簡(jiǎn)偉，劉永連，張瑞，郭林，肖海峰，李國(guó)順

（北京民海生物科技有限公司/北京市新型聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心，北京 102600）

貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的放大方式包括從方瓶或平皿放大至轉(zhuǎn)瓶、多層方瓶或細(xì)胞工廠，這些培養(yǎng)方式均為低密度細(xì)胞培養(yǎng)，放大能力只能依靠增加培養(yǎng)單元的數(shù)量來(lái)提高[1-2]。因此，無(wú)論是貼壁培養(yǎng)工藝還是懸浮培養(yǎng)工藝，生物反應(yīng)器工藝是大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞和病毒最適合的選擇[3]。固定床生物反應(yīng)器片狀載體工藝在病毒性疫苗領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，具有剪切力低、換液快、可大規(guī)模連續(xù)灌流培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)[4]。但由于不能實(shí)時(shí)取樣難以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化計(jì)數(shù)，從而難以準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)胞密度、判斷細(xì)胞生長(zhǎng)速度，對(duì)于需嚴(yán)格按病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）接毒的病毒培養(yǎng)工藝也造成一定的困擾[5]。本實(shí)驗(yàn)建立了一種簡(jiǎn)單快捷應(yīng)用于固定床生物反應(yīng)器（片狀載體）的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，為片狀載體細(xì)胞培養(yǎng)工藝的細(xì)胞計(jì)數(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

Vero 細(xì)胞142 代，由北京民海生物科技有限公司研發(fā)中心保存。

1.2 試劑及耗材

Gibco OptiPRO SFM 培養(yǎng)基、基因重組胰酶，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；Cedex Bio 配套葡萄糖檢測(cè)試劑盒，瑞士Hoffmann-La Roche 公司；片狀載體，上海楚鯤生物科技有限公司。

75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶（T75）、225 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶（T225）、2 層細(xì)胞工廠（CF2）、10 層細(xì)胞工廠（CF10），丹麥Corning 公司。

1.3 設(shè)備

MCO-20AIC 型二氧化碳培養(yǎng)箱，日本Panasonic公司；CKX53 型倒置顯微鏡，日本OLYMPUS 公司；IC1000 型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，上海睿鈺生物科技有限公司；Cedex Bio 型生化分析儀，瑞士Hoffmann-La Roche 公司；Cellipower 09-5L 型生物反應(yīng)器，上海戈洛思生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞復(fù)蘇和傳代

（1）復(fù)蘇。取1 支Vero 細(xì)胞（代次142），在（39±1）℃水浴快速化凍后接入T75 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，緩慢補(bǔ)加細(xì)胞培養(yǎng)液至30 mL，置于37.0 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d。

（2）傳代。將1 個(gè)T75 按照1 ∶6 的傳代比例，傳2 個(gè)T225，置于37.0 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，此時(shí)的細(xì)胞代次為144。取1 個(gè)144 代的T225按照1 ∶6 的傳代比例，傳6 個(gè)T225，置于37.0 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，此時(shí)的細(xì)胞代次為145。取1 個(gè)145 代的T225 按照1 ∶6 的傳代比例，傳1 個(gè)CF2，置于37.0 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，此時(shí)的細(xì)胞代次為146。

（3）傳代比例控制。取146 代細(xì)胞消化后的細(xì)胞懸液，按照1 ∶4（7.5×104個(gè)/cm2）、1 ∶6（5×104個(gè)/cm2）、1 ∶8（3.75×104個(gè)/cm2）的接種密度接種至T75 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每個(gè)密度接種16 瓶，置于5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)（37±1）℃進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4.2 葡萄糖含量檢測(cè)及細(xì)胞計(jì)數(shù)

分別于24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 取3 瓶不同傳代比例細(xì)胞的上清液檢測(cè)葡萄糖含量，并消化細(xì)胞，取20 μL 細(xì)胞懸液用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，記錄培養(yǎng)上清液葡萄糖含量和細(xì)胞密度。

1.4.3 統(tǒng)計(jì)方法

以培養(yǎng)時(shí)間為X 軸，細(xì)胞數(shù)量為Y 軸，繪制不同傳代比例的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。使用Excel 2010 軟件，以葡萄糖累計(jì)消耗量為X 軸，以細(xì)胞數(shù)量為Y 軸作散點(diǎn)圖，添加線性趨勢(shì)線，得到葡萄糖消耗與細(xì)胞數(shù)量關(guān)系方程。

