魏寶紅，劉佳，畢旺華，胡淑曼，馬曉青，楊文哲，楊雪*，孫皓巖，張鵬

（1.中國海洋大學 醫(yī)藥學院，山東青島 266003；2.青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東青島 266071）

桑黃（Inonotus hispidus）屬真菌界、擔子菌門、傘菌綱、銹革孔菌目、銹革孔菌科，是一種多年生的珍稀食藥兼性菌類，屬于高附加值食用菌，有“森林黃金”之美稱，是目前國際公認的生物治癌領域中有效率排在第一位的藥用菌[1-4]?！渡褶r本草經》《藥性論》和《本草綱目》等記載，桑黃利五臟，宣腸胃氣，排毒氣。桑黃的主要活性成分為多糖、黃酮及三萜類物質，具有很好的抗腫瘤、降血糖、降血脂和活血化瘀等功效[5-10]。

桑黃菌屬于多基原真菌，目前我國桑黃類真菌主要包括桑黃菌屬的桑樹桑黃菌（Sanghuangporus sanghuang）、鮑姆桑黃菌（S. baumii）、瓦寧桑黃菌（S. vaninii）和纖孔菌屬的粗毛纖孔菌（Ionnouts hispidus）等[11-12]。野生桑黃在我國主要分布在東北、西藏南部及東南部，云南、四川、湖南、湖北、陜西山區(qū)也有少量分布，國外主要分布在日本、韓國、俄羅斯等地。野生桑黃在中國經過多年的采收后，產量逐年減少，較大型的子實體需要10 年以上長成[13]。由于其自身這種生理狀態(tài)的特殊性、復雜性及外界環(huán)境的影響，野生桑黃菌子實體稀少，且人工栽培周期長，其產量已無法滿足人們對珍稀桑黃日益增長的需求，使得桑黃子實體的開發(fā)和利用受到了限制，因此探究桑黃液體發(fā)酵菌絲體替代子實體的應用極具開發(fā)意義。液體發(fā)酵技術具有生產周期短、工藝簡單、效率高等優(yōu)點，可有效解決桑黃資源短缺問題。

本研究以菌絲體生物量、胞內多糖含量、胞內黃酮含量、DPPH 清除率等為考察指標，通過單因素試驗和正交試驗確定最優(yōu)液體發(fā)酵培養(yǎng)基，并進行擴大培養(yǎng)，研究桑黃菌絲體在放大生產過程中菌絲體質量、胞內成分的變化規(guī)律。同時，對擴大培養(yǎng)獲得菌絲的生物活性進行初步評價，以期為工業(yè)生產過程中桑黃發(fā)酵產物的精準把控提供依據，為桑黃菌絲體的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

MDQ-B1T 振蕩培養(yǎng)箱，上海旻泉儀器有限公司；ZHJH-C1115B 垂直流超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；LDZH-150KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；ME204E 萬分之一天平，梅特勒-托里斯多儀器（上海）有限公司；GL 冷凍高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；UV6000PC 紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；HWS-26 水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；30 L 自動滅菌發(fā)酵罐，上海百侖生物科技有限公司。

1.2 材料與試劑

實驗用菌種由臨清清源正本生物醫(yī)藥科技有限公司提供；人非小細胞肺癌細胞A549、人結腸癌細胞HCT-116、人肝癌細胞HepG2、人乳腺癌細胞MCF-7、人宮頸癌細胞Hela、人臍靜脈內皮細胞HUVEC，中科院上海細胞庫；安琪酵母浸粉FM902（2022051401B1），安琪酵母股份有限公司；麥芽糖（2020210416），國藥集團化學試劑有限公司；馬鈴薯淀粉（食品級），上海楓未食業(yè)有限公司；蛋白胨（BR，20190520），北京雙玄微生物培養(yǎng)基制品廠；玉米面粉（食品級），嘉祥永勝食品有限公司；可溶性淀粉、尿素、蔗糖、乳糖、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化銨、硫酸銅、硫酸鋅及亞硫酸鐵等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。PBS 磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.2 ～7.4，批號為2022102403）、RPMI1640 培養(yǎng)液（貨號CR31800，批號2022101103）、DMEM 高糖培養(yǎng)液（貨號CR12800，批號2022112502）、McCOY’S 5A（貨號CR16600，批號2022032202），均購自浙江森瑞生物科技有限公司；鹽酸阿霉素（703E021），北京索萊寶科技有限公司；青鏈霉素混合液（20221012），北京索萊寶科技有限公司；Tris（161-0716），美國BIO-RAD 公司；SRB（MKBG5106V），北京索萊寶科技有限公司；96 孔細胞培養(yǎng)板、90 mm×20 mm 細胞培養(yǎng)皿，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基配方

