibco公司,Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒和Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司,miRNA反轉(zhuǎn)錄與定量檢測試劑盒購于南京諾唯贊生物公司,基因反轉(zhuǎn)錄與定量檢測試劑盒購于日本Takara公司,Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于沈陽萬類生物公司,Hoechst 33342染液和DAPI染液購于北京索萊寶生物公司,Triton X-100裂解液、RIPA裂解液、BCA蛋白檢測試劑盒、ECL發(fā)光液以及雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于上海碧云天生物研究所,抗體LC3、LC3I、LC3II、Beclin-1、GRP78、CHOP、Caspase-12、GAPDH、異硫氰酸熒光素標記的山羊抗兔IgG及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG均購于英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR) Trizol法提取細胞總RNA,Nano Drop2000超微量分光光度計測定RNA樣品純度、濃度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒,分別合成miRNA與基因?qū)腸DNA,保存于-20 ℃下備用。以cDNA為模板,通過RT-qPCR實驗測定細胞內(nèi)miRNA和各基因的表達變化,參照試劑盒說明書配制反應體系,在Bio-CFX96定量檢測系統(tǒng)上進行擴增,以U6作為miR-217內(nèi)參基因,以GAPDH作為其余各基因內(nèi)參基因。擴增結(jié)束后,根據(jù)擴增曲線得到Ct值,以2-ΔΔCt法計算各基因mRNA相對表達量,實驗重復3次。引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

1.2.2 細胞分組與轉(zhuǎn)染 在SAS細胞中加入含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),常規(guī)消化傳代。待處于對數(shù)生長期,將細胞以1×105/孔的密度植入6孔板過夜培養(yǎng)。實驗分組及處理如下:①對照組,細胞正常培養(yǎng)。②miR-NC組,將miR-NC轉(zhuǎn)染至細胞。③miR-217 mimic組,將miR-217 mimic轉(zhuǎn)染至細胞。④miR-217 mimic+4-PBA組,將miR-217 mimic轉(zhuǎn)染至細胞,加入含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-PBA(100 nmol/L)處理24 h。采用Lipofectamine 2000試劑盒按照脂質(zhì)體法進行轉(zhuǎn)染,嚴格根據(jù)說明書操作,并通過RT-qPCR測定轉(zhuǎn)染效果。處理結(jié)束后,收集各組細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 流式細胞術(shù) 將4組SAS細胞常規(guī)消化離心,加入PBS清洗,并加入適量1×binding buffer重懸,調(diào)整細胞密度為1×106個/mL,吸取100 μL懸液加入干凈的流式檢測管中,并依次加入5 μL Annexin V-FITC和10 μLPI,震蕩混勻,立即通過流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡水平。

1.2.4 Hoechst 33342染色 收集4組SAS細胞,經(jīng)4%多聚甲醛固定后,滴加0.3%Triton X-100透化處理15 min,PBS洗滌細胞,滴加終濃度5 mg/L Hoechst 33342染色,充分覆蓋樣品,室溫避光孵育30 min,吸除染色液,PBS再次洗滌細胞,脫水處理,封片并干燥,在熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況,Hoechst33342能透過細胞胞膜,嵌入胞核DNA內(nèi),使凋亡細胞發(fā)出明亮的藍色熒光。

1.2.5 細胞免疫熒光染色 用PBS清洗收集的4組SAS細胞,4%多聚甲醛固定,滴加0.3 %Triton X-100透化液處理10 min,采用5%牛血清白蛋白室溫封閉30 min。加入兔抗LC3多克隆抗體,以1∶100稀釋,4 ℃孵育過夜。吸除一抗,PBS清洗,加入異硫氰酸熒光素標記的山羊抗兔IgG,以1∶200稀釋,37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育1 h,吸除二抗,PBS再次清洗。采用DAPI避光復染,室溫染色10 min。結(jié)束后再次清洗,抗熒光淬滅劑封片,晾干,在激光共聚焦顯微鏡觀察細胞染色情況并拍攝圖片,Image J軟件分析蛋白表達熒光強度。

1.2.6 Western Blot 在細胞中添加含PMSF的RIPA裂解液提取總蛋白,BCA法定量蛋白。在蛋白樣品中加入上樣緩沖液,100 ℃水浴中煮沸5 min,使蛋白變性。配置10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,取等量變性蛋白上樣,恒壓電泳分離,電轉(zhuǎn)至PVDF膜。再以5%山羊血清封閉1 h,將印跡與一抗LC3I、LC3II、Beclin-1、GRP78、CHOP、Caspase-12抗體4 ℃共孵育過夜,均以1∶1000稀釋。TBST清洗,加入對應二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG,以1∶5000稀釋,室溫孵育1 h,TBST再次清洗。采用ECL避光顯影,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,內(nèi)參蛋白為GAPDH,蛋白相對表達量以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值之比來表示。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測實驗 通過Starbase在線工具預測miR-217與HGMA2之間是否存在靶向互補結(jié)合位點。根據(jù)預測結(jié)果,為了進一步確定HGMA2是否是miR-217的直接靶標,設計HGMA2的野生型(HMGA2 3′-UTR WT)及突變型(HMGA2 3′-UTR MUT)序列,并克隆到熒光素酶質(zhì)粒中。取對數(shù)生長期的SAS細胞植入6孔板,按照脂質(zhì)體法將構(gòu)建的報告基因質(zhì)粒分別與miR-NC或miR-217 mimic轉(zhuǎn)染至SAS細胞內(nèi),轉(zhuǎn)染48 h后,利用雙熒光素酶試劑盒對兩組細胞中熒光素酶活性進行檢測分析。