1.4.4 葡萄糖消耗和細(xì)胞數(shù)量關(guān)系在生物反應(yīng)器上的應(yīng)用

從反應(yīng)器中每天取培養(yǎng)上清液，用生化分析儀檢測(cè)其葡萄糖含量，再結(jié)合灌流量、上一次測(cè)得的培養(yǎng)上清液的葡萄糖含量，按照公式（1）計(jì)算出葡萄糖消耗量，將累計(jì)消耗的葡萄糖量代入葡萄糖消耗量與細(xì)胞數(shù)量關(guān)系方程，即可得到反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞總量。以培養(yǎng)時(shí)間為X軸，反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞總數(shù)為Y軸作生長(zhǎng)曲線，分析Vero 細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律。

其中，M為葡萄糖消耗量，M1為上次取樣測(cè)得的葡萄糖濃度，M2為灌流培養(yǎng)液葡萄糖濃度，M3為本次取樣測(cè)得的葡萄糖濃度，V1為生物反應(yīng)器培養(yǎng)體積，V2為灌流體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖消耗與細(xì)胞數(shù)量關(guān)系的確定

不同傳代比例的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。從生長(zhǎng)曲線上看，3 種傳代比例細(xì)胞均呈現(xiàn)S 型的生長(zhǎng)趨勢(shì)，延遲期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期初期時(shí)間基本一致，所選傳代比例對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響不大。

圖1 Vero 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

設(shè)置截距為0，1 ∶4、1 ∶6 和1 ∶8 傳代比例的葡萄糖消耗量與細(xì)胞數(shù)量的線性方程分別如圖2 所示，R2分別為0.966 1、0.983 3、0.969 1。葡萄糖消耗量與細(xì)胞數(shù)量基本呈線性關(guān)系，且呈現(xiàn)傳代比例越小斜率越大的規(guī)律；取3 個(gè)斜率的平均值4.107×108作為葡萄糖消耗量與細(xì)胞數(shù)量線性方程的系數(shù)，即每消耗1 g 葡萄糖對(duì)應(yīng)的細(xì)胞收獲量為4.107×108個(gè)，與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的每消耗1 g 葡萄糖對(duì)應(yīng)5.345×108個(gè)細(xì)胞非常接近。

圖2 葡萄糖消耗量與細(xì)胞數(shù)量關(guān)系

2.2 葡萄糖消耗量與細(xì)胞數(shù)量關(guān)系在反應(yīng)器上的應(yīng)用

Vero 細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)器培養(yǎng)，從圖3 所示的生長(zhǎng)曲線可以發(fā)現(xiàn)，0 ～2 d 細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，為停滯期；2 ～6 d 細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，葡萄糖消耗量不斷增加；5 ～6 d 達(dá)到最高峰，而后處于平臺(tái)期。

圖3 生物反應(yīng)器內(nèi)Vero 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

3 結(jié)論與討論

片狀載體和微載體細(xì)胞培養(yǎng)是最主流的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)工藝，而片狀載體相對(duì)于微載體培養(yǎng)，具有可以得到更高的細(xì)胞收獲量、灌流速度和換液操作可在很短的時(shí)間內(nèi)完成、不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成影響等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于病毒疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域[7]。如楊屹等[8]應(yīng)用片狀載體生產(chǎn)的Vero 細(xì)胞密度高達(dá)1.0×107個(gè)/mL，收獲的病毒液毒力達(dá)7.5×106～3.4×108FFU/mL；劉巖松等[9]使用籃式生物反應(yīng)器制備森林腦炎滅活疫苗（Vero 細(xì)胞），獲得細(xì)胞密度1.04×107個(gè)/mL，病毒收獲液平均滴度8.4 lg LD50/mL。

但片狀載體工藝存在無(wú)法將載體取出進(jìn)行計(jì)數(shù)的缺點(diǎn)[7]，對(duì)于片狀載體細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的文獻(xiàn)報(bào)道較少。周蕾等[6]使用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞，先建立Vero細(xì)胞濃度與電容的線性關(guān)系，然后檢測(cè)生物反應(yīng)器內(nèi)電容，通過(guò)電容值和線性方程算出細(xì)胞密度?；诖?，本文建立了葡萄糖消耗量與Vero 細(xì)胞數(shù)量的計(jì)算方法，即每消耗1 g 葡萄糖對(duì)應(yīng)的細(xì)胞數(shù)量為4.107×108個(gè)，在Cellipower 09-5L 反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)6 d 累計(jì)消耗葡萄糖71.28 g，所獲得細(xì)胞數(shù)量為2.93×1010個(gè)，為生物反應(yīng)器片狀載體細(xì)胞培養(yǎng)工藝細(xì)胞計(jì)數(shù)提供了一種方法。