曹婷，談楚琛，周潔，翟曉翔

（1.蘇州工業(yè)園區(qū)星塘醫(yī)院，江蘇蘇州 215000；2.淮陰醫(yī)院，江蘇淮安 223001；3.上海市第七人民醫(yī)院，上海 200137）

近代藥理學(xué)研究表明，氧化白藜蘆醇有多種生物活性，能有效清除過氧化氫（H2O2）、一氧化氮（NO）以及自由基，其有效成份含有抗酪氨酸酶[1]，有保護神經(jīng)[2]、抗氧化、抗炎[3-4]、抗腫瘤[5]、保護肝功能[6]等作用。

近年來真菌感染日益常見，念珠菌已成為常見的院內(nèi)感染病原菌，其菌血癥的病死率達40%～60%[7]。隱球菌作為一種機會性真菌病原體，在人體免疫功能低下時會引起致命感染[8]。隱球菌是人類重要的條件致病真菌，每年造成超過100 萬例的感染和超過23 萬人死亡[9]。因此，抗真菌藥物體外藥敏實驗對監(jiān)測耐藥菌株的出現(xiàn)及真菌耐藥性的研究有重要意義[10]。目前關(guān)于其抗真菌作用的研究較少，本研究參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（Clinicial and laboratory standards institute，CLSI）制定的M27-A3方案及相關(guān)文獻進行氧化白藜蘆醇聯(lián)合抗真菌藥物對隱球菌的體外藥敏實驗，測定氧化白藜蘆醇聯(lián)合抗真菌藥物是否有增效作用?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株 本實驗共有40 株菌株，其中白色念珠菌6 株，熱帶念珠菌3 株，克柔念珠菌1 株，耳念珠菌2 株，格特隱球菌21 株，新生隱球菌7 株，菌株均為上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點實驗室菌種庫內(nèi)保存，所有菌株均經(jīng)分子鑒定確定菌種。近平滑念珠菌ATCC 22019 作為藥敏試驗的質(zhì)控菌株。

1.1.2 實驗藥物及試劑 氧化白藜蘆醇，純度≥98%；伊曲康唑、5-氟胞嘧啶（5-FC）及米卡芬凈均購自美國Sigma Aldrich 公司。沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）培養(yǎng)基，購自科馬嘉公司；Roswell Park Memorial Institute（RPMI）-1640 液體培養(yǎng)基（pH 值7.0），購自美國Gibro 公司。100%分析純度二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma Aldrich 公司；蒸餾水由凈水機生產(chǎn)，購自日本可菱水（CLEANSUI）公司。

1.2 實驗方法 根據(jù)CLSI 提出的M27-A3[11]方案進行，其中包括體外單藥藥敏實驗以及應(yīng)用棋盤式微量稀釋法進行體外聯(lián)合藥敏實驗。所有菌株均接種至SDA 培養(yǎng)基上，35 ℃恒溫箱，念珠菌培養(yǎng)24 h，隱球菌培養(yǎng)72 h，用于制備菌懸液。

1.2.1 單獨藥敏實驗 取無菌96 孔板，用移液器分別取抗真菌藥物倍比稀釋液100 μL，依次加入96 孔板每行（第1～10 列）孔中，再分別加入終濃度菌懸液100 μL。第11 列加入100 μL 菌懸液及100 μL液體培養(yǎng)基為陽性對照，第12 列加入200 μL 的RPMI-1640 液體培養(yǎng)基為陰性對照。將其置于35 ℃恒溫培養(yǎng)，念珠菌培養(yǎng)24～48 h，隱球菌培養(yǎng)72 h，之后采用最低抑菌濃度（MIC）判定結(jié)果。