（1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g/L（煮汁），葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L。

（2）液體種子培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g/L（煮汁），葡萄糖20 g/L。

（3）基礎培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母浸粉5 g/L、KH2PO46 g/L、MgSO43 g/L。

1.3.2 菌種活化

接種桑黃菌種于PDA 固體培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d。

1.3.3 液體種子培養(yǎng)

將活化后的菌種用接種環(huán)取同樣大小的菌塊（0.5 cm×0.5 cm），每瓶接種5 個菌塊，每個500 mL培養(yǎng)瓶的裝液量為200 mL，于28 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)10 d。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 試驗設計

（1）碳源篩選試驗：在基礎培養(yǎng)基配方中，分別以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖、馬鈴薯淀粉為碳源，添加量為20 g/L，接種量為10%，裝液量40%，于28 ℃、160 r/min 培養(yǎng)7 d，每組設定3 個重復，測定菌絲體質量、胞內多糖產量、胞內黃酮產量。

（2）氮源篩選試驗：在基礎培養(yǎng)基配方中，分別以麩皮、玉米粉、酵母浸粉、蛋白胨、氯化銨、尿素為氮源，添加量為5 g/L，其他試驗條件及考察指標同1.3.4.1 項（1）。

（3）無機鹽種類篩選：在基礎培養(yǎng)基配方中，分別 添 加1 g/L MnSO4、ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CuSO4和Na2SO4，以不加上述無機鹽為對照，其他試驗條件及考察指標同1.3.4.1 項（1）。

（4）碳源添加量考察：在確定了最優(yōu)碳源、氮源、無機鹽種類后，碳源添加量設定為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%，保持其他培養(yǎng)基組成比例不變[同1.3.1（3）]，試驗條件及考察指標同1.3.4.1項（1）。

（5）氮源添加量考察：在確定了最優(yōu)碳源、氮源、無機鹽種類后，將氮源添加量設定為0.25%、0.50%、1.00%、2.00%、4.00%，其他培養(yǎng)基組成比例不變[同1.3.1（3）]。其他試驗條件及考察指標同1.3.4.1 項（1）。

（6）無機鹽添加量考察：有文獻報道，藥用真菌桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化中，無機鹽的添加量范圍較窄，通常最優(yōu)比例在0.1%～0.2%[14-15]，本文在確定了無機鹽種類的基礎上選取無機鹽添加量為0.05%～0.20%，并進行下一步正交試驗考察。

1.3.4.2 試驗評價方法

以菌絲體生物量、單位質量菌絲體中總糖含量、單位質量菌絲體中總黃酮含量為主要評價指標，進行單因素試驗考察，并計算綜合得分。綜合得分按公式（1）計算。

式中：MB、TS、TF分別代表實驗中測定樣品的菌絲體生物量、單位質量菌絲體總糖含量、單位質量菌絲體總黃酮含量；MBmax、TSmax、TFmax分別代表實驗中測定樣品的菌絲體生物量、單位質量菌絲體總糖含量、單位質量菌絲體總黃酮含量的最大值。

1.3.5 正交試驗

1.3.5.1 試驗設計

以單因素試驗為基礎，選用L9(34)正交表進行試驗，每個因素設定3 個水平，因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.5.2 評價方法

試驗條件及考察指標同1.3.4.1 項（1），以菌絲體質量、單位質量菌絲體中總糖含量、單位質量菌絲體中總黃酮含量及DPPH 清除率等指標的綜合評分進行評價。綜合評分按公式（2）計算。

