馮芷倩，鮑春梅，汪海燕，楊濤，唐莉莉，徐若男*，王福生*

1南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510515；2解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染病醫(yī)學(xué)部/國家感染性疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100039；3解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科，北京 100039；4中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部附屬第一醫(yī)院，安徽合肥 230001

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一類嗜肝DNA 病毒，慢性HBV 感染可引起廣泛的肝臟疾病，增加患者進(jìn)展為肝硬化、肝癌的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。目前，慢性HBV感染仍是全球重大的公共衛(wèi)生問題之一，我國現(xiàn)存HBV攜帶者數(shù)量超過9700萬[3-4]。天然免疫細(xì)胞在HBV病毒學(xué)控制、病毒抗原遞呈、肝細(xì)胞特異/非特異損傷及修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用[5-7]。中性粒細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中占比最大的細(xì)胞群體，具有強(qiáng)大的抗感染及免疫調(diào)節(jié)潛能。近年來，越來越多的研究證實(shí)中性粒細(xì)胞在病毒性疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[8-9]。人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染過程中，中性粒細(xì)胞是保護(hù)機(jī)體抵抗HIV 感染及控制病毒傳播的重要介質(zhì)，中性粒細(xì)胞功能紊亂與感染風(fēng)險(xiǎn)增高、T細(xì)胞免疫耗竭、炎性損傷增加等環(huán)節(jié)密切相關(guān)[10]。但在HBV感染過程中，中性粒細(xì)胞功能變化與HBV病毒學(xué)應(yīng)答之間的關(guān)系尚未完全闡明。

中性粒細(xì)胞肝內(nèi)大量浸潤、功能失衡可能是導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷及HBV 病毒持續(xù)復(fù)制的重要原因[11]。各類細(xì)胞因子、活性氧(reactive oxygen species，ROS)等是中性粒細(xì)胞發(fā)揮功能的主要效應(yīng)分子。盡管中性粒細(xì)胞的激活有利于抗病毒免疫，但其不當(dāng)和(或)長期激活可對宿主產(chǎn)生不利影響[12]。ROS 既是信號分子，也是炎癥反應(yīng)的中介物，而中性粒細(xì)胞是ROS 產(chǎn)生的主要來源[12]。目前關(guān)于慢性乙肝發(fā)病過程中中性粒細(xì)胞ROS 產(chǎn)生特點(diǎn)的研究較少。本研究檢測慢性HBV感染患者外周血中性粒細(xì)胞ROS的生成水平，分析ROS水平與HBV相關(guān)臨床指標(biāo)的關(guān)系，并探討了影響中性粒細(xì)胞ROS分泌的可能原因。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2022年4-9月在解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心確診為慢性HBV感染的患者88例，均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019 年版)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)、丁型肝炎病毒(hepatitis D virus，HDV)或HIV等病毒感染或細(xì)菌感染。(2)合并自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、藥物性肝炎，脂肪肝等非HBV病毒性肝炎。(3)伴有其他嚴(yán)重身心疾病、感染、既往有肝硬化病史或入組篩選行影像學(xué)檢查時提示存在明確肝硬化。(4)合并發(fā)熱。(5)既往有腫瘤疾病史。(6)妊娠女性、精神疾病患者，或研究者認(rèn)為存在不適宜入組的其他情況。根據(jù)患者治療情況，將其中58例未接受抗病毒治療者歸入未治療組，30例接受6 個月以上核苷(酸)類似物(NAs)抗病毒治療者歸入治療組。另選取20名健康人作為對照組。本研究經(jīng)解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心倫理委員會批準(zhǔn)(審批號：KY-2022-6-42-1)，所有入組對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料獲取 通過查詢病例資料，收集研究對象的性別、年齡、既往病史、化驗(yàn)檢查結(jié)果[如肝功能、血常規(guī)、HBV DNA 載量、乙肝表面抗原(HBsAg)定量]等臨床資料。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測中性粒細(xì)胞RO S分泌功能采集對照組以及未治療組和治療組患者肘靜脈血10 ml 于EDTA 抗凝管中，檢測外周血中性粒細(xì)胞自發(fā)及繼發(fā)ROS 水平。步驟如下：各取100 μl 全血分別裝入3支流式管中，置于冰水浴中10 min，充分冷卻至0 ℃。其中一管加入0.2 μl 二氫羅丹明123(dihydrorhodamine 123，DHR 123，美國AAT Bioquest公司)，混勻后于37 ℃孵育10 min；另一管不加DHR 123 作為熒光減一對照(fluorescence minus one，F(xiàn)MO)；剩余一管加入100 ng/ml 脂多糖(LPS)，渦旋混勻后立即置于37 ℃水浴鍋中孵育10 min，再加入0.2 μl DHR 123，混勻后繼續(xù)于37 ℃孵育10 min。加入磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，以1300 r/min 離心5 min，棄上清，用PBS 溶液100 μl 重懸細(xì)胞。3管中均加入抗CD66b-PE-Cy7 抗體(美國Biolegend 公司)對全血進(jìn)行表型染色，混合均勻后置于室溫避光孵育30 min。加入2 ml 溶血素，充分混勻后避光靜置5 min，以1500 r/min離心5 min，棄上清后重懸細(xì)胞。加入1 ml PBS 再次進(jìn)行洗滌后，棄上清，重懸細(xì)胞，隨 后 加 入1% 多 聚 甲 醛300 μl 固 定。 用FACSymphonyTMA5 流式細(xì)胞儀檢測中性粒細(xì)胞ROS產(chǎn)生的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)，應(yīng)用FlowJo軟件分析流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。