1.2.2 聯(lián)合藥敏實驗 采用棋盤微量稀釋法并用微量移液器將藥物加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。其中第1～8 行的第1 列（孔）至第10 列（孔），從高濃度至低濃度依次加入氧化白藜蘆醇倍比稀釋藥液各50 μL 和倍比稀釋抗真菌藥物各50 μL，再加入終濃度的菌懸液100 μL；第11 列加入RPMI-1640 液體培養(yǎng)基100 μL 及終濃度的菌懸液100 μL；第12 列加入200 μL 培養(yǎng)基。35 ℃恒溫培養(yǎng)，念珠菌培養(yǎng)24～48 h，隱球菌培養(yǎng)72 h，后采用分級抑制濃度指數(shù)（FICI）評定2 種藥物聯(lián)合的效果。

1.2.3 結(jié)果判定 單藥藥敏實驗中，藥物MIC 值讀取方法與標(biāo)準(zhǔn)：在放大鏡下視覺讀取，與陽性對照孔比較，酵母類真菌生長≤50%的最低藥物濃度；聯(lián)合藥敏實驗中，MIC 值讀取方法與標(biāo)準(zhǔn)：在放大鏡下視覺讀取，與陽性對照孔比較，酵母類真菌生長≤50%的最低藥物濃度。FICI 計算以及效能評價標(biāo)準(zhǔn)：FICI＝（聯(lián)合作用時A 藥的MIC/單藥時A 藥的MIC）+（聯(lián)合作用時B 藥的MIC/單藥時B 藥的MIC）。當(dāng)FICI≤0.5 時判定為2 種藥物存在協(xié)同作用；0.5＜FICI≤4.0 時判定為無互作用；當(dāng)FICI＞4.0時判定為有拮抗作用。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，2 個獨立樣本比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單獨應(yīng)用氧化白藜蘆醇與抗真菌藥物MIC 范圍 氧化白藜蘆醇的MIC 為250～1 000 mg/L，其中MIC 為250 mg/L 的菌株數(shù)10 株，500 mg/L 的菌株數(shù)23 株，1 000 mg/L 的菌株數(shù)7 株。氧化白藜蘆醇的MIC 顯著高于其他抗真菌藥物（P<0.01）。

伊曲康唑的MIC 為0.031～0.250 mg/L，其中MIC 為0.031 mg/L 的菌株數(shù)7 株，0.063 mg/L 的菌株數(shù)8 株，0.125 mg/L 的菌株數(shù)8 株，0.250 mg/L 的菌株數(shù)17 株。伊曲康唑的MIC 顯著低于米卡芬凈、5-FC（P<0.01）。

米卡芬凈的MIC 為0.250～1.000 mg/L，其中MIC 為0.250 mg/L 的菌株數(shù)5 株，0.500 mg/L 的菌株數(shù)20 株，1.000 mg/L 的菌株數(shù)15 株。米卡芬凈與5-FC 的MIC 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

5-FC 的MIC 為0.125～1.000 mg/L，其中MIC為0.125 mg/L 的菌株數(shù)6 株，0.250 mg/L 的菌株數(shù)19 株，0.500 mg/L 的菌株數(shù)9 株，1.000 mg/L 的菌株數(shù)6 株。見表1。

表1 單獨應(yīng)用氧化白藜蘆醇與抗真菌藥物的MIC 比較

2.2 氧化白藜蘆醇聯(lián)合3 種抗真菌藥物的MIC比較 氧化白藜蘆醇聯(lián)合伊曲康唑后各自的MIC分別為15.0～250.0 mg/L 和0.015～0.125 mg/L，聯(lián)合使用后氧化白藜蘆醇的MIC 平均下降率為77.78%，伊曲康唑的MIC 平均下降率為62.16%。

氧化白藜蘆醇聯(lián)合米卡芬凈后各自的MIC 分別為15.0～125.0 mg/L 和0.063～0.25 mg/L；聯(lián)合使用后氧化白藜蘆醇平均MIC 下降率為86.77%，米卡芬凈平均MIC 平均下降率為77.03%。

