袁志剛，吉斌，何俊辰，王晉

（天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津， 300120）

帶狀皰疹是由水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）重新激活所引起。帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛（PHN）是最常見的并發(fā)癥[1]，發(fā)生在大約20%的患者身上。帶狀皰疹后持續(xù)至少90 d 以上的皮區(qū)疼痛被定義為PHN。線粒體功能異常會引起炎性反應和氧化應激，導致神經(jīng)元的損傷和細胞凋亡，參與PHN 的發(fā)生發(fā)展。因此，保護線粒體功能可能是預防和治療PHN 的重要策略之一。PHN 治療的重點是控制癥狀，包括外用利多卡因、辣椒素以及口服加巴噴丁、普瑞巴林、三環(huán)類抗抑郁藥等，然而藥物不良反應使臨床應用受到了一定的限制。針灸的治療效果已經(jīng)在臨床上得到了廣泛的應用，因為不良反應小，得到患者和醫(yī)生的認可。本研究觀察電針治療對PHN 線粒體功能的影響，并探討其相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組選擇 清潔級健康雄性SD大鼠54 只，8～10 周齡，體質量250～300 g，購自解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心[許可證號SCXK-（軍）2009-003]。大鼠在12 h 的光/暗循環(huán)、單獨通風的環(huán)境中飼養(yǎng)，在適應環(huán)境3 d 后，用于實驗。將大鼠按隨機原則分為對照組（Con 組），模型組（PHN組）和模型+治療組（PHN+T 組）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型復制和處理 參照文獻[2]的方法，麻醉大鼠后，將解凍后的單純皰疹病毒Ⅰ型（HSV-1）株制成病毒懸液（濃度為106/100 μL，注射容積50 μL），注射到大鼠右后爪皮下，注射5 d 后皮膚出現(xiàn)帶狀皰疹樣皮疹，表現(xiàn)為玫瑰型疹子或透亮水皰和疼痛相關反應，表現(xiàn)為觸痛異常和機械性痛覺過敏。制模后PHN+T 組行電針治療，選陽陵泉穴、環(huán)跳穴電針刺激，進針3 mm，提插捻轉，連接電針儀，波寬0.1 ms，刺激強度1 mA，刺激頻率為2 Hz，均刺激0.5 h，連續(xù)7 d。

1.2.2 機械痛敏（MWT）和熱痛敏（TWL） MWT 的檢測采用von Frey filament 儀（Stoeling 公司，美國）測定右側后肢觸誘發(fā)痛閾值。具體方法：大鼠被關在一個有網(wǎng)眼地板的塑料籠子里1 h，以適應環(huán)境。用不同壓力的von Frey 纖維絲（從小到大0～60 g）以垂直于后爪足底表面方向刺激大鼠皮膚敏感處，每隔10 min 刺激1 次，重復3 次。當大鼠對von Frey 細絲的刺激做出反應，立即收回后爪時記錄壓力。去掉最大及最小值后取3 次的平均值代表機械性撤足閾值（PWT）。于注射前1 d、注射后7、14 和21 d分別測定PWT。為了避免研究者之間的錯誤，整個過程由同一研究者完成。

TWL 的檢測：在實驗前將大鼠在有機玻璃板上保持1 h 以進行馴化。大鼠左后爪受到不同強度紅外輻射刺激，直到其將爪子從地板上抬起。記錄從開始輻射到出現(xiàn)縮足反應的時間，每次照射間隔5 min，取5 次照射的平均值。

1.2.3 線粒體膜電位（MMP）檢測 于制模7 d 后取L4～5 節(jié)段脊髓背角，提取線粒體。用熒光染料JC-1（Beyotime，中國）測量MMP 水平。將線粒體與JC-1染料在37 ℃黑暗環(huán)境中孵育30 min。觀察到紅色和綠色熒光，并將該比率計算為MMP 值。