1.2.3 HepG2.2.15 和HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)及上清液收集 HepG2.2.15 及HepG2 細(xì)胞均由解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心提供，將此兩種細(xì)胞接種于含10%胎牛血清+1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，在25 cm2培養(yǎng)瓶中于37 ℃、5%CO2、95%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以胰蛋白酶消化后傳代。培養(yǎng)3 d 后，常溫下以1000 r/min 離心5 min，去除細(xì)胞雜質(zhì)后，收集上清液備存。

1.2.4 中性粒細(xì)胞分離純化 使用EDTA 抗凝真空采血管無菌采集健康人外周靜脈血10 ml，以2000 r/min離心10 min，去除上層血漿，取剩余血細(xì)胞，用等量PBS 混懸，并用巴氏滴管輕柔吹吸。取15 ml 離心管，底部加入Ficoll-Paque PLUS 淋巴細(xì)胞分離液5 ml。用巴氏滴管吸取血細(xì)胞混合液后，緩慢平鋪于淋巴分離液上層。配平后放入離心機(jī)中，以2500 r/min 離心20 min。離心后的液體分為4 層，留取粒細(xì)胞及紅細(xì)胞層，用等量生理鹽水混勻，加入1/3 體積量的紅細(xì)胞沉降液混勻并常溫靜置30 min。取靜置后紅細(xì)胞層分界線上層液體，加入生理鹽水洗滌細(xì)胞，以1200 r/min 離心5 min。中性粒細(xì)胞震蕩后，加入0.2% NaCl溶液2 ml以裂解紅細(xì)胞，30 s 后加入1.6% NaCl 溶液2 ml 終止，另適量補(bǔ)充生理鹽水洗滌細(xì)胞，以1200 r/min 離心5 min 后，棄上清，依據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入DMEM完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，稀釋計(jì)數(shù)，以備檢測中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS生成水平。

1.2.5 中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS 生成水平檢測 吸取1.5×106/ml 的純化健康人中性粒細(xì)胞500 μl，均勻鋪至24孔板內(nèi)。將中性粒細(xì)胞分別與DMEM完全培養(yǎng)基，25%、50%濃度的HepG2及HepG2.2.15細(xì)胞上清液共孵育12 h。收集中性粒細(xì)胞，檢測其自發(fā)ROS的生成水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以xˉ±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析。非正態(tài)分布計(jì)量資料以M(Q1，Q3)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組一般資料比較 各組性別、年齡及白細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。未治療組ALT 及AST 均高于治療組及對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。未治療組HBV DNA 載量、HBsAg 定量均高于治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，表1)。

