林 歡，傅雅麗，孫仲葆

（黃石市食品藥品檢驗檢測中心，湖北黃石 435000）

喹諾酮類藥物是一類人工合成的含有4-喹諾酮基本結構的廣譜類抗生素，能有效控制革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及其他細菌感染，因其具有抗菌譜廣、抗菌力強、價格便宜，與其他抗菌藥類物質不易產生耐藥性和毒副作用小等優(yōu)點，被廣泛應用于畜牧、水產養(yǎng)殖中動物疾病的預防[1]。長期使用此類抗生素會造成動物源性食品中殘留喹諾酮類藥物，若長期食用這種喹諾酮類藥物殘留量過高的食物，會對人體健康產生危害[2]。隨著動物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展集約化，養(yǎng)殖病害日益嚴重，各種細菌性和真菌性疾病頻發(fā)，導致人們過量、違規(guī)、濫用喹諾酮類藥物，繼而引發(fā)細菌耐藥性不斷增強的問題，不僅污染環(huán)境，還會損害人體健康[3]。我國農業(yè)部公告第193 號、農業(yè)部公告第235 號、農業(yè)部公告第2292 號等文件中對部分喹諾酮藥物進行了規(guī)定，不少藥物已被我國和其他國家歸為獸藥禁藥，所以建立動物源性食品中喹諾酮類藥物的檢測分析方法對保證食品安全至關重要。目前，此類抗生素的檢測方法有很多，如微生物法[4]、液相色譜法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、毛細管電泳法以及電化學法等，但靈敏度不高。超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（Ultra-High Performance Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）具有靈敏度高、專屬性強等特點，因此本文使用該方法對動物源食品中16 種喹諾酮類藥物殘留進行檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters Xevo TQD 超高效液相色譜串聯(lián)質譜聯(lián)用儀，美國Waters 公司；pH 計，梅特勒公司；離心機，美國貝克曼公司；渦旋混合器，德國艾卡；超聲波振蕩儀，昆山市超聲儀器有限公司；全自動平行濃縮氮吹儀，?？萍瘓F（廈門）股份有限公司；Milli-Q超純水儀；ME204E/JY20002 天子天平。

甲醇，色譜純，默克公司；乙腈，質譜純，默克公司；甲醇/二甲基亞砜中16 種喹諾酮混標溶液，100 μg·mL-1，上海安譜實驗科技股份有限公司；檸檬酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉，分析純，國藥集團；甲酸，色譜純，安譜科技；超純水（電阻率為18.3 MΩ·cm-1，由Milli-Q 超純水系統(tǒng)制?。?；PEP 固相萃取柱（200 mg/6 mL，Agela）。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

（1）系列標準溶液的配制。精密吸取1.00 mL 混合標準溶液，用1‰的乙酸乙腈溶液溶解并定容至100 mL 容量瓶中，得到混合標準儲備液（16 種化合物的質量濃度均為1 000 ng·mL-1）。將質量濃度為1 000 ng·mL-1的標準儲備溶液用初始流動相逐級稀釋為2 ～100 ng·mL-1的系列標準工作溶液，臨用現(xiàn)配。

（2）EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液的配制。稱取42.02 g 檸檬酸試劑，用純化水溶解并定容至2 000 mL，得到濃度為0.1 mol·L-1的檸檬酸溶液，然后稱取143.26 g 磷酸氫二鈉試劑，用純化水溶解并定容至2 000 mL，得到濃度為0.2 mol·L-1的磷酸氫二鈉溶液。將2 000 mL 0.1 mol·L-1的檸檬酸溶液與1 250 mL 0.2 mol·L-1的磷酸氫二鈉溶液充分混合均勻，調節(jié)pH 值至4.0，得到Mcllvaine 緩沖溶液。再稱取121 g 乙二胺四乙酸二鈉試劑置于Mcllvaine 緩沖溶液中，充分振搖使其溶解。

1.2.2 樣品前處理

稱取新鮮豬肉樣品5 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液20 mL，用渦旋混合器混合約2 min，超聲波振蕩提取10 min，放入離心機中離心10 min（3 ℃、10 000 r·min-1），提取3 次，合并3 次提取的上清液，待凈化。

