周文文，魏麗萍，王皓敏，王良民，張士發(fā)

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧沈陽 110016；2.大連醫(yī)科大學(xué)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧沈陽 110016；3.東北國際醫(yī)院，遼寧沈陽 110623）

Paget ?。≒aget's disease，PD）是一種少見的低度惡性的皮膚腫瘤，根據(jù)其發(fā)病部位分為乳房Paget 病（Mammary Paget's disease，MPD）和乳房外Paget ?。‥xtramammary Paget's disease，EMPD）。Toll樣受體（TLR）屬于模式識(shí)別受體，TLR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括髓樣分化因子88（Myeloid differentiation factor 88，MyD88）和β-干擾素TIR 結(jié)構(gòu)域銜接因子（TIR domain-containing adaptor molecule inducing IFN-β，TRIF）依賴的信號(hào)通路。許多研究表明，TLR參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究通路觀察TLR 中的2 個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路因子MyD88 和TRIF 在MPD 和EMPD 腫瘤組織中表達(dá)水平的變化，探討其在MPD和EMPD 發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 采集20 例MPD 和20 例EMPD 患者皮損組織石蠟標(biāo)本并經(jīng)臨床及組織病理學(xué)確診。MPD 皮損組織均為女性，年齡31～72 歲，平均（54.30±12.06）歲；EMPD 皮損組織男性17 例，女性3 例；年齡52～84 歲，平均（71.15±9.72）歲。所有納入標(biāo)本的患者術(shù)前均未進(jìn)行放療和化療，無特殊既往史及過敏史。以10 例手術(shù)患者切除的良性組織病灶外2 cm 并經(jīng)病理學(xué)確認(rèn)為正常皮膚組織作對(duì)照，其中男性6 例，女性4 例；年齡20～68 歲，平均（44.60±16.00）歲。

1.2 主要試劑 兔抗人MyD88 單抗、兔抗人TRIF單抗和免疫組化染色試劑盒均來自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用免疫組化染色法，按免疫組化二步法說明書進(jìn)行操作。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，高壓鍋修復(fù)抗原，分別滴加MyD88、TRIF 稀釋一抗工作液，工作濃度為1∶500，4 ℃冰箱過夜（時(shí)間≥12 h），加二抗工作液37 ℃孵育20 min，3，3-二氨基聯(lián)本胺（DAB）染色液顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷 由2 位高年資皮膚病理科醫(yī)生獨(dú)立對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，在顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)獨(dú)立高倍視野（×400），結(jié)合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行結(jié)果判斷。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0 分（無染色或細(xì)胞染色與背景無異）、1 分（淡黃色-弱染色）、2 分（棕黃色-中度染色）、3 分（棕褐色-強(qiáng)染色）；陽性細(xì)胞百分比：0 分（無）、1 分（1%～25%）、2 分（26%～50%）、3 分（51%～75%）、4 分（76%～100%），以染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比的乘積進(jìn)行結(jié)果判定：0 分為陰性（-），1～3 分為弱陽性（+），4～6 分為陽性（++），≥7 分為強(qiáng)陽性（+++）。其中，將強(qiáng)陽性及陽性定義為高表達(dá)，弱陽性定義為低表達(dá)[1]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，Pearson 相關(guān)性分析法分析MyD88 與TRIF 的相關(guān)性。以α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MyD88 的表達(dá) 在MPD 皮損組織中MyD88的陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀；在EMPD 皮損組織中MyD88 的陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上，亦呈棕黃色或棕褐色顆粒狀；在正常組織中MyD88 呈弱陽性表達(dá)，主要見于角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)上，呈淡黃色顆粒狀分布，如圖1。MyD88 在MPD 和EMPD 的表達(dá)均顯著高于正常組織（均P<0.05），但在MPD 與EMPD 間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 MyD88 及TRIF 在MPD、EMPD 和正常組織中的表達(dá)水平比較（±s）

