劉國華 何玉榆 陳彤 譚磊 吳雯娟 鐘名琴

摘? 要：本研究建立了一種超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性食品中硝基咪唑類藥物殘留量的方法。該方法在硝基咪唑類藥物的殘留量介于0.300～30.0 ng/mL的范圍內(nèi)時具有良好線性關(guān)系，5種硝基咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999，方法檢出限在4.60×10-2～3.38×10-1 μg/kg范圍內(nèi)，低、中、高不同濃度點加標(biāo)平均回收率范圍分別為74.6％～105.0％、77.4％～106.0％、81.7％～107.0％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9％～11.7％。試驗結(jié)果顯示，該方法具有快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏的特點，適用于動物源性食品中硝基咪唑類藥物殘留量的檢測。

關(guān)鍵詞：硝基咪唑；動物源性食品；超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法

中圖分類號：S851.33 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ?文章編號：1001-0769（2023）04-0096-06

硝基咪唑類藥物是一類硝基雜環(huán)類抗菌藥物，其衍生物易與生物體內(nèi)的許多大分子物質(zhì)發(fā)生超分子結(jié)合[1]，在抗厭氧菌[2]、抗寄生蟲[3]等方面有廣泛的用途。近年來，由于硝基咪唑類藥物具有抗原蟲和抗菌作用，經(jīng)常作為飼料添加劑被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)，以促進(jìn)畜禽的生長，提高飼料轉(zhuǎn)化率。然而，在農(nóng)產(chǎn)品生長期間，以及在飼料和農(nóng)產(chǎn)品加工、貯藏和運輸過程中，均易造成硝基咪唑類藥物污染。由于硝基咪唑類藥物及其代謝產(chǎn)物具有潛在的致癌、致畸和致突變作用，且代謝物在動物體內(nèi)能夠比原藥維持更長的時間[4]，如果在動物源性食品中殘留、累積，則會造成較大的食品安全風(fēng)險。因此，硝基咪唑類藥物在許多國家被列為違禁藥物，我國也對硝基咪唑類藥物進(jìn)行了嚴(yán)格的限制。GB 31650－2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》[5]明確規(guī)定，二甲硝咪唑和甲硝唑可用于動物疾病的治療，但不得在動物源性食品中檢出。GB 31650.1－2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中41種獸藥最大殘留限量》[6]明確規(guī)定，左旋咪唑在禽蛋中的最大限量值為5 μg/kg。其他硝基咪唑類藥物在所有食品動物中被禁止使用，且不得檢出。

為確保動物源性食品的衛(wèi)生安全，有必要為殘留的硝基咪唑類藥物建立一種簡單快捷且具有高靈敏度的檢測方法。目前，硝基咪唑類藥物的測定方法有流動注射化學(xué)發(fā)光法[7]、酶聯(lián)免疫吸附法[8]、高效液相色譜 法[9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[10-12]，雖然目前已有文獻(xiàn)報道可用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性食品中硝基咪唑類藥物，但大部分檢測方法存在適用對象單一、操作復(fù)雜、提取效果差等缺點。傳統(tǒng)的國家標(biāo)準(zhǔn)方法，如GB/T 21318－2007 《動物源性食品中硝基咪唑殘留量檢驗方法》[13]，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性食品中硝基咪唑類藥物，但是采用凝膠色譜凈化，該過程繁瑣復(fù)雜，耗時較長，消耗試劑及材料較多，無法滿足當(dāng)前檢測的需要，對操作人員身體健康也可能造成較大危害；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025號公告－22－2008[14]只適用于豬的肌肉和肝臟組織，且前處理步驟繁瑣，花費時間多，操作不當(dāng)易造成損失。

本研究對樣本前處理方法及儀器條件進(jìn)行了優(yōu)化，旨在建立一種簡單快捷且靈敏度高的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，用于動物源性食品中硝基咪唑類藥物殘留量的測定，為保障動物源性食品的衛(wèi)生安全和消費者“舌尖上的安全”提供技術(shù)支撐。

1? 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

試驗需要N-EVAP-24型氮吹儀（美國Organomation associates公司）、多管旋渦混合儀（杭州米歐儀器有限公司）、賽多利斯BSA3202S型天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、SIGMA 3-18K高速冷凍離心機（德國Sigma公司）、超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）、Aglient 1290超高效液相色譜儀（美國Aglient公司）、配有電噴霧（ESI）離子源的AB Sciex Triple QuadTM

5500 質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）等。

1.1.2 試劑與耗材

乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）、6cc 200 mg PRIME HLB固相萃取柱（美國Waters公司）等。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品

2-甲硝咪唑、羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑、苯硝咪唑、異丙硝唑：純度高于95.0％（德國Dr. Ehrenstorfer公司）。

1.2 樣本制備

取代表性樣本約500 g，使用勻漿機充分搗碎混勻，裝入潔凈容器中作為試樣，將試樣密封置于－18 ℃冷凍避光保存。在樣本制備時應(yīng)防止樣本交叉污染。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量2-甲硝咪唑、羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑、苯硝咪唑、異丙硝唑的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成濃度為1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，0～4 ℃冷凍避光保存?zhèn)溆谩７謩e移取適量上述五種硝基咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇逐級稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣本前處理

