朱婭敏，程倩，梁秋元

（1.酵母功能湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌 443003；2.宜昌市營(yíng)養(yǎng)健康食品工程技術(shù)研究中心，湖北宜昌 443003）

硒（Se）是一種人體必需的微量元素，缺硒會(huì)增加高血壓、糖尿病、心血管疾病、心臟病等的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。硒是硒蛋白的重要組成部分，而硒蛋白對(duì)活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）和活性氮（Reactive Nitrogen Species，RNS）引發(fā)的氧化應(yīng)激具有重要的抑制作用[1]。硒還是谷胱甘肽過氧化物酶的活性中心，在機(jī)體的抗氧化損傷體系中發(fā)揮作用，保護(hù)細(xì)胞（特別是細(xì)胞膜和細(xì)胞膜器）及組織免受過氧化物的損害[2]。因此，機(jī)體硒水平的高低直接影響機(jī)體抗氧化能力，以及對(duì)相關(guān)疾病的抵抗能力[3]。近年來的研究表明，硒對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能起著重要的作用。例如，SHOJADOOST 等[4]發(fā)現(xiàn)在雞日糧中補(bǔ)充硒可以增強(qiáng)雞抗病毒免疫能力，從而可能對(duì)控制家禽病毒感染產(chǎn)生有益作用；GAZDIK 等[5]評(píng)估了補(bǔ)硒對(duì)皮質(zhì)激素依賴性哮喘患者（Orticoid-Dependent Asthmatics，CDA）外周血分析的選定免疫參數(shù)的影響，臨床研究表明，硒可顯著改善細(xì)胞和體液免疫功能的參數(shù)。硒幾乎存在于所有的免疫細(xì)胞中，可通過谷胱甘肽過氧化物酶和硫氧還原酶的酶活性調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。硒還具有促進(jìn)免疫球蛋白合成作用，補(bǔ)硒可提高細(xì)胞和體液免疫的功能[6]。此外，機(jī)體內(nèi)硒的水平會(huì)影響1 型和2 型輔助T 細(xì)胞（Th1 細(xì)胞、Th2 細(xì)胞）之間的平衡，硒可以通過ROS、核因子κB（NF-κB）、鐵死亡和核轉(zhuǎn)錄因子紅系2 相關(guān)因子2（Nrf2）途徑影響身體的免疫功能[7]。

富硒酵母中有機(jī)硒含量占總硒量的99%以上[8]，并且均是以和硒代半胱氨酸的形式存在[9]，更易被人體吸收利用。許國(guó)洋等[10]研究發(fā)現(xiàn)，重組富硒酵母有利于緩解環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠的免疫抑制，其中中劑量組最佳。梁家豪等[11]發(fā)現(xiàn)，在羔羊日糧中添加0.3 mg/kg 的富硒酵母，可提高羔羊的生長(zhǎng)性能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗病力及抗氧化功能。

人參是一種珍貴的藥食同源中藥材，其主要功效成分是人參皂苷。人參有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、治療心血管疾病、增強(qiáng)造血功能、提高免疫力等功能。大量研究證實(shí)，人參中的人參皂苷可通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能、增加細(xì)胞免疫、促進(jìn)NK 細(xì)胞活性等方式起到調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的作用[12]，從而增強(qiáng)小鼠的非特異性免疫[13]。有研究指出，長(zhǎng)期食用人參也可調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)和脾細(xì)胞功能[14]。郭奕維等[15]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3 通過增強(qiáng)T 細(xì)胞增殖、抑制凋亡、增加細(xì)胞因子分泌等方式增強(qiáng)程序性死亡受體1（PD-1）抑制劑對(duì)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤的抗腫瘤作用。鄭厚勝等[16]證明人參皂苷Rg3 可明顯改善環(huán)磷酰胺致免疫功能低下小鼠的免疫功能。何昕[17]用人參皂苷Rg3 處理食管癌放療患者外周血后，誘導(dǎo)了淋巴細(xì)胞的增殖；IgM、IgG 抗體分泌增多，與對(duì)照組比較均有明顯差異，且呈劑量依賴性，說明人參皂苷Rg3 對(duì)食管癌放療患者的體外免疫具有促進(jìn)作用，并且濃度越大，促進(jìn)作用越強(qiáng)。