表1 各組一般資料比較Tab.1 Comparison of general information among each group of the enrolled patients

2.2 各組中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS生成水平比較 未治療組中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS 生成水平高于對照組(P＜0.05)。對照組與治療組間、未治療組與治療組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1A、B、C)。HBV DNA載量≥3.3 log10IU/ml患者的中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS生成水平高于HBV DNA 載量＜3.3 log10IU/ml 的患者(P＜0.01)，并 明 顯 高 于 治 療 組 及 對 照 組(P＜0.05，圖1D)。HBsAg≥3 log10IU/ml 患者的中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS 生成水平明顯高于治療組及對照組(P＜0.05，圖1E)。

圖1 外周血中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS生成水平流式分析結(jié)果Fig.1 Flow cytometry analysis of the spontaneous ROS production levels in peripheral blood neutrophils

2.3 慢性HBV感染患者中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS生成水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系 HBV 感染未治療組患者中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS生成水平與HBV DNA載量(r=0.315，P=0.016)及HBsAg定量水平(r=0.326，P=0.013)呈正相關(guān)，與ALT(r=0.097，P=0.469)、AST(r=0.128，P=0.338)、WBC(r=0.151，P=0.258)無相關(guān)性（圖2）。未治療組58例患者中共有18例進(jìn)行了CRP檢測，其CRP水平與中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS生成水平無相關(guān)性(r=-0.222，P=0.377，圖2)。HBV感染治療組患者中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS 生成水平與HBV DNA 載量、HBsAg 定量水平、ALT、AST、WBC及CRP均無相關(guān)性(P＞0.05)。2.4 HepG2.2.15細(xì)胞上清液對中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS生成水平的影響 與完全培養(yǎng)基孵育的中性粒細(xì)胞相比，包含HBV病毒的HepG2.2.15細(xì)胞上清液能明顯上調(diào)中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS 的生成水平，且呈劑量依賴性(P＜0.05)。而不同濃度HepG2 細(xì)胞上清液孵育后中性粒細(xì)胞的自發(fā)ROS 生成水平無明顯變化(P＞0.05)。同時，25%濃度的HepG2.2.15 細(xì)胞上清液孵育后中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS 生成水平高于25%濃度的HepG2 細(xì)胞上清液孵育(P＜0.01)；50%濃度的HepG2.2.15細(xì)胞上清液孵育后中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS 生成水平高于50%濃度HepG2細(xì)胞上清液孵育(P＜0.01，圖3)。

圖2 慢性HBV感染未治療組患者中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS生成水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between the spontaneous ROS production levels of neutrophils and clinical indicators in patients with chronic HBV infection without treatment

圖3 HepG2.2.15細(xì)胞上清液影響中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS生成水平流式分析Fig.3 Flow cytometry analysis of the effect of HepG2.2.15 cell supernatant on the spontaneous ROS production level of neutrophils

2.5 LPS 刺激后慢性HBV 感染患者中性粒細(xì)胞繼發(fā)ROS 生成能力比較 慢性HBV 感染患者治療組及未治療組的中性粒細(xì)胞經(jīng)LPS 刺激后，其繼發(fā)ROS 生成水平均較對照組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。未治療組及治療組患者中性粒細(xì)胞繼發(fā)ROS生成水平與HBV DNA 載量、HBsAg 定量水平、WBC、CRP、ALT及AST均無相關(guān)性(P＞0.05)。

圖4 LPS刺激后各組外周血中性粒細(xì)胞ROS生成水平比較Fig.4 Comparison of ROS production levels in peripheral blood neutrophils among groups after LPS stimulation

