郭海閣

(商丘市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科,河南 商丘 476000)

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是消化內(nèi)科常見(jiàn)疾病,20%～30%的AP患者會(huì)發(fā)展為重癥AP,增加預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)[1]。隨著重癥支持治療技術(shù)的發(fā)展,AP患者多器官衰竭病死率逐步降低,而AP患者易位感染病死率仍居高不下[2-3]。腸道菌群是腸道內(nèi)微生物總稱,是腸道生物屏障的重要組成部分,在免疫成熟、腸道屏障等方面有重要作用[4]。動(dòng)物研究顯示,腸道菌群結(jié)構(gòu)、多樣性與重癥AP之間存在密切聯(lián)系,且可提示AP炎癥反應(yīng)強(qiáng)度[5]。本研究通過(guò)觀察AP患者腸道菌群變化情況,分析腸道菌群變化與AP易位感染的關(guān)系,旨在指導(dǎo)未來(lái)評(píng)估AP患者易位感染風(fēng)險(xiǎn)與早期干預(yù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取商丘市中心醫(yī)院2018年7月至2020年2月收治的182例AP患者,男92例,女90例,年齡26～54(40.31±5.33)歲,體重指數(shù)(body mass index,BMI)17.2～24.9(21.25±1.96)kg·m-2。病因:膽源性81例,脂源性35例,酒精性56例,其他10例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者及家屬均知情且簽署同意書(shū)。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

(1)納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《急性胰腺炎診治指南(2014版)》[6]中AP診斷標(biāo)準(zhǔn);②經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查提示血清淀粉酶水平≥正常上限3倍;③發(fā)病至入院時(shí)間≤1周。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①合并心、肝、腎等重要器官功能異常;②合并惡性腫瘤;③合并其他感染性疾病;④合并免疫系統(tǒng)疾病;⑤合并血液系統(tǒng)疾病;⑥入院前2周使用抗生素或益生菌。

1.3 方法

1.3.1AP易位感染評(píng)估及分組

于患者入院后參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[7]評(píng)估AP易位感染發(fā)生情況,AP患者伴有發(fā)熱、腹痛等表現(xiàn),胰周壞死組織或血液檢查等提示細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)陽(yáng)性,且影像學(xué)檢查提示胰周有氣體或空泡。將符合上述標(biāo)準(zhǔn)AP患者納為易位感染組,反之納為無(wú)感染組。

1.3.2腸道菌群檢查

于患者入院后收集200 mg糞便標(biāo)本置于無(wú)菌管內(nèi),存儲(chǔ)在-80 ℃環(huán)境下待檢;將200 mg糞便標(biāo)本轉(zhuǎn)移至2 mL離心管(1號(hào))中,于管內(nèi)滴加1.6 mL Buffer ASL溶液,充分搖勻后,置于70～95 ℃熱水中水浴5 min,以14 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心2 min,吸取上層清液放置另一2 mL離心管(2號(hào))內(nèi);于放置清液離心管內(nèi)加入inhibit EX藥片,震蕩至溶解后放于室溫下靜置2 min,然后以14 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心3 min,吸取上層清液轉(zhuǎn)移至另一2 mL離心管(3號(hào))中,并再次以14 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心3 min;吸取15 μL proteaseK溶液置于1.5 mL離心管(4號(hào))中,于離心管內(nèi)滴加200 μL上一步2 mL離心管內(nèi)清液,再滴加200 μL Buffer ASL溶液,充分搖勻后震蕩1 min;將4號(hào)離心管于95 ℃熱水中水浴10 min后,滴加200 μL無(wú)水乙醇,并震蕩搖勻;將4號(hào)離心管內(nèi)溶液轉(zhuǎn)移至離心管管柱內(nèi),以14 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心1 min,然后再將離心管柱內(nèi)溶液轉(zhuǎn)移至另一2 mL離心管(5號(hào))中,滴加500 μL Buffer AW1溶液,以14 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心1 min,再將離心管柱置于2 mL離心管(6號(hào))內(nèi);于6號(hào)離心管內(nèi)滴加500 μL Buffer AW2溶液,以14 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心1 min,再將離心管柱置于1.5 mL離心管中(7號(hào))內(nèi),于離心管內(nèi)滴加200 μL Buffer AE溶液,于室溫下靜置1 min,以14 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心1 min,得到糞便DNA,置于-80 ℃環(huán)境下儲(chǔ)存、待檢;對(duì)腸道菌群進(jìn)行熒光定量分析,細(xì)菌數(shù)量按照聚合酶鏈反應(yīng)定量結(jié)果取對(duì)數(shù)后,以log10N/g糞便(濕重)表示,主要分析細(xì)菌為腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌等;定量PCR反應(yīng)條件、引物均參照文獻(xiàn)[8]。

1.3.3一般資料調(diào)查

設(shè)計(jì)一般資料調(diào)查問(wèn)卷,記錄患者基本信息,包括性別、年齡、BMI、病因、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)[血清D-乳酸水平(取患者清晨空腹肘部靜脈血5 mL,以4 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min,以分光光度法檢測(cè)血清D-乳酸水平)]等。

