張文艷，李茂東，黃 堃，趙仲霞，阮蘇夢，師 睿*

（1.昭通學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南昭通 657000；2.云南三鑫職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)藥健康學(xué)院，云南文山 663000）

花椒是藥食兩用的植物性原料，研究花椒的抑菌活性意義重大[1]。本研究從天然抑菌產(chǎn)物角度出發(fā)，研究青花椒提取物對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制作用，深化昭通農(nóng)副產(chǎn)品的精深加工[2]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青花椒，昭通市永善縣；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；鉀離子檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；96 孔板，NEST；移液槍，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；PT-3502 C 全波長酶標(biāo)分析，北京普天新橋技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 青花椒提取物的制備

粉碎后過60 目篩的青花椒與75%酒精按照料液比1 ∶15（m∶v）混合，浸泡過夜，50 ℃超聲提取50 min，濾液濃縮至浸膏，配制成母液，過濾除菌，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 濾紙片的準(zhǔn)備

用6 mm 打孔器對濾紙打孔，121 ℃滅菌15 min，烘干備用，滅菌后的濾紙不能久放，否則會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性[3]。

1.2.3 菌懸液的制備與測定

菌懸液濃度為107CFU·mL-1，避光培養(yǎng)溫度為37 ℃，于600 nm 處測定吸光值。

1.2.4 青花椒提取物對金黃色葡萄球菌抑制作用研究

（1）抑菌圈的測定。在培養(yǎng)基凝固后，每皿加入1 mL 菌懸液進(jìn)行平板涂布，而后沿同一方向等距離貼上濾紙片，濾紙片所加青花椒提取物為10 μL，無菌水為對照組，設(shè)置4 個實(shí)驗(yàn)組，將青花椒提取物稀釋成30 mg·mL-1、60 mg·mL-1、120 mg·mL-1和240 mg·mL-1，培養(yǎng)24 h 后十字交叉法測量抑菌圈大小，每組3 個平行。

（2）青花椒提取物最小抑菌濃度的測定。最小抑 菌 濃 度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）測 定 方 法 參 考ABREU 等[4]和BEEVI 等[5]的 方法，以空白培養(yǎng)基為對照組，設(shè)置4 個實(shí)驗(yàn)組，以107CFU·mL-1菌液作為稀釋液，將青花椒提取物配制成40 mg·mL-1、50 mg·mL-1、60 mg·mL-1和70 mg·mL-1，每組3 個平行。分別取稀釋后不同濃度的青花椒提取物，以每 孔200 μL 加入96 孔板，培養(yǎng)24 h 后600 nm 處測定吸光值[6]。MIC 計(jì)算公式為

（3）青花椒提取物最小殺菌濃度的測定。最小殺菌 濃 度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）測定方法參考李靜慧[7]和郭雪梅[8]的方法，即青花椒提取物抑制99.9%的金黃色葡萄球菌生長所需的濃度[9]。以空白培養(yǎng)基為對照組，設(shè)置4 個實(shí)驗(yàn)組，以107CFU·mL-1菌液作為稀釋液，將青花椒提取 物 配 制 成60 mg·mL-1、70 mg·mL-1、80 mg·mL-1和90 mg·mL-1，每組3 個平行。分別取稀釋后不同濃度的青花椒提取物，以每孔200 μL 加入96 孔板，培養(yǎng)24 h 后檢測600 nm 處的吸光值。同時每孔取50 μL 培養(yǎng)液加入營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行平板涂布，37 ℃避光培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)菌落，最終選擇抑菌率≥99.9%，且平板涂布培養(yǎng)后菌落數(shù)≤5 CFU 所對應(yīng)的青花椒提取物濃度為該供試菌的MBC 值[10]。MBC 計(jì)算公式為

