李光興 ，張韻梅 ，劉程靜 ，王偉濤 ，趙 凱

（1）云南鑒識(shí)司法鑒定中心，云南 芒市 678400;2）楚雄彝族自治州公安局刑偵支隊(duì)，云南 楚雄 675000）

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）是核心序列為2～6 個(gè)堿基（base pair，bp）的短重復(fù)序列，約占人類(lèi)基因組的3%，重復(fù)單位的數(shù)量在個(gè)體之間變化很大，結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)，可以一次性檢測(cè)多熒光標(biāo)記的不同基因座，具有高靈敏度、高檢測(cè)通量、高種屬特異性和易于實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于個(gè)人識(shí)別以及親權(quán)鑒定案件中。目前，我國(guó)已經(jīng)有多項(xiàng)司法鑒定技術(shù)規(guī)范用于指導(dǎo)鑒定工作的開(kāi)展，建設(shè)少數(shù)民族人群DNA 數(shù)據(jù)庫(kù)，可以為法醫(yī)物證檢案提供可靠、有效的數(shù)據(jù)來(lái)源。

阿昌族和德昂族是聚居于云南邊境的人口較少的少數(shù)民族，在2010 年阿昌族總?cè)丝跒?9 555人，主要聚居于中國(guó)云南省德宏傣族景頗族自治州，緬甸也有部分阿昌族（峨昌人）人群分布，屬于典型的跨境民族。阿昌族源于古代氐羌族群，在12 世紀(jì)末13 世紀(jì)初，“阿昌”這一明確族稱(chēng)便已出現(xiàn)在漢文歷史文獻(xiàn)中，史籍中的“峨昌”“娥昌”“莪昌” “阿昌”或“萼昌”等是不同時(shí)期中央王朝對(duì)阿昌族的稱(chēng)謂。阿昌族雖有自己的語(yǔ)言但沒(méi)有文字，語(yǔ)言屬漢藏語(yǔ)系藏緬語(yǔ)族緬語(yǔ)支，分為梁河、隴川、潞西3 種方言[1]。2010年德昂族總?cè)丝跒?0 556 人，比較集中的聚居在保山市（保山地區(qū)），潞西市、瑞麗市、盈江縣、隴川縣、梁河縣（德宏州），永德縣、鎮(zhèn)康縣、耿馬傣族佤族自治縣（臨滄地區(qū)）。德昂族淵源可追溯到古代的濮人，是西南邊疆最古老的民族之一。清代史書(shū)稱(chēng)之為“崩龍”，新中國(guó)成立后民族識(shí)別時(shí)沿用了這個(gè)名稱(chēng)。根據(jù)德昂族人民的意愿，1985 年更名為“德昂族”[2]。德昂族人民世代居住在云南西部的高黎貢山和怒山山脈的廣大山區(qū)，是一個(gè)典型的大分散小聚居的民族，雖然人數(shù)不多卻散居在云南省3 個(gè)地州9 個(gè)縣市。德昂族沒(méi)有本民族文字，語(yǔ)言屬于南亞語(yǔ)系孟高棉語(yǔ)族佤德昂語(yǔ)支，分為“布雷”、“汝買(mǎi)”、“若進(jìn)”3 種方言。

因阿昌族和德昂族前期無(wú)常染色體STR 基因座調(diào)查報(bào)道，此調(diào)查預(yù)期為云南省阿昌族和德昂族人群的法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別和親子鑒定以及群體遺傳學(xué)研究提供基礎(chǔ)常染色體STR 數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本

根據(jù)知情同意原則，收集154 例阿昌族和405 例德昂族無(wú)關(guān)個(gè)體的指尖末梢血，用中性濾紙制成血濾紙樣本。

1.2 DNA 提取、擴(kuò)增及檢測(cè)

采用打孔器取1.2 mm 直徑的血濾紙片放入PCR 擴(kuò)增管中，PCR 擴(kuò)增采用Goldeneye? 20A試劑盒（中國(guó)基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司），總反應(yīng)體系 10 μL，在9700 型PCR 儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）上進(jìn)行直接復(fù)合擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95℃ 2 min，94℃ 15 s、61℃ 40 s、65℃ 50 s、30 個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。取1 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物 0.5 μL內(nèi)標(biāo)SIZ500 和9.5 μL 去離子甲酰胺混合，3130基因分析儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）上進(jìn)行全自動(dòng)毛細(xì)管電泳，用 GeneMapper?ID-X軟件進(jìn)行等位基因分型。選擇F312（蘇州閱微基因技術(shù)有限公司）為陽(yáng)性質(zhì)控品，純化水為陰性質(zhì)控品。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 Powerstates 軟件[3]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到 19 個(gè) STR 基因座的等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、個(gè)人識(shí)別率（DP）、非父排除率（PE）、觀察雜合度（Ho）等參數(shù)。使用Arlequin 3.5 軟件[4]進(jìn)行基因座間連鎖不平衡檢驗(yàn)（哈溫平衡檢驗(yàn)）。應(yīng)用dispan 軟件計(jì)算阿昌族和德昂族與其他8 個(gè)群體（山西運(yùn)城漢族[5]、浦東漢族[6]、哈薩克族[7]、傣族[8]、哈尼族[9]、彝族[10]、納西族[11]和云南回族[12]），利用MEGA 11 軟件[13]基于DA distances構(gòu)建鄰接法（Neighbor-Joining Algorithm）進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 等位基因頻率分布及群體遺傳學(xué)參數(shù)本研究