氧化白藜蘆醇聯(lián)合5-FC 后各自的MIC 分別為62.5～500.0 mg/L 和0.125～0.5 mg/L；聯(lián)合使用后氧化白藜蘆醇的MIC 平均下降率為51.88%，5-FC的MIC 平均下降率為1.25%。見表2。

表2 氧化白藜蘆醇聯(lián)合3 種抗真菌藥物的MIC 比較（mg/L）

2.3 3 種抗真菌藥物分別聯(lián)合氧化白藜蘆醇的FICI 比較 氧化白藜蘆醇分別與伊曲康唑、米卡芬凈、5-FC 交叉聯(lián)合后，氧化白藜蘆醇與米卡芬凈聯(lián)合時FICI≤0.5 所占比例最大，二者聯(lián)合協(xié)同作用最好，與伊曲康唑的協(xié)同作用次之，且與米卡芬凈聯(lián)合的FICI 顯著高于伊曲康唑（P<0.01）；5-FC 與氧化白藜蘆醇無相互作用。見表3。

表3 3 種抗真菌藥物分別聯(lián)合氧化白藜蘆醇的FICI 比較 例（%）

3 討論

過去30 年中，由于人類免疫缺陷疾病的流行，人口老齡化、免疫功能低下以及留置醫(yī)療設(shè)備的廣泛使用，由念珠菌引起的感染發(fā)生率明顯增加[12]；此外，惡性腫瘤、放療化療、廣譜抗菌藥物的濫用，免疫抑制劑的長期應(yīng)用，使得隱球菌感染的發(fā)病率及病死率增高[13]。我國人口多數(shù)生活在亞熱帶及溫帶地區(qū)，其溫度有利于隱球菌的生長，因此研發(fā)新型抗真菌藥物來協(xié)同抗菌是有效治療真菌感染的措施。

氧化白藜蘆醇是從桑枝、菝葜等許多傳統(tǒng)中藥中提取，安全性高，毒性小，常用作抗腫瘤治療。有少量研究表明，氧化白藜蘆醇本身有一定的抗癬菌及抗白色念珠菌作用，并與硝酸咪康唑聯(lián)合抗紅毛癬菌能夠發(fā)揮協(xié)同作用，表現(xiàn)出顯著的2 組MIC 值降低[14]。本研究表明，氧化白藜蘆醇有一定的抗隱球菌作用，然而其單藥MIC50 相對較高，同時與米卡芬凈及伊曲康唑聯(lián)合使用能夠發(fā)揮協(xié)同作用，使米卡芬凈及伊曲康唑的MIC 顯著降低，提高了米卡芬凈及伊曲康唑?qū)﹄[球菌的敏感性。

有研究表明，氧化白藜蘆醇可直接與DNA 結(jié)合，造成DNA 裂解，導(dǎo)致G2/M 期阻滯；氧化白藜蘆醇引起細(xì)胞凋亡特征在于使磷脂酰絲氨酸暴露、凋亡數(shù)量減少以及元蛋白酶活化；氧化白藜蘆醇誘導(dǎo)Ca2+超載導(dǎo)致線粒體膜去極化，使細(xì)胞色素C 從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中；總之，氧化白藜蘆醇與DNA結(jié)合親和力誘導(dǎo)DNA 裂解，最終導(dǎo)致念珠菌線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15]。當(dāng)然還需要進一步的研究來精確探討氧化白藜蘆醇抗真菌的機制。

綜上所述，氧化白藜蘆醇作為一種酚類化合物，對隱球菌有一定的抗真菌作用，與米卡芬凈聯(lián)合時能夠發(fā)揮較強協(xié)同作用，從而降低藥物濃度。氧化白藜蘆醇來源于自然植物，有易獲取、低毒、不良反應(yīng)發(fā)生率低等優(yōu)點，推測氧化白藜蘆醇有一定的治療隱球菌的應(yīng)用前景。