式中：MB、TS、TF、DC分別代表實驗中測定樣品的菌絲體生物量、單位質量菌絲體總糖含量、單位質量菌絲體總黃酮含量和DPPH 清除率；MBmax、TSmax、TFmax、DCmax分別代表實驗中測定樣品的菌絲體生物量、單位質量菌絲體總糖含量、單位質量菌絲體總黃酮含量和DPPH 清除率的最大值。

1.3.5.3 最優(yōu)工藝驗證試驗

按照優(yōu)化后的發(fā)酵工藝進行驗證，設定3個重復，結果取平均值。

1.3.6 擴大培養(yǎng)

采用試驗優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行30 L 發(fā)酵罐的擴大培養(yǎng)，初步探索放大工藝。在30 L 發(fā)酵罐中加18.0 L 液體培養(yǎng)基，閉罐，于115 ℃滅菌1 h 后用冷卻水循環(huán)冷卻。取500 mL 錐形瓶培養(yǎng)10 d 的桑黃菌絲體10 瓶，在無菌操作下倒入發(fā)酵罐中，接種量為10%，設定溫度為28 ℃，攪拌漿轉速為300 r/min，罐內氣壓為0.02 ～0.04 MPa，培養(yǎng)9 d，觀察記錄。

1.3.7 指標測定

（1）菌絲體生物量的測定：將發(fā)酵液收集后用紗絹過濾，將紗絹上的菌絲體用無菌水淋洗2 次后，每次取200 mL，10 000 r/min 離心10 min，取沉淀于60 ℃烘箱中烘干，稱重得菌絲體產量。

（2）菌絲體中總糖含量測定：將菌絲體烘干后研磨，采用熱水浸提法進行提取，具體方法為料液比1 ∶20（g ∶mL），提取溫度60 ℃，提取時間2.5 h，12 000 r/min 離心10 min，取上清，提取2 次，合并上清液，備用[16-18]。以葡萄糖為標準品，采用蒽酮-硫酸法測定菌絲體總糖含量[19-21]。

（3）菌絲體中總黃酮含量測定：將菌絲體烘干后研磨，取0.2 g 加2 mL 70%乙醇，在70 ℃下超聲提取兩次，每次0.5 h，12 000 r/min 離心10 min，取上清，提取2 次，合并上清液，備用[22-25]。以蘆丁為標準品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定黃酮含量[25-26]。

1.3.8 抗氧化活性測定

以維生素C 為陽性對照，按照CHEN 等[27]的方法測定DPPH 自由基清除活性，清除率按公式（3）計算。

式中：A1表示樣品在517 nm 處的吸光度；A2表示以70%乙醇代替樣品測定的吸光度；A0表示以70%乙醇代替DPPH 溶液測定的吸光度。

1.3.9 抗腫瘤活性測定

采用SRB 法測定桑黃菌絲體對6 種細胞的增殖抑制能力。取對數生長期的A549、HCT-116、HepG2、MCF-7、Hela、HUVEC 細胞分別以5 000個/孔接種于96 孔板，四周加入100 μL PBS 防止邊緣效應。將96 孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁。將之前培養(yǎng)的96 孔板取出，棄去培養(yǎng)基，加入不同種類的含藥培養(yǎng)基。設置樣品組、陰性對照組和陽性對照組。其中，樣品組分別為正交驗證試驗樣品（S1）、擴大培養(yǎng)第5 天的樣品（S2），終濃度均為100 μg/mL；陽性對照組藥物為阿霉素，終濃度為1 μmol/L；陰性對照組加入同樣品組相同體積的無菌水，每個樣品設3 個復孔。藥物作用72 h 后，每孔加入50%（m/v）冰冷的三氯乙酸（TCA）固定細胞，SRB 染色后，加入Tris 溶液，于酶標儀上測定540 nm處的OD 值，按公式（4）計算受試樣品對腫瘤細胞生長的抑制率。