1.2.4 線粒體呼吸控制率（RCR） 于制模7 d 后取L4～5 節(jié)段脊髓背角提取線粒體，采用Clark 型氧電極技術測定線粒體呼吸功能。記錄線粒體狀態(tài)3 和狀態(tài)4 的呼吸，狀態(tài)3 與狀態(tài)4 的比率為RCR，以反映線粒體的呼吸功能[3]。

1.2.5 三磷酸腺苷（ATP）的檢測 于制模7 d 后取L4～5 節(jié)段脊髓背角，在冰上裂解，在4 ℃下以10 000 r/min（離心半徑為13.5 cm）離心10 min。采用商業(yè)ATP 測定試劑盒（Beyotime，中國）檢測上清液中ATP 水平，操作按劑盒說明進行。

1.2.6 活性氧（ROS）的檢測 于制模7 d 后取L4～5節(jié)段脊髓背角提取線粒體。用氧自由基敏感的DCFH-DA 探針（Beyotime，中國）測定線粒體中的ROS 水平。將線粒體與DCFH-DA 溶液在37 ℃下孵育30 min。用流式細胞儀（BD Biosciences）對其進行檢測ROS 的采集數(shù)量。

1.2.7 炎性因子的檢測 于制模7 d 后取L4～5 節(jié)段脊髓背角，制成組織勻漿，用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測炎性因子[腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、IL-6]水平，操作按試劑盒說明書進行。

1.2.8 采用蛋白質免疫印跡試驗（Western blotting，WB）檢測NOD 樣受體蛋白3（NLRP3），IL-1β 和胱天蛋白酶-1（Caspase-1）的蛋白表達 各組于制模7 d 后取L4～5 節(jié)段脊髓背角提取蛋白質。使用BCA蛋白質檢測試劑盒（美國賽默飛世爾科學公司）對提取的蛋白質進行定量。采用WB 法檢測NLRP3，IL-1β 和Caspase-1 的蛋白表達以目的蛋白與β 肌動蛋白（β-actin）的比值表示目的蛋白的表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有計量資料均符合正態(tài)分布以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者采用LSD 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 針刺治療對PHN 大鼠MWT 和TWL 的影響 與Con 組比較，PHN 組大鼠MWT 和TWL 閾值于首次注射后21 d 出現(xiàn)明顯的下降，在第7 天時為最低值（P<0.05），與PHN 組比較，PHN+T 組從第7 天開始，MWT 和TWL 閾值開始明顯升高，第14 天和第21 天MWT 和TWL 閾值差異仍有統(tǒng)計學意義（均P<0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠不同時間點行為學評分比較

2.2 針刺治療對PHN 大鼠線粒體功能的影響 與Con 組比較，PHN 組大鼠MMP、RCR 和ATP 均明顯降低，ROS 釋放增加（均P<0.05）；與PHN 組比較，PHN+T 組大鼠MMP、RCR 和ATP 均明顯升高，ROS釋放減少（均P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠線粒體功能的比較（±s）

表1 各組大鼠線粒體功能的比較（±s）

注：與Con 組比較，aP<0.05；與PHN 組比較，bP<0.05。

組別n MMP（RFU） RCR（%） ATP（μmol/g）ROS（RFU）Con 組181002.8±0.50280±20100 PHN 組1860±15a1.2±0.25a140±10a550±50a PHN+T 組 1885±15b2.2±0.40b230±15b280±40b

2.3 針刺治療對PHN 大鼠炎性因子的影響 與Con 組比較，PHN 組大鼠炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6 含量均明顯升高（均P<0.05），與PHN 組比較，PHN+T 組大鼠炎性因子TNF-α、IL-1β 和IL-6均明顯降低（均P<0.05），見表2。

表2 各組大鼠炎性因子水平的比較（pg/mg，±s）

表2 各組大鼠炎性因子水平的比較（pg/mg，±s）

注：與Con 組比較，aP<0.05；與PHN 組比較，bP<0.05。

組別nTNFIL-1βIL-6 Con 組18 組18100± 10100± 10100± 10 PHN1200±100a1000±100a850±100a PHN+T 組18450± 50b440± 40b370± 20b