在云南省154 名阿昌族無(wú)關(guān)個(gè)體共觀察到184 個(gè)等位基因，頻率分布在0.003 2～0.571 4（表1）；405 名德昂族無(wú)關(guān)個(gè)體共觀察到212 個(gè)等位基因，頻率分布在0.001 2～0.556 8（表1）。經(jīng)過(guò)Bonferroni 矯正，基因型分布均符合哈溫平衡（P＞ 0.002 6）。阿昌族人群Ho 值分布在0.558 4～0.876 6，德昂族人群Ho 值分布在0.590 1～0.886 4。阿昌族人群中D6S1043 和Penta E為高多態(tài)性基因座（PIC ＞ 0.85），德昂族人群中D6S1043、Penta E和FGA為高多態(tài)性基因座（PIC ＞ 0.85），TPOX基因座為兩民族人群識(shí)別能力最差位點(diǎn)。阿昌族人群DP 值在0.786 6～0.979 2，累積個(gè)體識(shí)別率（CDP）達(dá)到0.999 999 999 999 999 999 999 9。德昂族人群DP 值在0.775 0～0.982 3，累積個(gè)體識(shí)別率達(dá)到0.999 999 999 999 999 999 999 992 4。阿昌族人群PE 值在0.243 9～0.748 0，三聯(lián)體累積非父排除率（CPE）達(dá)到0.999 999 964；德昂族人群PE 值在0.279 2～0.767 8，三聯(lián)體累積非父排除率達(dá)到0.999 999 955，見(jiàn)表2，表3。

表1 阿昌族（n=154）和德昂族（n=405）群體 19 個(gè) STR 等位基因頻率分布Tab.1 Frequency distribution of 19 STR alleles in Achang（n=154）and De’ang（n=405）

表2 阿昌 族人群19 個(gè) STR 基因座法醫(yī)學(xué)參數(shù)（n=154）Tab.2 Forensic parameters of 19 STR loci in Achang population（n=154）

表3 德昂族人群19 個(gè) STR 基因座法醫(yī)學(xué)參數(shù)（n=405）Tab.3 Forensic parameters of the 19 STR loci in the De’ang population（n=405）

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

阿昌族和德昂族人群與白族、傣族、納西族等8 個(gè)人群14 個(gè)常染色體STR 基因座鄰接法進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖1 和表4。除云南回族人群外，其他的云南少數(shù)民族聚為一大類(lèi)，德昂族和傣族聚為一類(lèi)，阿昌族和同屬于漢藏語(yǔ)系的哈尼族、彝族和納西族聚集成樹(shù)。

圖1 基于DA distances 構(gòu)建鄰接法進(jìn)化樹(shù)。Fig.1 Construction of neighbour-joining method evolutionary tree based on DA distances.

表4 阿昌族、德昂族與其他8 個(gè)人群的Standard genetic distances 和Standard errorTab.4 Standard genetic distances and Standard error of Achang，De’ang and other 8 populations

3 討論

在法醫(yī)物證學(xué)實(shí)踐中，基于毛細(xì)管電泳的STR 分型技術(shù)，因其高度的檢測(cè)效能，在往后很長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，仍然會(huì)是法醫(yī)物證學(xué)鑒定的主要工具。對(duì)不同人群進(jìn)行基礎(chǔ)的STR 基因頻率調(diào)查，有益于試劑盒在對(duì)應(yīng)人群的適用性。本次調(diào)研，所有基因座的基因型分布均符合哈溫平衡，說(shuō)明采樣符合隨機(jī)性要求，同時(shí)各基因座間相互獨(dú)立。按 DP ≥ 0.9、H ≥ 0.7、PIC ≥ 0.7 的 STR 基因座屬高度多態(tài)性基因座的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量，vWA、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、D2S1338、D19S433、Penta D、Penta E、D6S1043、D12S391 屬高鑒別能力的基因座，TPOX、TH01、CSF1PO 和D3S1358 基因座多態(tài)性和識(shí)別能力較差。根據(jù)乘積原則，Goldeneye? 20A 試劑盒在阿昌族和德昂族人群中具有較高的個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定的系統(tǒng)效能（CDP ＞ 0.999 999 999、CPE ＞ 0.999 999）。根據(jù)本調(diào)查結(jié)果，亦提示對(duì)于阿昌族和德昂族人群的鑒定STR 基因座個(gè)數(shù)建議≥19 個(gè)，以保證識(shí)別能力。

本研究所調(diào)查的阿昌族和德昂族群體是屬于云南特有、人口較少的少數(shù)民族，主要聚居于德宏州，并少量分布于緬甸，屬于典型的跨境民族。云南省作為我國(guó)少數(shù)民族組成最為豐富省份，對(duì)各民族人群的遺傳多態(tài)性和群體遺傳關(guān)系進(jìn)行調(diào)查有助于個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定的識(shí)別應(yīng)用?；趫D1 鄰接法進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建結(jié)果，雖然阿昌族和德昂族的聚居地都以德宏州為主，兩者之間的遺傳距離還是有一定的差異，可以按照語(yǔ)系進(jìn)行聚類(lèi)，此結(jié)果與宇克莉等[14]報(bào)道的Heath-Carter 人體體型數(shù)據(jù)分析有一定的差異，提示了環(huán)境在表觀遺傳學(xué)中的作用。根據(jù)郭薇霞[15]對(duì)云南少數(shù)民族異常血紅蛋白分析，發(fā)現(xiàn)39%阿昌族人群攜帶異常血紅蛋白，且阿昌族和德昂族的異常血紅蛋白突變有一致性，考慮與當(dāng)?shù)毓糯懠矀鞑サ倪x擇壓力有關(guān)，也提示了兩個(gè)民族在一定程度有基因的交流。

19 個(gè) STR 基因座在云南省阿昌族和德昂族人群中具有高度多態(tài)性，聯(lián)合使用具有較高的識(shí)別能力，可用于該人群法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別和親子鑒定。本研究數(shù)據(jù)亦可用于群體遺傳學(xué)研究。