徐世航，鄭 妍，岳松燁，朱瓊瑤，趙 宇，邊 鑫

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150028）

甜酸茶是發(fā)源于中國(guó)北方的一種以小米和大豆等谷物為原料經(jīng)自然發(fā)酵制成的飲品。甜酸茶的主要功能菌種是乳酸菌，大部分乳酸菌在人體內(nèi)能發(fā)揮益生作用，促進(jìn)人體健康[1-2]。因此，從甜酸茶中分離篩選乳酸菌，將有助于益生菌資源的開(kāi)發(fā)。本文采用傳統(tǒng)分離法從甜酸茶中得到乳酸菌，并對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和生理生化鑒定，同時(shí)評(píng)價(jià)乳酸菌的安全性及胃腸道耐受能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜酸茶（市售）；MRS 液體培養(yǎng)基、瓊脂、M17培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒，黑龍江久豐生物公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛膽鹽，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；無(wú)水乙醇、PBS 緩沖液等其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)高壓滅菌鍋，上海力申科學(xué)儀器有限公司；DL201 型恒溫自動(dòng)干燥箱，天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甜酸茶中的乳酸菌分離

將甜茶和酸茶樣品用0.9%的生理鹽水稀釋10倍，將各自的溶液涂在固體MRS 平板上，在37 ℃下培養(yǎng)48 h。從平板上選擇不同形態(tài)和大小的單個(gè)菌落，將其刮除并清洗數(shù)次，選擇符合優(yōu)勢(shì)菌形態(tài)特征的菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，并將其置于-80 ℃的甘油冷凍管中保存，以便進(jìn)一步研究。

1.3.2 乳酸菌的形態(tài)

采用革蘭氏染色試劑盒將分離后待檢測(cè)的菌株置于載玻片上進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察菌株形態(tài)，根據(jù)形態(tài)判斷菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）或革蘭氏陰性菌（G-）。

1.3.3 生理生化鑒定

將乳酸菌的菌液接種到不同培養(yǎng)基上，在無(wú)菌條件下進(jìn)行培養(yǎng)，采用生理生化試劑盒對(duì)乳酸菌進(jìn)行產(chǎn)過(guò)氧化氫酶、產(chǎn)硫化氫、葡萄糖產(chǎn)氣、葡萄糖產(chǎn)酸、淀粉水解和糖發(fā)酵能力等生理生化鑒定，根據(jù)鑒定結(jié)果初步確定菌株種屬。

1.3.4 分子學(xué)鑒定

利用16S rDNA 基因序列研究方法對(duì)純化后的菌株進(jìn)行分子學(xué)鑒定，將16S rDNA 測(cè)序并拼接所得的序列導(dǎo)入NCBI，進(jìn)行BALS 比對(duì)，所得結(jié)果導(dǎo)出后，應(yīng)用MEGA 5.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析。

總而言之，數(shù)學(xué)思想屬于一項(xiàng)系統(tǒng)性的工程，可能會(huì)受到多種因素的影響。小學(xué)數(shù)學(xué)教師要做好課前準(zhǔn)備、課中帶領(lǐng)學(xué)生自主探究、課后鞏固內(nèi)化工作，隨時(shí)對(duì)教學(xué)規(guī)律進(jìn)行探索，在日常教學(xué)過(guò)程中滲透數(shù)學(xué)思想，提高學(xué)生的數(shù)學(xué)成效。

1.3.5 優(yōu)勢(shì)菌安全性評(píng)價(jià)

（1）抗生素抗性試驗(yàn)。將篩選獲得的兩株乳酸菌菌株接種在3%的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h，將0.1 mL 細(xì)菌溶液均勻地涂布在裝有MRS 培養(yǎng)基的瓊脂平板上。將含有標(biāo)準(zhǔn)劑量抗生素的3 塊紙片放在MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h。監(jiān)測(cè)抑制周期的出現(xiàn)，根據(jù)美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）的標(biāo)準(zhǔn)，用抑制周期的直徑確定細(xì)菌是否對(duì)抗生素有抗性。該檢測(cè)中使用的抗生素是氨芐西林、頭孢噻吩、環(huán)丙沙星、氯霉素、頭孢曲松、頭孢噻肟、紅霉素、慶大霉素、林可霉素、青霉素、利福平、復(fù)方新諾明和四環(huán)素[3]。

（2）溶血試驗(yàn)。分別對(duì)篩選獲得的兩株乳酸菌菌株取樣，以3%的濃度在MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后在血瓊脂培養(yǎng)基上打3 個(gè)孔并向每個(gè)孔中加入100 μL 菌液，在37 ℃下培養(yǎng)48 h，查看有無(wú)溶血圈，從而判斷對(duì)人體健康的影響程度。

1.3.6 模擬胃腸道消化試驗(yàn)

乳桿菌對(duì)人工模擬胃液的耐受性參照程爽等[4]和MARAGKOUDAKIS 等[5]的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。取1 mL 乳桿菌菌液，在10 000×g、4 ℃條件下離心5 min 后，棄上清收集菌體，用PBS 緩沖液（pH=7）洗滌兩次，瀝干后備用。調(diào)節(jié)HCl 溶液的pH 值為2.5，分別加入濃度為0.3 mg·mL-1的胃蛋白酶，配制成模擬胃液。調(diào)節(jié)PBS 緩沖液的pH 值為6.8，加入濃度為0.1 mg·mL-1的胰蛋白酶，配制成模擬腸液。將PBS 緩沖液調(diào)節(jié)成pH 值為8.0 的溶液，加入膽鹽配制成濃度為0.3%的膽鹽溶液。取1 mL 模擬胃液、1 mL 模擬腸液和1 mL 膽鹽溶液分別加入盛有菌體的離心管中，充分混勻后，37 ℃下培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1 h、2 h 和3 h 時(shí)取樣，涂布于MRS 瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，計(jì)算乳桿菌菌液濃度。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 2019 和SPSS 22 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的初篩鑒定結(jié)果