2.4 針刺治療對PHN 大鼠NLRP3 信號通路的影響 與Con 組比較，PHN 組大鼠NLRP3 及其下游信號分子IL-1β 和Caspase-1 均明顯升高（均P<0.05），與PHN 組比較，PHN+T 組NLRP3 及其下游信號分子IL-1β 和Caspase-1 均明顯降低（均P<0.05），見表3。

表3 各組大鼠NLRP3 和下游信號分子的比較（±s）

表3 各組大鼠NLRP3 和下游信號分子的比較（±s）

注：與Con 組比較，aP<0.05；與PHN 組比較，bP<0.05。

Caspase-1/β-actin Con 組180.16±0.020.16±0.0250.14±0.02 PHN 組180.59±0.03a0.47±0.12a0.40±0.10a PHN+T 組180.30±0.025b0.28±0.08b0.29±0.08b組別nNLRP3/β-actin IL-1β/β-actin

3 討論

PHN 是一種神經(jīng)痛或復發(fā)性疼痛，通常是由于VZV 侵犯脊髓后根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元所致[1]。線粒體功能異常和炎性因子反應在PHN 的發(fā)病機制中都扮演著重要的角色，并且二者之間存在著相互作用。線粒體是細胞內能量代謝的主要場所，而線粒體功能異常會導致神經(jīng)元內能量供應不足，從而導致神經(jīng)元代謝異常[4-5]。此外，線粒體功能異常也會引起神經(jīng)元的氧化應激和影響神經(jīng)元的凋亡過程，進一步加重PHN 的癥狀[3]。本研究結果與上述結論一致，模型組線粒體功能惡化，表現(xiàn)為MMP 下降，RCR 明顯降低，ATP 減少，ROS 釋放增加；針刺治療后，上述線粒體功能得到明顯好轉。

此外，炎性反應也參與了PHN 的發(fā)病機制，PHN 患者的神經(jīng)系統(tǒng)會產(chǎn)生大量炎性介質，如細胞因子和趨化因子，這些炎性介質會導致神經(jīng)元的死亡和神經(jīng)元內環(huán)境的改變。同時，炎性反應也會導致線粒體功能異常的發(fā)生和加重，炎性因子介質如TNF-α 和IL-6 等可以抑制線粒體功能，增加線粒體內氧化應激程度，從而加重PHN 的癥狀。本實驗結果表明，模型組炎性因子TNF-α、IL-1β 和IL-6明顯增加，炎性因子反應惡化，針刺治療后，炎性反應減輕，表現(xiàn)為TNF-α、IL-1β 和IL-6 的過量釋放被抑制。

NLRP3 通過促進炎性因子反應在PHN 中發(fā)揮作用。VZV 感染后，機體會釋放IL-1β、IL-6 和TNF-α多種炎性介質等，導致神經(jīng)炎性因子反應和神經(jīng)元損傷，從而引發(fā)PHN。在PHN 中，NLRP3 被激活后可以誘導IL-1β 的分泌，從而加劇炎性因子反應，進一步損傷神經(jīng)組織。有研究表明，在PHN 患者中，IL-1β 和NLRP3 的表達均明顯升高，提示NLRP3介導的炎性因子反應可能是導致PHN 發(fā)生的重要機制之一[6]。本研究顯示，NLRP3 及其下游信號分子IL-1β 和Caspase-1 的表達趨勢與上述結論一致，NLRP3 及其下游信號分子IL-1β 和Caspase-1 的表達增加；針刺治療后，NLRP3 及其下游信號分子IL-1β 和Caspase-1 的表達下降，與炎性因子的反映趨勢一致。

綜上所述，線粒體功能異常在PHN 的發(fā)病機制中起著至關重要的作用，可能是PHN 的重要發(fā)病機制之一。未來的研究可以進一步探討線粒體功能異常與PHN 之間的關系，以便更好地理解PHN的發(fā)病機制，為PHN 的治療提供新的思路和方法。