目前暫無富硒酵母和人參聯(lián)合使用的研究，僅有人將人參葉皂甙和硒聯(lián)用以協(xié)同增強(qiáng)雞新城疫疫苗的免疫功效[18]。本研究將富硒酵母和人參粉配伍產(chǎn)生協(xié)同作用，獲得增強(qiáng)免疫力作用，并證實(shí)復(fù)方制劑的功能。

1 材料與方法

1.1 樣品

富硒酵母，由安琪酵母股份有限公司提供；人參粉，購(gòu)自吉林宏久生物科技公司；復(fù)配成組合物粉，富硒酵母和人參粉質(zhì)量比1 ∶25。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及環(huán)境

SPF 級(jí)昆明種雌性小鼠200 只，體重為18 ～22 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。

飼養(yǎng)環(huán)境：SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室內(nèi)溫度20 ～26 ℃、濕度40%～70%。

1.3 主要儀器與試劑

Multiskan MK3 酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Labsystems公司；WIGGENS WCI-180 CO2培養(yǎng)箱，德國(guó)Wiggens公司；CX33 生物顯微鏡，日本OLYMPUS 公司；TS2倒置顯微鏡，日本尼康公司。

綿羊紅細(xì)胞（SRBC），上海源葉生物科技有限公司；雞紅細(xì)胞，自制；YAC-1 細(xì)胞，武漢尚恩生物技術(shù)有限公司；印度墨汁，BR，上海士鋒生物科技有限公司；瓊脂糖，美國(guó)Sigma；小牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；Hank’s 液，北京索萊寶科技有限公司；MTT，美國(guó)Sigma；ConA，美國(guó)Sigma；RPMI1640 培養(yǎng)液，美國(guó)Gibco；磷酸鹽緩沖液，北京索萊寶科技有限公司；甲醇，分析純，佛山西隴化學(xué)有限公司；丙酮，分析純，廣州市浩盈化工有限公司；酸性異丙醇，分析純，天津益仁達(dá)化工有限公司；二硝基氟苯，分析純，西亞化學(xué)科技(山東)有限公司；Na2CO3，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；冰醋酸，分析純，深圳市勛業(yè)化學(xué)試劑有限公司；1%乙基苯基聚乙二醇，北京雷根生物技術(shù)有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

動(dòng)物分為5 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組40 只，分別進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、淋巴器官/體重比值定和碳廓清實(shí)驗(yàn)、刀豆球蛋白A（ConA）誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和自然殺傷（NK）細(xì)胞活性測(cè)定、血清溶血素的測(cè)定和抗體生成細(xì)胞檢測(cè)、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置低、中、高3 個(gè)劑量組采用富硒酵母和人參粉組合物對(duì)小鼠灌胃，以及陰性對(duì)照組采用蒸餾水灌胃，每個(gè)處理10 只。3 個(gè)劑量組分別為人體推薦日攝入量（0.92 g，即0.015 3 g/kg BW）的10 倍、20 倍、30 倍，即0.153 g/kg BW、0.306 g/kg BW、0.459 g/kg BW。

1.5 判定標(biāo)準(zhǔn)

參考《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)指南》[19]中“增強(qiáng)免疫力功能檢驗(yàn)方法”觀察3 個(gè)劑量組對(duì)小鼠體重的增長(zhǎng)、細(xì)胞免疫功能、體液免疫和單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能、NK 細(xì)胞活性測(cè)定的結(jié)果，并參考其判定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

各結(jié)果均使用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用Minitab 20 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)小鼠淋巴器官/體重比值的影響

小鼠淋巴器官與體重的比值如表1 所示，各劑量組生長(zhǎng)情況良好，與陰性對(duì)照組相比，各劑量組小鼠的胸腺/體重和脾臟/體重的比值均無明顯差異（P＞0.05），說明富硒酵母與人參粉的組合物對(duì)小鼠淋巴器官/體重比值無影響。

表1 對(duì)小鼠淋巴器官/體重比值的影響

2.2 對(duì)細(xì)胞免疫功能的影響

通過小鼠ConA 誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和對(duì)小鼠2,4-二硝基氟苯（DNFB）誘發(fā)的遲發(fā)性超敏（DTH）反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，與陰性對(duì)照組相比，3 個(gè)劑量組對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖有提高趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）；小鼠耳重量差隨劑量增加有增大趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）。如表2 所示，說明受試物對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能無顯著影響。