2 結(jié)果

2.1 口腔癌細胞中miR-217與HMGA2表達檢測結(jié)果 RT-qPCR檢測結(jié)果顯示,與人正?？谇唤琴|(zhì)形成細胞系HNOK比較,人口腔癌細胞系HSC3、SAS、SCC15、FaDu中miR-217相對表達量顯著下調(diào)(P<0.05),而HMGA2相對表達量則顯著上調(diào)(P<0.05),見圖1。

圖1 人正常口腔角質(zhì)形成細胞與口腔癌細胞中miR-217與HMGA2表達比較

2.2 miR-217對口腔癌細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,miR-217 mimic組SAS細胞凋亡率顯著升高(P<0.05),miR-NC組細胞凋亡率則未發(fā)生顯著變化(P>0.05);與miR-217 mimic組比較,miR-217 mimic+4-PBA組細胞凋亡率顯著下降(P<0.05),見圖2。Hoechst 33342染色結(jié)果顯示,對照組和miR-NC組細胞胞核外圍輪廓清晰,染色均勻,多數(shù)為暗藍色低熒光,偶見呈亮藍色高熒光的核濃縮細胞,說明凋亡細胞較少; miR-217 mimic組細胞染色不均勻,有大量呈亮藍色高熒光,說明凋亡細胞較多;而相較于miR-217 mimic組,miR-217 mimic+4-PBA組細胞染色恢復均勻,亮藍色高熒光細胞明顯減少,說明凋亡細胞減少。見圖3。

圖2 流式細胞術(shù)檢測各組SAS細胞凋亡率

圖3 Hoechst 33342染色觀察各組SAS凋亡情況(100×)

2.3 miR-217對口腔癌細胞自噬的影響 細胞免疫熒光染色結(jié)果顯示,與對照組比較,miR-217 mimic組SAS細胞中LC3熒光強度顯著升高(P<0.05),而miR-NC組與對照組的LC3熒光強度之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與miR-217 mimic組比較,miR-217 mimic+4-PBA組SAS細胞中LC3熒光強度則又顯著下降(P<0.05)。見圖4。

圖4 細胞免疫熒光染色觀察各組SAS細胞中LC3表達(200×)

2.4 miR-217對口腔癌細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達的影響 Western Blot檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,miR-217 mimic組SAS細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與Beclin-1蛋白相對表達量均顯著上調(diào)(P<0.05),miR-NC組各蛋白表達未發(fā)生顯著變化(P>0.05);與miR-217 mimic組比較,miR-217 mimic+4-PBA組細胞中LC3-Ⅱ/LC-3Ⅰ比值與Beclin-1蛋白相對表達量均顯著下調(diào)(P<0.05),見圖5。

圖5 Western Blot檢測各組SAS細胞中自噬相關(guān)蛋白表達

2.5 miR-217對口腔癌細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)分子表達的影響 RT-qPCR和Western Blot測定結(jié)果顯示,與對照組比較,miR-217 mimic組SAS細胞中GRP78、CHOP、Caspase-12的mRNA相對表達量與蛋白相對表達量均顯著上調(diào)(P<0.05), miR-NC組則未發(fā)生顯著變化(P>0.05);與miR-217 mimic組比較,miR-217 mimic+4-PBA組細胞中GRP78、CHOP及Caspase-12的mRNA相對表達量與蛋白相對表達量均顯著下調(diào)(P<0.05),見圖6。

圖6 各組SAS細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)分子表達

2.6 miR-217與HMGA2的靶向關(guān)系檢測與驗證 經(jīng)預測發(fā)現(xiàn)HMGA2與miR-217在特定區(qū)域存在堿基互補現(xiàn)象,見圖7A。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示,與miR-NC與HMGA2 3′-UTR WT共轉(zhuǎn)染的細胞比較,miR-217 mimic和HMGA2 3′-UTR WT共轉(zhuǎn)染的細胞中熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),見圖7B。此外,Western Blot檢測結(jié)果顯示,與miR-NC組比較,miR-217 mimic組細胞中HMGA2蛋白相對表達量顯著下調(diào)(P<0.05),見圖7C。