1.3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 AP易位感染發(fā)生情況

182例AP患者41例發(fā)生易位感染,發(fā)生率為22.53%。

2.2 易位感染與未感染患者相關(guān)資料比較

兩組性別、年齡、BMI、病因比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);易位感染組血清D-乳酸水平、腸桿菌、腸球菌數(shù)量均高于無(wú)感染組,雙歧桿菌數(shù)量低于無(wú)感染組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 易位感染與未感染患者相關(guān)資料比較

2.3 腸道菌群對(duì)AP易位感染影響的多因素模型回歸分析

將AP患者易位感染發(fā)生情況作為因變量(發(fā)生=1,未發(fā)生=0),將D-乳酸水平、腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌作為協(xié)變量,建立logistic多因素回歸模型,結(jié)果顯示,D-乳酸水平過(guò)表達(dá)、腸桿菌過(guò)表達(dá)、腸球菌過(guò)表達(dá)、雙歧桿菌低表達(dá)是AP患者易位感染發(fā)生的影響因素(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 腸道菌群對(duì)AP易位感染影響的多因素模型回歸分析

2.4 腸道菌群變化情況預(yù)測(cè)AP易位感染風(fēng)險(xiǎn)價(jià)值

將AP患者易位感染發(fā)生情況作為狀態(tài)變量(發(fā)生=1,未發(fā)生=0),將腸道菌群(腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌)作為檢驗(yàn)變量,繪制ROC曲線,結(jié)果顯示,腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌均有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。見(jiàn)表3。

表3 腸道菌群變化情況預(yù)測(cè)AP易位感染發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)價(jià)值分析

3 討論

有研究顯示,腸道細(xì)菌易位是導(dǎo)致AP患者并發(fā)感染的首要原因,會(huì)造成胰腺反復(fù)感染、壞死,且可能會(huì)增加膿毒血癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),加重AP嚴(yán)重程度[9]。因此,早期明確易位感染風(fēng)險(xiǎn),對(duì)早期預(yù)防易位感染發(fā)生、降低預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)意義重大。

2014年,陳渝萍等[10]研究顯示,重癥AP患者血清D-乳酸水平高于輕癥組、對(duì)照組,且輕癥組D-乳酸水平高于對(duì)照組,提示D-乳酸水平可反映AP病情嚴(yán)重程度,指導(dǎo)臨床干預(yù)。有研究顯示,腸道屏障受損可能與腸道細(xì)菌失衡存在密切聯(lián)系,且腸道屏障功能減弱會(huì)增加腸道細(xì)菌易位感染風(fēng)險(xiǎn)[11]。D-乳酸過(guò)表達(dá)是AP患者易位感染發(fā)生的影響因素。證實(shí)上述研究猜測(cè)。但血清D-乳酸檢測(cè)結(jié)果易受其他因素影響,結(jié)果穩(wěn)定性不佳,具體應(yīng)用價(jià)值還需臨床進(jìn)一步證實(shí)。

腸道微生物群屬于機(jī)體復(fù)雜群落,其不僅可促進(jìn)腸道結(jié)構(gòu)正常發(fā)育,還對(duì)維持腸道免疫成熟、免疫平衡等均具有重要作用[12]。健康人腸道菌群較固定,致病菌、益生菌處于平衡狀態(tài),共同維持正常腸道功能,但當(dāng)某一菌群比例失衡,可能會(huì)影響腸道免疫及屏障功能[13]。腸桿菌、腸球菌是腸道內(nèi)常見(jiàn)致病菌,其中腸桿菌屬于細(xì)菌的一科,包括無(wú)芽孢、周身無(wú)鞭毛的革蘭陰性直桿菌等,腸球菌屬于革蘭陽(yáng)性球菌,正常情況下,糞便中腸球菌與腸桿菌比例為1∶10,但兩者比例增高可能會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失衡,削弱腸道黏膜屏障[14]。有研究顯示,雙歧桿菌水平可反映腸道微生態(tài)情況,若水平降低,多提示腸道微生物失衡,且可能會(huì)增加致病菌繁殖風(fēng)險(xiǎn)[15]。本研究結(jié)果顯示,易位感染組腸桿菌、腸球菌數(shù)量均高于無(wú)感染組,雙歧桿菌數(shù)量低于無(wú)感染組,提示AP易位感染患者伴有腸道菌群失衡狀況;經(jīng)多因素回歸模型分析結(jié)果顯示,腸桿菌過(guò)表達(dá)、腸球菌過(guò)表達(dá)、雙歧桿菌低表達(dá)是AP患者易位感染發(fā)生的影響因素;進(jìn)一步繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn),腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌預(yù)測(cè)AP患者易位感染發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的AUC分別為0.895、0.933、0.879,均有一定預(yù)測(cè)價(jià)值,證實(shí)上述猜測(cè)。

4 結(jié)論

AP患者易位感染發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)高,可能與患者腸道菌群失衡有關(guān),未來(lái)可考慮檢測(cè)腸道菌群變化,以評(píng)估AP患者易位感染發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),或可成為未來(lái)早期預(yù)防易位感染的新方向。