表2 對(duì)細(xì)胞免疫功能的影響

2.3 對(duì)體液免疫功能的影響

通過小鼠抗體生成細(xì)胞（溶血空斑數(shù)）和血清溶血素試驗(yàn)評(píng)價(jià)富硒酵母和人參粉的復(fù)合物對(duì)體液免疫的影響，結(jié)果見表3。與陰性對(duì)照組相比，高劑量組的溶血空斑數(shù)明顯增多（P＜0.05），說明高劑量組能提高小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)量；低、中劑量組與陰性對(duì)照組并無顯著性差異（P＞0.05）。與陰性對(duì)照組相比，中、高劑量組的血清溶血素含量顯著提高（P＜0.05），而低劑量組無顯著差異。如表3 所示，低劑量組與中、高劑量組均存在顯著差異。這些結(jié)果說明，受試物中、高劑量對(duì)小鼠體液免疫功能有提升作用。

表3 對(duì)抗體生成細(xì)胞功能和溶血素滴度水平的影響（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）

2.4 對(duì)單核-巨噬細(xì)胞功能的影響

通過小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)受試物對(duì)單核-巨噬細(xì)胞功能的影響。與陰性對(duì)照組比較，高劑量組能顯著提高小鼠碳廓清吞噬指數(shù)（P＜0.01）和小鼠吞噬指數(shù)（P＜0.01），而中、低劑量組與對(duì)照組相比無顯著差異，（P＞0.05），結(jié)果見表4。

表4 對(duì)小鼠碳廓清功能和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

2.5 對(duì)小鼠NK 細(xì)胞活性的影響

如表5 所示，與陰性對(duì)照組相比，富硒酵母和人參粉組合物的低、中劑量組NK 細(xì)胞活性稍有增強(qiáng)，但差異不顯著（P＞0.05）。高劑量組與對(duì)照組和低劑量組對(duì)比有顯著差異（P＜0.05），與中劑量組對(duì)比無顯著差異（P＞0.05）。證明受試物高劑量組能提高小鼠NK 細(xì)胞活性。

表5 對(duì)小鼠NK 細(xì)胞活性的影響

3 討論與結(jié)論

富硒酵母主要是通過抗氧化提高機(jī)體的免疫力，人參對(duì)機(jī)體免疫力的提升可能與人參皂苷改善中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬能力，以及抗氧化能力有關(guān)[20]。已有將富硒酵母和中藥配伍進(jìn)行的功能研究，但功能主要集中在提高免疫、抗衰老等[21-22]。富硒酵母的生物利用度比亞硒酸鈉更高，ZHANG 等[23]報(bào)道了由富硒酵母轉(zhuǎn)化成體內(nèi)的硒代蛋氨酸，結(jié)果表明富硒酵母在大鼠體內(nèi)的生物利用度為87%。HAMAD 等[24]的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)將富硒酵母和人參復(fù)配，研究了其復(fù)合物的免疫力功能。富硒酵母和人參粉配伍的組合物每人每天推薦攝入量為0.92 g，即0.015 3 g/kg BW。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的0.153 g/kg BW、0.306 g/kg BW、0.459 g/kg BW三個(gè)劑量組分別為正常人體每日攝入量的10 倍、20 倍、30 倍，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組。動(dòng)物經(jīng)過連續(xù)灌胃后測(cè)試，3 個(gè)劑量組對(duì)小鼠體重的增長(zhǎng)、小鼠細(xì)胞免疫功能沒有顯著影響；中、高劑量組能顯著提升體液免疫和單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能（P＜0.05），高劑量組能提升NK 細(xì)胞活性（P＜0.05）。按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)指南》中的建議，綜合以上各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，可以認(rèn)為富硒酵母和人參粉組合物具有增強(qiáng)免疫力功能。

隨著國(guó)家對(duì)傳統(tǒng)中醫(yī)藥發(fā)展的重視，國(guó)家發(fā)布了《按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)目錄管理規(guī)定》，從目錄制管理改為申報(bào)制，相關(guān)物質(zhì)的應(yīng)用更加開放。2021 年，國(guó)家衛(wèi)生健康委發(fā)布《關(guān)于對(duì)黨參等9 種物質(zhì)開展按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)管理試點(diǎn)工作的通知》指出，對(duì)黨參、肉蓯蓉、鐵皮石斛、西洋參、黃芪、靈芝、山茱萸、天麻、杜仲葉9 種物質(zhì)開展按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)試點(diǎn)工作。將生物制品與食藥物質(zhì)相結(jié)合，研究其功效對(duì)新藥研發(fā)和食藥同源類保健食品的發(fā)展有著重要的意義。