3 討 論

適應(yīng)性免疫細(xì)胞在控制HBV感染中起著至關(guān)重要的作用，然而越來越多的研究證實(shí)天然免疫細(xì)胞能夠感知HBV 并對之產(chǎn)生應(yīng)答。在HBV 感染期間，適應(yīng)性免疫的相關(guān)研究結(jié)果尚不能完全解釋持續(xù)存在的HBV感染及肝臟免疫病理學(xué)損傷。有效、協(xié)調(diào)的天然和適應(yīng)性免疫反應(yīng)有助于機(jī)體清除HBV并促進(jìn)宿主持久免疫的形成。對慢性HBV感染期間天然免疫的研究有助于進(jìn)一步了解宿主復(fù)雜的免疫反應(yīng)，并設(shè)計(jì)新的干預(yù)策略。

慢性HBV 感染可改變機(jī)體肝臟及循環(huán)微環(huán)境，繼而導(dǎo)致免疫細(xì)胞功能、表型的改變[6]。多種天然免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞的頻率、功能及表型改變，與適應(yīng)性免疫間的相互作用及對HBV 控制的作用已被報(bào)道[14]。近年來的研究證實(shí)，中性粒細(xì)胞能夠感知病毒并通過功能及表型的改變發(fā)揮抗病毒或促進(jìn)病毒的雙重作用[7]。此外，研究表明天然免疫細(xì)胞的活化與HBV感染患者肝損傷及纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，且慢性乙型肝炎患者肝臟中性粒細(xì)胞浸潤明顯增加[11]，提示中性粒細(xì)胞活化可能會促進(jìn)HBV感染患者肝臟免疫病理學(xué)進(jìn)展。目前，中性粒細(xì)胞在HBV感染中表型及功能的變化特點(diǎn)尚未見詳細(xì)報(bào)道。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測慢性HBV感染患者中性粒細(xì)胞ROS 的生成能力，結(jié)果表明，未進(jìn)行抗病毒治療的慢性HBV感染患者中性粒細(xì)胞存在基礎(chǔ)性活化，其自發(fā)ROS 生成能力增加。中性粒細(xì)胞通過生成ROS 發(fā)揮抗菌及抗病毒作用，但不當(dāng)?shù)腞OS生成又會加重組織損害[15-16]。ROS 的過度蓄積可能是促進(jìn)機(jī)體炎性反應(yīng)、引起局部組織損傷的重要原因[12，16]。

丙型肝炎患者中性粒細(xì)胞存在功能障礙，抗病毒治療有助于恢復(fù)其中性粒細(xì)胞功能[17]。本研究結(jié)果表明，未經(jīng)抗病毒治療的患者中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS 生成水平較對照組增高。進(jìn)一步將未治療組患者依據(jù)HBV DNA 載量及HBsAg 定量水平進(jìn)行分層分析發(fā)現(xiàn)，HBV DNA≥3.3 log10IU/ml 及HBsAg≥3 log10IU/ml者中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS 生成水平均明顯升高，且中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS 生成能力與HBV DNA 載量及HBsAg定量呈正相關(guān)。而在HBV DNA＜3.3 log10IU/ml、HBsAg＜3 log10IU/ml及接受抗病毒治療的患者中，中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS 生成水平未明顯升高，提示HBV的存在是中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS生成活躍的重要原因。同時，未治療組及治療組患者中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS生成水平與WBC、CRP 無相關(guān)性，這可能與篩選患者時排除了炎癥水平波動者有關(guān)。此外，無論是未治療組還是治療組患者，均未發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS 生成水平與肝臟炎癥指標(biāo)ALT、AST 存在相關(guān)性，可能與外周血中性粒細(xì)胞功能不能完全反映肝臟內(nèi)中性粒細(xì)胞功能有關(guān)，尚需進(jìn)一步通過肝臟組織原位ROS 檢測進(jìn)行驗(yàn)證。中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS在HBV 感染者體內(nèi)的生成增加是有助于機(jī)體清除病毒還是介導(dǎo)肝臟的損傷及病理進(jìn)展尚需進(jìn)一步探究。本研究發(fā)現(xiàn)，未治療組及治療組患者中性粒細(xì)胞經(jīng)LPS 刺激后繼發(fā)ROS 生成水平均低于對照組，提示抗病毒治療降低病毒的同時不能有效恢復(fù)中性粒細(xì)胞繼發(fā)ROS 的生成能力。此外，本研究發(fā)現(xiàn)未治療組及治療組患者中性粒細(xì)胞經(jīng)LPS 刺激后繼發(fā)ROS生成水平與HBV DNA 載量、HBsAg 定量水平、WBC、CRP、ALT及AST不存在相關(guān)性。研究表明，HBeAg 及HBcAg 能夠有效抑制中性粒細(xì)胞ROS 的繼發(fā)生成能力[18]，因此HBV 感染者機(jī)體存在的HBeAg及HBcAg 可能是影響中性粒細(xì)胞ROS 繼發(fā)生成能力的主要原因之一，具體機(jī)制仍需要深入探究。