1.4.1 提取

準(zhǔn)確稱取樣本（2.50±0.02）g于50 mL離心管中，加10 mL乙腈水溶液（含80％乙腈水和0.2％甲酸）后，立即渦旋2 min混勻，用超聲波清洗儀超聲提取5 min，6 000 r/min高速冷凍離心5 min。

1.4.2 凈化

移取上述上清液4.0 mL，直接過PRIME HLB固相萃取柱（6cc 200 mg），保持1 s/滴的速度，收集全部流出液，準(zhǔn)確移取2.5 mL流出液至帶刻度離心管內(nèi)。流出液于40 ℃水浴下氮氣吹至少于0.3 mL，殘留液用甲醇+水+甲酸（體積比為10 ∶ 90∶ 0.09）溶液定容至1.00 mL，渦旋1 min混勻后過

0.22 μm濾膜，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.5 UPLC-MS/MS條件

1.5.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18

（1.7 μm，3.0 mm×100 mm）；流動相A為0.1％甲酸水溶液；流動相B為甲醇（色譜純）；柱溫40.0 ℃；進(jìn)樣體積5.00 μL。具體梯度洗脫程序見表1。

1.5.2 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧（ESI）；電噴霧電壓：4 500 V；掃描方式：正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測；離子源溫度550 ℃；柱溫40 ℃；氣簾氣壓力35.0 psi；碰撞氣壓力9.0 psi；霧化器壓力55.0 psi；輔助加熱器壓力55.0 psi。

保留時間、定性離子對、定量離子對、去簇電壓及碰撞能量見表2。

空白基質(zhì)添加25.0 μg/kg含苯硝咪唑、異丙硝唑、羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑和2-甲硝咪唑的混合物色譜圖見圖1。

2? 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取5個豬肉空白基質(zhì)樣本，按照1.4所述方法進(jìn)行前處理，獲得空白樣本提取液。將空白樣本基質(zhì)配制成不同濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑的濃度依次為：0.300 ng/mL、0.600 ng/mL、? ?1.50 ng/mL、3.00 ng/mL、15.0 ng/mL；2-甲硝咪唑、苯硝咪唑、異丙硝唑的濃度依次為0.600 ng/mL、1.20 ng/mL、3.00 ng/mL、? 6.00 ng/mL、30.0 ng/mL。按1.5所述方法設(shè)置儀器參數(shù)，待儀器穩(wěn)定后，進(jìn)行上機測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其中2-甲硝咪唑、羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑、苯硝咪唑和異丙硝唑的相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.999 2，、0.999 9、0.999 7、0.999 9和0.999 7，可發(fā)現(xiàn)基質(zhì)試驗峰面積與相應(yīng)濃度的線性關(guān)系較好，具體見表3。

2.2 方法檢出限確定

以空白豬肉樣本為基質(zhì)，做7個平行添加試驗，羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑的陽性添加濃度均為1.00 μg/kg，2-甲硝咪唑、苯硝咪唑、異丙硝唑的陽性添加濃度均為0.50 μg/kg。樣本前處理后，進(jìn)行上機測定。根據(jù)各樣本檢測值計算出平均值（? ）及標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），計算公式為：

檢出限（method detection limit，

MDL）=（k×SD×C）/

式中：k為置信因子，一般取3；C為理論加標(biāo)水平，單位為μg/kg；測得羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑、苯硝咪唑、異丙硝唑、2-甲硝咪唑方法檢出限分別為4.60×10-2 μg/kg、3.38×10-1 μg/kg、2.24×10-1 μg/kg、1.04×10-1 μg/kg、1.28×10-1 μg/kg（表3）。

2.3 方法回收率和精密度驗證

以空白豬肉樣本為基質(zhì)，進(jìn)行3個不同濃度水平的添加回收實驗，每個水平均取6個平行樣，2-甲硝咪唑、苯硝咪唑、異丙硝唑陽性添加濃度分別為0.500 μg/kg、? ? ? ? ? ?1.00 μg/kg、5.00 μg/kg；羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑陽性添加濃度分別為1.00 μg/kg、2.00 μg/kg、10.0 μg/kg。按照1.4所述方法進(jìn)行前處理，處理好的樣本供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。豬肉樣本中羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑、苯硝咪唑、異丙硝唑和2-甲硝咪唑的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）結(jié)果詳見表4。

由表4可知，本研究所述方法的回收率較好，2-甲硝咪唑、羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑、苯硝咪唑和異丙硝唑的回收率范圍分別為77.3％～107.0％、74.6％～1067.0％、74.6％～106％、82.4％～99.6％和76.6％～98.0％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為3.4％～9.5％、2.9％～11.7％、6.0％～7.2％、3.9％～7.1％和4.2％～8.1％，說明所建立的方法重復(fù)性好，具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。

3? 結(jié)論

本研究建立了一種動物源性食品中硝基咪唑類藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜簡便測定方法，與傳統(tǒng)方法相比，該方法采用酸化乙腈水溶液提取、直通型PRIME HLB固相萃取柱凈化的方式，提高了檢測效率，檢測時間縮減至2 h。該方法靈敏度低、準(zhǔn)確度高且分離度好，可適用于動物源性食品中硝基咪唑類藥物殘留量的定性、定量檢測，為硝基咪唑類藥物的食品安全風(fēng)險評估工作提供技術(shù)支持。

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