使用時先活化HLB 固相萃取柱，用6 mL 甲醇洗滌，再用6 mL 水活化，待柱體水分抽干，將提取液過柱，棄去濾液，用2 mL 5%甲醇水溶液淋洗柱子，棄去淋洗液，待小柱抽干后，用6 mL 色譜純甲醇洗脫固相萃取柱，收集全部洗脫液。將洗脫液置于全自動平行濃縮氮吹儀上（40 ℃）吹干，用1 mL 初始流動相（1‰甲酸乙腈溶液-1‰甲酸水溶液，95 ∶5）溶解定容，渦旋混合1 min，用孔徑為0.22 μm 有機系微孔濾膜過濾，作為供試品溶液，于UPLC-MS/MS測定。

1.2.3 儀器條件

（1）色譜條件。Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：15 ℃；流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B 為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫：0 ～0.2 min，95%A；0.2 ～2.5 min，95%A→50%A；2.5 ～3.5 min，50%A→5%A；3.5 ～4.5 min，5%A；4.5 ～4.6 min，5%A→95%A；4.6 ～7.0 min，95%A；流速：0.4 mL·min-1；進樣量：5 μL。

（2）質譜條件。電噴霧電離源；電離模式為ESI+；掃描模式為多反應監(jiān)測模式（MRM）；毛細管電壓為3.00 kV；離子源溫度為150 ℃；脫溶劑氣的溫度為550 ℃；錐孔氣體的流量為50 L·Hr-1；脫溶劑氣體的流量為1 000 L·Hr-1，碰撞氣為氬氣。16 種喹諾酮類化合物MRM 模式質譜優(yōu)化參數(shù)見表1。

表1 16 種喹諾酮類化合物MRM 模式質譜優(yōu)化參數(shù)及保留時間

2 結果與分析

2.1 提取及凈化方法的選擇

目前，國標中檢測動物源食品中喹諾酮類藥物殘留的提取凈化方法有經酸化的乙腈提取后用正己烷凈化、甲酸-乙腈提取后于分液漏斗中用飽和乙腈正己烷凈化、磷酸鹽緩沖液提取后用Varian BondElut C18柱（100 mg·mL-1）凈化[5]和QuEChERS 法[6]等，但操作步驟復雜繁多，回收率不高。為了減少基質干擾，需要對提取液中殘留的蛋白質及脂肪進行二次凈化，以確保目標化合物定量的準確性。HLB 固相萃取柱常用來進行脂質和蛋白質等基質組分的凈化，所以本文采用Cleanert PEP-2 200 mg/6 mL 固相萃取小柱，能清除樣品中90%的磷脂和脂肪，處理過程簡單、方便、快速。

2.2 線性關系、檢出限和定量限

配制各目標化合物濃度為2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、80 ng·mL-1和100 ng·mL-1的標準溶液，通過儀器檢測后，以待測物質的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結果顯示，各目標化合物在2 ～100 ng·mL-1的濃度內線性相關良好，相關系數(shù)均大于0.991，滿足日常檢測需求?；跇藴是€中的最低響應，以3 倍信噪比和10 倍信噪比確定檢出限和定量限，結果見表2。

表2 16 種喹諾酮類化合物的線性方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限

2.3 方法回收率及精密度

準確稱取5 g 不含喹諾酮類藥物的陰性樣品（豬肉）于50 mL 離心管中，設定3 個添加水平，即5.0μg·kg-1（添 加1）、20.0 μg·kg-1（添 加2）、50.0 μg·kg-1（添加3），準確吸取1 000 ng·mL-1的喹諾酮混合標準儲備溶液25 μL、100 μL、250 μL分別加入樣品管中（加標量分別為25 ng、100 ng、250 ng），按1.2.2 同法進行前處理，進行添加回收率測定，每個添加水平進行6 次平行實驗。由表3 可知，16 種喹諾酮類化合物的回收率在81.9%～106.8%，RSD 為1.3%～12.8%。

表3 陰性樣品中16 種喹諾酮類化合物的加標回收率和相對標準偏差（n=6）

3 結論

本文在建立同時檢測動物源食品中16 種喹諾酮類化合物殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法的基礎上，對動物源食品中的目標化合物的提取和凈化方法進行了優(yōu)化，最終選擇EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液作為提取液對樣品進行提取，HLB 固相萃取柱凈化富集。方法學驗證結果表明該方法準確、可靠，檢出限和檢測范圍均滿足《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）對16 種喹諾酮類化合物的要求，可滿足常規(guī)實驗室日常檢測需求，對準確監(jiān)測動物源食品喹諾酮類藥物殘留風險具有重要意義。