式中，ODck和ODeg分別為540 nm 下對照組和給藥組的OD值。

1.4 數據統(tǒng)計及分析

每組試驗平行測定3 次，結果以±s表示。檢測結果采用Excel 2021軟件作圖，SPSS 21.0軟件分析，采用t-test 統(tǒng)計分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 種類篩選結果

由圖1 可以看出，碳源、氮源、無機鹽的種類對桑黃液體發(fā)酵影響較大。當培養(yǎng)基中的碳源為蔗糖時，綜合評分最高，因此本研究選擇蔗糖作為碳源；當選擇酵母浸粉、麩皮與蛋白胨為氮源時，評分較高且無顯著性差異，綜合考慮，選擇酵母浸粉作為氮源；無機鹽的選擇中，硫酸銅可以明顯促進桑黃液體發(fā)酵各評價指標的提高。因此，確定培養(yǎng)基的碳源、氮源、無機鹽種類分別為蔗糖、酵母浸粉和硫酸銅。

圖1 不同碳源、氮源、無機鹽種類對桑黃發(fā)酵結果的影響

2.1.2 添加量篩選結果

如圖2 所示，蔗糖添加量在1%～4%時，評分基本一致，因此本文選擇蔗糖添加量為1%～3%進行后續(xù)正交試驗；酵母浸粉的添加量考察中，未獲得明顯的平臺期，提示后期的正交試驗需繼續(xù)提高酵母浸粉的添加量，本文設置酵母浸粉添加量為2%～6%進行后續(xù)正交試驗。

圖2 碳源、氮源添加量對桑黃發(fā)酵指標的影響

2.2 正交試驗結果

正交試驗結果及方差分析見表2、表3。由R值可知，影響桑黃發(fā)酵程度的因素為B ＞C ＞A，K值分析可知最佳培養(yǎng)基配方為A3B1C2，即蔗糖3%、酵母浸粉2%、硫酸銅0.1%，但該配方組合與正交表中最優(yōu)組合不一致，因此進行進一步的驗證。驗證試驗結果顯示，A3B1C2組合的綜合評分均值為0.93 分，相對誤差較小，試驗結果穩(wěn)定，可為以液態(tài)發(fā)酵法大量生產菌絲體提供理論支持，因此確定最佳組合為A3B1C2。

表2 正交試驗結果表

表3 正交實驗結果的方差分析

2.3 擴大培養(yǎng)實驗結果

為了逐步將桑黃的發(fā)酵工藝應用于實踐中，將搖瓶的發(fā)酵條件進行30 L 的擴大培養(yǎng)，從第5 天起，每隔24 h 取樣，共培養(yǎng)9 d，測定菌絲體生物量、菌絲體的總糖含量、總黃酮含量及DPPH 清除率。由表4 可知，本次擴大培養(yǎng)第5 天樣品的綜合評分最高（0.90分），發(fā)酵菌絲體生物量為9.74 g/L（第5 天），較正交驗證試驗所得菌絲體生物量提高了41.36%，而單位質量菌絲體中總糖含量、單位質量菌絲體中總黃酮含量及DPPH 清除率呈現不同程度的下降。結合兩種培養(yǎng)規(guī)格下菌絲的生長狀態(tài)（搖瓶中主要是菌絲球，而發(fā)酵罐中主要是菌絲），推測原因可能是擴大培養(yǎng)時，發(fā)酵罐中攪拌槳的轉速為300 r/min，明顯高于搖瓶轉速（160 r/min），較高的轉速增加了溶氧量，促進菌絲體生物量的大幅提升；但較高轉速容易導致菌絲無法生長成球，且細胞壁破壞程度高，菌絲的胞內成分大量溶出至發(fā)酵液中，從而導致菌絲體中各成分含量的減少。