HepG2.2.15 細(xì)胞上清液含有HBV 病毒顆粒及相關(guān)蛋白，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)HepG2.2.15 上清可明顯提高中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS 生成水平，而不含HBV 病毒顆粒及蛋白的HepG2 上清無類似效應(yīng)，提示HBV病毒顆粒及蛋白的存在可能影響中性粒細(xì)胞ROS 的生成。慢性HBV感染患者中性粒細(xì)胞內(nèi)存在HBV DNA的富集[19]，同時中性粒細(xì)胞表達(dá)多種模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)以識別病毒顆粒及蛋白，Toll 樣受體(Toll-like receptors，TLR)作為病毒感染過程中最為重要的一種PRRs，可感知HBeAg、HBcAg 的刺激信息[5，20-21]，進(jìn)而影響中性粒細(xì)胞趨化、ROS 生成、細(xì)胞凋亡及中性粒細(xì)胞捕 獲 網(wǎng)(neutrophil extracellular traps， NETs) 的 水平[18，22]。研究顯示，中性粒細(xì)胞可表達(dá)除TLR3以外幾乎所有的TLR，且TLR 的激動與ROS 的生成密切相關(guān)[23-25]。鑒于中性粒細(xì)胞本身的異質(zhì)性及TLR 表達(dá)的多樣性，不同TLR感知HBV病毒顆粒及蛋白刺激的能力存在明顯差異。例如，TLR-9 可感知HBV病毒顆粒的刺激，TLR-2 可明確感知e 抗原的刺激。本研究存在一定局限性。例如，納入患者中僅有部分進(jìn)行了CRP 檢測，無法更好地闡明CRP 與中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS生成水平的相關(guān)性；此外，在HBV感染過程中，病毒顆粒及相關(guān)蛋白可能直接影響中性粒細(xì)胞ROS 的生成，但本研究未進(jìn)一步對病毒顆粒及HBV相關(guān)蛋白進(jìn)行區(qū)分，以明確其對中性粒細(xì)胞自發(fā)及繼發(fā)ROS 生成能力的影響；且本研究為橫斷面研究，中性粒細(xì)胞ROS生成水平變化在HBV感染期間發(fā)揮的具體作用仍需通過建立縱向隊(duì)列進(jìn)一步深入探討。

綜上所述，病毒學(xué)陽性的慢性HBV感染患者中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS 生成水平升高，抗病毒治療在降低病毒載量的同時，還能逆轉(zhuǎn)中性粒細(xì)胞自發(fā)ROS生成，但不能有效恢復(fù)LPS 刺激后中性粒細(xì)胞ROS的表達(dá)，提示中性粒細(xì)胞對抗病毒治療存在應(yīng)答響應(yīng)，但其功能異常在HBV 感染過程中仍持續(xù)存在。了解中性粒細(xì)胞與宿主免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系，有助于進(jìn)一步解析HBV感染的免疫學(xué)機(jī)制。