圖1 初篩菌株BIAN-tsc1 的形態(tài)學(xué)觀察及顯微觀察

圖2 初篩菌株BIAN-tsc2 的形態(tài)學(xué)觀察及顯微觀察

2.2 生理生化試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)過(guò)氧化氫酶、硫化氫、葡萄糖產(chǎn)氣、葡萄糖產(chǎn)酸、淀粉水解和糖發(fā)酵試驗(yàn)分析了菌株BIANtsc1 和BIAN-tsc2 的生理生化特性，結(jié)果見(jiàn)表1 和表2。由表1 可明顯看出兩菌株的過(guò)氧化酶試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)和葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)結(jié)果顯示均為陰性，而葡萄糖產(chǎn)酸試驗(yàn)均為陽(yáng)性，該結(jié)果與乳酸菌的生理生化鑒定結(jié)果相同。淀粉水解試驗(yàn)結(jié)果顯示，BIANtsc1 為陽(yáng)性，而B(niǎo)IAN-tsc2 為陰性，說(shuō)明BIAN-tsc1可能有產(chǎn)淀粉酶能力。

表1 菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 的部分生理生化特性

表2 菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 的糖發(fā)酵特性

由表2 可明顯看出這兩種菌株在培養(yǎng)過(guò)程中都可以很好地利用果糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖和核糖，但只有菌株BIAN-tsc1可以利用阿拉伯糖和木糖，該對(duì)比符合乳酸菌的糖發(fā)特性，說(shuō)明兩種菌株都能利用多種糖類作為碳源生長(zhǎng)。

2.3 初篩菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

對(duì)兩株菌株進(jìn)行16S rDNA 測(cè)序后進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，菌株BIAN-tsc1 在NBCI 數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)后的同源性為100%的前20 的菌種均為植物乳桿菌。選取序列同源性較高的菌株與菌株BIAN-tsc1進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，見(jiàn)圖3。菌株BIAN-tsc1 與植物乳桿菌菌株在同一個(gè)分支中，且它們之間的遺傳距離遠(yuǎn)小于其他菌株，故確定菌株BIAN-tsc1 為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

圖3 菌株BIAN-tsc1 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

菌株BIAN-tsc1 在NBCI 數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)后的同源性為100%的前20 的菌種均為棒狀乳桿菌。選取序列同源性較高的菌株與菌株BIAN-tsc2 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，見(jiàn)圖4。菌株BIAN-tsc2 與棒狀乳桿菌菌株在同一個(gè)分支中，且它們之間的遺傳距離遠(yuǎn)小于其他菌株，故確定菌株BIAN-tsc2 為棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）。

圖4 BIAN-tsc2 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 乳酸菌安全性評(píng)價(jià)

2.4.1 抗生素敏感性

菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 對(duì)所選抗生素的抗性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)NCCLS 的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)兩種菌進(jìn)行判斷，兩種菌株對(duì)抗生素的抗性試驗(yàn)表明它們對(duì)大多數(shù)抗生素不敏感，可知這兩種菌有較高的安全性。

表3 菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 的抗生素抗性

2.4.2 溶血性

如圖5 所示，將菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 置于37 ℃條件下培養(yǎng)48 h 后，觀察血瓊脂培養(yǎng)基上的3 個(gè)穿孔，發(fā)現(xiàn)每個(gè)穿孔附近一周均沒(méi)有出現(xiàn)溶血圈，說(shuō)明兩個(gè)菌株均不具有溶血性。該安全評(píng)估試驗(yàn)結(jié)果表明自然發(fā)酵的甜茶和酸茶樣品中菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 對(duì)人體健康無(wú)害，可用于食品發(fā)酵。

圖5 BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 的溶血作用情況

2.5 乳酸菌的益生特性

人體胃內(nèi)的pH 值為2.5 左右，食物在胃中的停留消化時(shí)間為2 ～4 h，乳酸菌進(jìn)入消化道，往往由于胃液、腸液和膽鹽的極端環(huán)境導(dǎo)致活菌數(shù)大量下降，無(wú)法在體內(nèi)發(fā)揮益生作用。因此，本研究考察3 h內(nèi)BIAN-tsc1 菌和BIAN-tsc2 菌的存活情況，結(jié)果見(jiàn)表4。兩株菌在pH=2.5 的人工模擬胃液、pH=6.8 的腸液和0.3%的膽鹽溶液中培養(yǎng)3 h 后，其活菌數(shù)幾乎沒(méi)有變化，始終保持在7 logCFU·mL-1左右，說(shuō)明菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 對(duì)胃液和腸液具有良好的耐受性，可在小腸下部或大腸中發(fā)揮其功能性。

表4 菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 對(duì)人工模擬胃液的耐受性

3 結(jié)論

從東北傳統(tǒng)甜酸茶中分離出兩株乳酸菌BIANtsc1 和BIAN-tsc2，經(jīng)生理生化及16S rDNA 鑒定確定兩株菌分別為植物乳桿菌和棒狀乳桿菌。BIANtsc1 和BIAN-tsc2 能利用大多數(shù)糖作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)增殖，其中，BIAN-tsc1 具有降解淀粉的能力。通過(guò)對(duì)抗生素和溶血性評(píng)價(jià)，確定BIAN-tsc1 和BIANtsc2 對(duì)大多數(shù)抗生素均不敏感，沒(méi)有溶血作用，且具有較好的胃腸道耐受能力。