（4）生長抑制曲線的測定。參考陳屹[11]、張雅靜[12]和李冬冬[13]的方法，以菌懸液為對照組，設(shè)置3 個實(shí)驗(yàn)組，以107CFU·mL-1菌液作為稀釋液，將青花椒提取物配制成50 mg·mL-1、70 mg·mL-1、80 mg·mL-1，每組3 個平行。分別取稀釋后不同濃度的青花椒提取物，以每孔200 μL 加入96 孔板，每2 h 檢測一次600 nm 處的吸光值，測定金黃色葡萄球菌的生長情況[14]。

（5）青花椒提取物對金黃色葡萄球菌膜通透性的影響。以菌懸液為對照組，設(shè)置4 個實(shí)驗(yàn)組，以107CFU·mL-1菌液作為稀釋液，將青花椒提取物配制成50 mg·mL-1、60 mg·mL-1、70 mg·mL-1和80 mg·mL-1，于80 r·min-1避光培養(yǎng)6 h，5 000 r·min-1離心5 min，收集細(xì)胞上清液，按照鉀離子檢測盒說明書測定金黃色葡萄球菌細(xì)胞上清液中鉀離子的含量。

（6）青花椒提取物對金黃色葡萄球菌內(nèi)容物的影響。菌懸液為對照組，設(shè)置2 個實(shí)驗(yàn)組，以107CFU·mL-1菌液作為稀釋液，將青花椒提取物配制成50 mg·mL-1、70 mg·mL-1，于100 r·min-1避光培養(yǎng)，每2 h 取 一 次 樣，培 養(yǎng) 結(jié) 束 后5 000 r·min-1離 心5 min，收集上清，260 nm 處檢測吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈的測定結(jié)果

由表1 可知，青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后，均能產(chǎn)生一定大小的抑菌圈。

表1 青花椒提取物對金黃色葡萄球菌抑菌效果的測定

2.2 青花椒提取物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度

由圖1 可知，當(dāng)青花椒提取物濃度為60 mg·mL-1時，抑菌率為79.45%；當(dāng)青花椒提取物濃度為70 mg·mL-1時，抑菌率為97.59%，大于90%。因此，青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后MIC 值為70 mg·mL-1。

圖1 不同濃度青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度

2.3 青花椒提取物對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度

由圖2、表2 可知，當(dāng)青花椒提取物濃度為80 mg·mL-1時，抑菌率≥99.9%，且平板涂布培養(yǎng)后菌落數(shù)≤5 CFU。因此，青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后MBC 值為80 mg·mL-1。

圖2 不同濃度青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度

表2 不同濃度青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌的菌落計(jì)數(shù)

2.4 青花椒提取物對金黃色葡萄球菌的生長抑制曲線

由圖3 可知，青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后對其生長均有抑制作用。

圖3 青花椒提取物對金黃色葡萄球菌的生長抑制曲線

2.5 青花椒提取物對金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜通透性的影響情況

青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后，檢測細(xì)胞上清液中鉀離子含量，以此反映青花椒提取物作用下金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的通透性。根據(jù)試劑盒說明書，繪制鉀離子標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=1.483 8x-0.023 7，R2=0.998 9，如圖4 所示。由圖5 可知，青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后，80 mg·mL-1對金黃色葡萄球菌膜的通透性影響最大，表明K+泄漏到胞外培養(yǎng)液中，青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后，增加了細(xì)胞膜的通透性。

圖4 鉀離子標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 金黃色葡萄球菌膜通透性情況

2.6 青花椒提取物對金黃色葡萄球菌內(nèi)容物泄露量的影響

檢測260 nm 處的吸光值，判斷青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后內(nèi)容物的泄露量。由圖6 可知，青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后，70 mg·mL-1時內(nèi)容物泄露最多，其次是50 mg·mL-1，表明青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后破壞了細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生泄露。

圖6 青花椒提取物對金黃色葡萄球菌內(nèi)容物泄露量的影響

3 結(jié)論

本研究將青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌，探究青花椒提取物的抑菌活性，結(jié)果顯示，菌體緩慢生長，MIC 為70 mg·mL-1，MBC 為80 mg·mL-1，鉀離子、內(nèi)容物發(fā)生不同程度的泄露，表明青花椒提取物對金黃色葡萄球菌具有抑制作用。