圖7 miR-217與HMGA2靶向關(guān)系

3 討論

口腔癌的發(fā)生發(fā)展涉及多種因素,并伴有遺傳和表觀遺傳的不穩(wěn)定性。隨著新一代測序技術(shù)的廣泛應用,越來越多的研究表明,一些miRNA在口腔癌中存在差異表達,這些差異表達的miRNA可能有助于區(qū)分口腔癌患者和健康受試者。此外,一些miRNA的表達譜已證明與臨床分期、轉(zhuǎn)移和患者存活率呈正相關(guān),表明這些miRNA可被視為口腔癌的預后指標[9-10]。已知miRNA通過調(diào)節(jié)其靶基因的表達水平,參與腫瘤細胞的多種生物學過程。因此,調(diào)控癌癥中miRNA的表達作為一種新型治療策略受到了越來越多的關(guān)注。miR-24-3p、miR-155-5p和miRNA-10a促進口腔癌細胞的增殖[11-13],沉默這些miRNA的表達可能會阻止口腔癌的進展。相反,許多miRNA具有抗癌功能,例如miR-6887-5p與miR-34a-5p能夠抑制口腔癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[14-15],過表達這些miRNA能夠發(fā)揮抗癌作用。

本研究經(jīng)檢測人正常口腔角質(zhì)形成細胞系HNOK與人口腔癌細胞系HSC3、SAS、SCC15、FaDu中miR-217表達水平,結(jié)果顯示其在口腔癌細胞中的相對表達量顯著下調(diào),提示miR-217低表達可能與口腔癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Jiang等[5]研究表明miR-217可通過調(diào)節(jié)靶向調(diào)節(jié) sirtuin 1進而調(diào)控P53/KAI1軸抑制非小細胞肺癌的細胞增殖、遷移和侵襲,阻止非小細胞肺癌腦轉(zhuǎn)移過程。Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn)miR-217在 40例胃癌患者的腫瘤組織及腫瘤轉(zhuǎn)移組織中表達下降,并通過靶向PTPN14抑制胃癌細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。miR-217在宮頸癌組織及細胞系中表達下降,提高其表達水平能夠抑制宮頸癌細胞的遷移和侵襲,并促進細胞凋亡[7]。由此可見,miR-217可能在抑制包括口腔癌在內(nèi)的多種腫瘤中發(fā)揮重要作用。

自噬是一個高度調(diào)節(jié)的過程,涉及細胞溶質(zhì)成分、長壽命蛋白質(zhì)或受損細胞器的更新。作為一種假定的適應性分解代謝過程,自噬在營養(yǎng)剝奪期間被激活,以促進細胞存活。然而,越來越多的證據(jù)表明,在某些情況下過度的自噬水平對細胞凋亡至關(guān)重要,在細胞發(fā)生凋亡的同時,常也伴隨著自噬,兩者之間存在一定的相互作用關(guān)系[17]。本研究在口腔癌細胞轉(zhuǎn)染miR-217 mimic后,經(jīng)實驗檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-217 mimic的細胞凋亡增加,細胞中自噬標志物LC3蛋白熒光強度增強,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與Beclin-1蛋白表達水平均升高,由此推斷,miR-217能夠促進口腔癌細胞的自噬與凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種不可或缺的真核細胞器,控制蛋白質(zhì)的生物合成和運輸,并維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。許多因素包括蛋白質(zhì)降解、鈣失衡、缺氧和細胞氧化還原調(diào)節(jié),都會影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)并觸發(fā)未折疊蛋白反應的保護機制,該機制旨在維持細胞存活并幫助重建穩(wěn)態(tài)。然而,但當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)承受壓力過強或外界刺激持續(xù)時間過長時,出發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路變?yōu)榧毎蛲鐾?誘導細胞死亡[18]。GRP78是參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的標志蛋白,其提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā)生,當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激激活時間延長時,通過促進CHOP和Caspase-12的表達引發(fā)細胞凋亡[19]。本研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-217 mimic的口腔癌細胞內(nèi)GRP78、CHOP、Caspase-12的mRNA與蛋白表達水平均升高,而轉(zhuǎn)染miR-217 mimic同時采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-PBA處理的口腔癌細胞中不僅GRP78、CHOP、Caspase-12表達下降,LC3蛋白熒光強度、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1蛋白表達也均下降,且細胞凋亡減少,這一結(jié)果表明miR-217可能通過觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑促進口腔癌細胞的自噬與凋亡。

為了進一步研究miR-217抑制口腔癌的分子機制,本研究通過生物信息學在線工具進行預測發(fā)現(xiàn)HMGA2與miR-217在特定區(qū)域存在堿基互補現(xiàn)象。而進一步雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚖estern Blot驗證了兩者的靶向關(guān)系,揭示了miR-217負調(diào)控HGMA2表達。HGMA2在胚胎發(fā)育過程中參與細胞增殖和分化,此外,還有多項研究已經(jīng)證實HMGA2在惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達,這可能在腫瘤的發(fā)生與進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用,并與患者的預后不良密切相關(guān),而下調(diào)其表達能抑制腫瘤發(fā)生與發(fā)展[20-22],因此可作為一個潛在的腫瘤治療靶點。

4 結(jié)論

miR-217可通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑,進一步誘導自噬與凋亡通路,從而誘導口腔癌細胞凋亡,且miR-217的該作用可能與其靶向調(diào)控HGMA2表達相關(guān)。然而,本研究針對口腔癌中miR-217的機制進行了體外實驗初探,其詳細功能機制仍有待于進一步挖掘。