表4 擴大培養(yǎng)實驗結果表（±s）

表4 擴大培養(yǎng)實驗結果表（±s）

樣品來源 樣品名稱 培養(yǎng)時間/d 指標 綜合評分/分生物量/（g/L） 總糖含量/（mg/g） 總黃酮含量/（mg/g） DPPH 清除率/%正交驗證 S1 7 6.89±0.22 120.30±3.21 4.90±0.08 75.07±2.21 0.93±0.02擴大培養(yǎng)S2 5 9.74±0.28 68.84±1.22 2.56±0.07 28.95±0.82 0.90±0.02 S3 6 10.18±0.33 59.62±1.32 2.10±0.03 28.74±0.78 0.80±0.02 S4 7 10.78±0.35 52.57±1.11 2.10±0.03 30.69±0.75 0.81±0.01 S5 8 11.39±0.32 54.70±1.20 2.40±0.05 26.32±0.62 0.77±0.02 S6 9 14.39±0.25 40.14±1.08 1.98±0.03 25.11±0.55 0.71±0.01

2.4 桑黃菌絲體體外抗腫瘤活性

結合表4 可知，擴大培養(yǎng)第5 天樣品的綜合評分最高（0.90 分），因此選取第5 d 的樣品進行體外抗腫瘤活性評價。對正交驗證樣品S1 和擴大培養(yǎng)樣品S2的體外抗腫瘤活性進行測定，結果見表5。2 個樣品對HCT-116、Hela、HUVEC、HepG2 均表現出不同程度的抑制作用，其中對HUVEC 細胞的增殖抑制作用最強，且S2 活性明顯高于S1；2 個樣品對A549、MCF-7 細胞的增殖未表現出抑制作用。

表5 2 種桑黃水提物對6 種人源腫瘤細胞的體外抑制率（±s，%）

表5 2 種桑黃水提物對6 種人源腫瘤細胞的體外抑制率（±s，%）

組別 HUVEC HepG2 Hela HCT-116 A549 MCF-7 S1 36.59±3.79 17.19±1.90 19.12±0.45 19.00±1.92 3.92±2.90 -11.03±5.70 S2 45.31±0.06 39.67±2.28 18.88±4.51 14.74±1.93 2.73±2.37 2.34±0.05阿霉素 93.59±0.01 92.02±0.54 88.31±4.51 94.01±0.61 92.21±0.3 71.13±2.43

3 討論與結論

藥用真菌發(fā)酵方式包括固體發(fā)酵和液體發(fā)酵。其中，固態(tài)發(fā)酵即人工栽培技術，在藥用真菌的生產中有一定的應用，但是由于藥用真菌生理需求的特殊性和復雜性，人工栽培藥用真菌技術存在周期長、能耗高、產率低等問題，嚴重制約了藥用真菌的開發(fā)利用。利用液體發(fā)酵技術獲取菌絲體代替子實體是目前的研究熱點。液體發(fā)酵培養(yǎng)具有菌絲體產量高、培養(yǎng)周期短、可控性好等優(yōu)點，更易于工業(yè)化大量生產，具有廣泛的市場前景。在液體發(fā)酵中，菌絲體的生長及有效成分的積累不僅與碳源、氮源、無機鹽的種類密切相關，而且受碳氮源、無機鹽比例及濃度的影響。本研究通過單因素和正交試驗，篩選出適用于桑黃液態(tài)發(fā)酵的最佳工藝，同時進行放大培養(yǎng)，并對其菌絲體抗腫瘤活性進行了初步探索。研究確定了桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為蔗糖3%、酵母浸粉2%、硫酸銅0.1%、磷酸二氫鉀0.6%、硫酸鎂0.3%，優(yōu)化得到的培養(yǎng)工藝條件穩(wěn)定、重復性良好，成本較低，適合放大生產。抗腫瘤活性研究結果顯示，液體發(fā)酵菌絲體水提物對HUVEC、HepG2 有較強的增殖抑制作用。

本研究中30 L 發(fā)酵罐的擴大培養(yǎng)為桑黃液態(tài)發(fā)酵的擴大生產和應用奠定了堅實基礎，對桑黃的優(yōu)質高產具有重要的指導意義，可有效解決其資源匱乏的問題。后續(xù)將對液態(tài)發(fā)酵菌絲體與子實體在成分、功效方面的差異進行對比研究，以期推動桑黃在食藥用菌產業(yè)方面的推廣和應用。