表1 MyD88 及TRIF 在MPD、EMPD 和正常組織中的表達(dá)水平比較（±s）

注：與MPD 比較，aP<0.05；與EMPD 比較，bP<0.05。

樣本位置n MPD20 EMPD20正常組織10 TRIF 表達(dá)強(qiáng)度4.50±2.33 4.60±2.56a 1.67±2.17ab MyD88 表達(dá)強(qiáng)度5.32±3.25 4.96±3.21a 2.40±2.07ab

圖1 MyD88 在MPD、EMPD 和正常組織中的表達(dá)

2.2 TRIF 的表達(dá) 在MPD 皮損組織中TRIF 的陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀；在EMPD 皮損組織中TRIF 的陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上，也呈棕黃色或棕褐色顆粒狀；在正常組織中TRIF 呈弱陽性表達(dá)，主要位于角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)上，呈淡黃色顆粒狀，見圖2。TRIF 在MPD 和EMPD 的表達(dá)均顯著高于正常組織（均P<0.05），但在MPD 與EMPD 間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

圖2 TRIF 在MPD、EMPD 和正常組織中的表達(dá)

2.3 MyD88 與TRIF 的相關(guān)性分析 通過Pearson相關(guān)性分析二者的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在MPD 和EMPD 皮損組織中，MyD88 和TRIF 的表達(dá)均無線性相關(guān)性（r 分別為-0.114 和0.185，P 分別為0.632 和0.436）。

3 討論

MPD 絕大多數(shù)累及女性，好發(fā)于單側(cè)乳房、乳暈及其周圍，平均發(fā)病年齡55 歲，男性罕見；EMPD大多好發(fā)于男性，皮損好發(fā)于頂泌汗腺分布部位，如陰囊、會(huì)陰、肛周和腋窩等，平均發(fā)病年齡大于MPD。有關(guān)PD 的病因和發(fā)病機(jī)制較多，但目前尚不完全明確。

MyD88 是一種銜接蛋白，屬于Toll/白細(xì)胞介素-1受體（IL-1R）家族和死亡結(jié)構(gòu)域家族成員，在多種腫瘤組織中高表達(dá)，但未見其與MPD 和EMPD 的相關(guān)研究。有研究表明，在乳腺癌中TLR4 和MyD88的基因和蛋白均高表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤大小、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)性，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用[2]。也有研究表明，通過沉默人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480 和HCT116 細(xì)胞中的MyD88，可以抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌遷移、侵襲和增殖，恢復(fù)MyD88 后，LPS 可通過核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）/絲裂素活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和增殖活力[3]。MyD88 在卵巢癌組織中表達(dá)也明顯升高，且與患者的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[4]。本研究表明，MyD88 在MPD 和EMPD 皮損組織中的表達(dá)均顯著升高，提示MyD88 可能通過與乳腺癌、結(jié)直腸癌和卵巢癌類似的機(jī)制參與了MPD 和EMPD疾病進(jìn)展過程，因?yàn)門LR/MyD88 信號(hào)通路異常激活會(huì)產(chǎn)生一系列炎性因子和細(xì)胞因子（包括免疫抑制性細(xì)胞因子），會(huì)引起免疫抑制和免疫逃逸，最終導(dǎo)致腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。

由TRIF 介導(dǎo)的信號(hào)通路被稱為MyD88 非依賴信號(hào)通路，TRIF 只能通過TLR3 和TLR4 通路發(fā)揮作用。其中TLR3 可以直接綁定TRIF，從而激活下游信號(hào)通路。TLR3 可以促進(jìn)頭頸部腫瘤的發(fā)展，并且可以被順鉑激活，保護(hù)順鉑誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞脫氧核糖核酸（DNA）損傷反應(yīng)，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥，進(jìn)一步證實(shí)了TLR3 在頭頸部腫瘤的發(fā)生發(fā)展及藥物治療中的作用[6]。而TLR4 需要間接通過TRIF 相關(guān)的接頭分子（TRAM）與TRIF 綁定，才能激活下游一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)。TLR4 在乳腺癌中顯著上調(diào)與晚期肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期相關(guān)，其可以通過上調(diào)NF-κB 調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并抑制乳腺癌細(xì)胞的凋亡[7]。目前國內(nèi)外關(guān)于TRIF 與腫瘤之間關(guān)系研究較少。有研究顯示，乳腺癌組織中TRIF 基因和蛋白表達(dá)水平均顯著升高，而且在乳腺癌不同階段的表達(dá)出現(xiàn)差異化，認(rèn)為TRIF 的表達(dá)與乳腺腫瘤的增殖和分化密切相關(guān)[8]，其作用機(jī)制也應(yīng)該是通過TLR3 和TLR4 介導(dǎo)而實(shí)現(xiàn)[6-7]。本研究表明，TRIF 在MPD 和EMPD 腫瘤組織中的表達(dá)均顯著升高，提示TRIF 的異常激活可能通過TLR3 和TLR4 通路造成了Ⅰ型干擾素的過多表達(dá)和NF-κB 的過度活化，傳遞出腫瘤生長信號(hào)，引起了腫瘤細(xì)胞的生長和抗凋亡蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展進(jìn)程[9]。

本研究表明，在MPD 皮損組織中MyD88 和TRIF 陽性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，說明二者能在MPD 細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜上與不同的TLR（包括內(nèi)涵體內(nèi)和細(xì)胞膜上）結(jié)合，激活下游通路，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展；在EMPD 皮損組織中MyD88和TRIF 陽性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上，說明二者可分布于EMPD 細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上，活化相關(guān)因子，從而發(fā)揮相應(yīng)的促癌作用。MyD88 在MPD 和EMPD 細(xì)胞中陽性表達(dá)的部位的研究，國內(nèi)外尚未見報(bào)告，TRIF 也是如此，因此關(guān)于二者在Paget 細(xì)胞中的表達(dá)部位情況還有待進(jìn)一步研究和探索。

本研究還表明，MyD88 在MPD 與EMPD 皮損組織中的表達(dá)強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MyD88在MPD 和EMPD 的病理過程中可能通過相同的信號(hào)通路發(fā)揮促癌作用。TRIF 與MyD88 類似，在MPD 和EMPD 皮損組織中的表達(dá)強(qiáng)度差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TRIF 在MPD 和EMPD 中皮損組織也均發(fā)揮促癌作用，而與PD 的發(fā)病部位無關(guān)。關(guān)于MyD88 與TRIF 在MPD 和EMPD 發(fā)生發(fā)展中的詳細(xì)作用機(jī)制，還有待進(jìn)一步探討。

有關(guān)MyD88 和TRIF 在惡性腫瘤中表達(dá)相關(guān)性的研究，國內(nèi)外鮮有報(bào)告。本研究表明，在MPD和EMPD 皮損組織中，MyD88 和TRIF 的表達(dá)均無相關(guān)性。在TLR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，MyD88 可以被除TLR3 以外所有的TLR 所介導(dǎo)（包括TLR4），而TRIF 只能被TLR3 和TLR4 所介導(dǎo)，TLR4 是唯一可以同時(shí)激活MyD88 和TRIF 2 條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的TLR，2 條信號(hào)通路可共同激活下游腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）分子，引起NF-κB 的活化和釋放，導(dǎo)致大量炎性因子和細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)程[5]，表明MyD88 和TRIF 可以通過TLR4 信號(hào)通路相互聯(lián)系，由此推測二者可能有一定的相關(guān)性。但是MyD88 還可以由其他TLR（除TLR3 和TLR4）介導(dǎo)而激活下游通路發(fā)揮作用，而TRIF 可以由TLR3 介導(dǎo)而激活下游通路發(fā)揮作用，此時(shí)MyD88 和TRIF 可以沒有相關(guān)性。因此MyD88和TRIF 的表達(dá)強(qiáng)度可以不呈線性相關(guān)關(guān)系，其詳細(xì)作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。