吳園園 徐紅仙 黎曉梅 彭蘇玉 王佳茂 蔣福升 葉建晨

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種常見(jiàn)的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，以疼痛、腫脹、活動(dòng)障礙為主要癥狀［1］。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，但基本認(rèn)同炎癥反應(yīng)在疾病初始階段扮演重要作用。中藥白及具有收斂止血、消腫生肌等功效，對(duì)諸多內(nèi)外損傷均具有促修復(fù)作用［6-7］。前期研究發(fā)現(xiàn)，白及醇提物可顯著抑制白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子（TNF-α）等炎癥因子表達(dá)，發(fā)揮對(duì)SiO2誘導(dǎo)的肺纖維化抑制作用［2］；PM2.5［3］和脂多糖（LPS）［4］誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型進(jìn)一步確證了其對(duì)白介素-6（IL-6）、IL-1β和TNF-α等炎癥因子的顯著抑制活性；其中貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、3’-O-甲基山藥素Ⅲ和3-羥基-5-甲氧基聯(lián)芐等成分是白及發(fā)揮抗炎活性的重要功效物種［5-6］，且白及中含量較高［7］。通過(guò)進(jìn)一步系統(tǒng)研究，制備了一個(gè)富含上述成分的白及藥效部位（EFBS），其對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型和小鼠急性肺損傷模型表現(xiàn)出顯著的抗炎活性和肺損傷保護(hù)作用［8］。而IL-1β是與OA密切相關(guān)的炎癥因子，其可刺激軟骨細(xì)胞分泌IL-6、MMP13等因子，促進(jìn)蛋白聚糖和II型膠原降解，引發(fā)關(guān)節(jié)炎［9］。因此，本文采用UPLC-QTOFMS對(duì)EFBS作進(jìn)一步成分解析，并通過(guò)制備IL-1β誘導(dǎo)的軟骨組織和ATDC5細(xì)胞炎癥模型探討EFBS是否對(duì)骨關(guān)節(jié)炎具有潛在治療作用及其可能分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和動(dòng)物 小鼠成軟骨細(xì)胞（ADTC5），上海澤葉生物科技有限公司；雄性ICR小鼠（20±2）g，上海BK公司。

1.2 儀器及試劑 生物組織石蠟包埋機(jī)、熒光定量PCR儀和CO2生物培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司）；多功能酶標(biāo)儀（Perkin Elmer公司）；ACQUITY超高效液相色譜和SYNAPT G2-Si Q-TOF 質(zhì)譜儀（Waters公司）；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（Lecia公司）；白及采自湖北梅川鎮(zhèn)，經(jīng)張春椿副教授鑒定為蘭科植物白及Bletilla striata （Thunb.）Rei chb.f.的假鱗莖；BD-CBA小鼠炎癥因子檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司）；ITS誘導(dǎo)劑（Sigma公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司）；引物（COL2A1、MMP13、GAPDH）由上海生工合成；色譜純乙腈和甲酸（默克公司）；其它試劑均為分析純。

1.3 方法 （1）EFBS制備和化學(xué)成分表征：按照實(shí)驗(yàn)室先前建立的方法，制備EFBS［8］。精密稱取EFBS并溶解稀釋成1.0 mg/mL，過(guò)0.22 μm濾膜，進(jìn)樣作UPLC-QTOF-MS分析。色譜條件為：Waters ACQUITY UPLC Cortecs T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm，Waters），保護(hù)柱為Cortecs T3 Van Guard（2.1×50 mm，1.7 μm，Waters）；流動(dòng)相為A（乙腈）和B（0.1%甲酸溶液）梯度洗脫，即0～36 min，20%～100% A；流速0.30 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為2 μL。質(zhì)譜檢測(cè)條件：SYNAPTG2-SiQ-TOF質(zhì)譜儀，電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式；脫溶劑氣流量為1,000 L/h，脫溶劑氣溫度為500 ℃；離子源溫度120 ℃；錐孔電壓：20.0 V；毛細(xì)管電壓：3.0 kV（+）；采用Waters公司Lockspray校正系統(tǒng)，亮氨酸-腦啡肽（［M+H］+=556.2771，2 ng/mL）為標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行在線實(shí)時(shí)質(zhì)量校正；質(zhì)量掃描范圍（m/z）：50～1500 Da，掃描時(shí)間0.2 s；采用MassLynxV 4.1工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)采集處理。（2）EFBS對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)軟骨炎癥因子和膠原降解抑制作用：①IL-1β誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)軟骨炎癥模型建立：ICR小鼠頸椎脫臼處死，70%乙醇消毒，解剖取股骨頭軟骨；用含雙抗的PBS潤(rùn)洗3次，無(wú)菌PBS潤(rùn)洗后，轉(zhuǎn)入96孔板（1個(gè)/孔），加入200 μL DMEM預(yù)培養(yǎng)2 d；更換培養(yǎng)液后加入不同濃度IL-1β刺激4 d（每個(gè)處理6個(gè)軟骨），取上清CBA法測(cè)定細(xì)胞因子水平。軟骨10%中性福爾馬林固定48 h，10% EDTA脫鈣軟化，流水沖洗，常規(guī)石蠟包埋切片，番紅-固綠染色觀察軟骨膠原降解情況，確定IL-1β處理濃度。②EFBS藥效評(píng)價(jià)：按上述方法進(jìn)行軟骨培養(yǎng)，不同濃度EFBS預(yù)培養(yǎng)2 h，加入IL-1β刺激培養(yǎng)4 d，取上清CBA法測(cè)定炎癥因子水平，軟骨固定、脫鈣、切片作番紅-固綠染色，分析EFBS抗炎、抑制膠原降解情況。（3）EFBS對(duì)IL-1β誘導(dǎo)ADTC5細(xì)胞膠原降解抑制作用及分子機(jī)制：①EFBS對(duì)ADTC5細(xì)胞生長(zhǎng)影響：取指數(shù)生長(zhǎng)期ADTC5細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，完全鋪滿瓶底后更換成DF12分化培養(yǎng)基（含1% ITS），每3 d更換1次，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)21 d。胰酶消化后用DF12分化培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，以5×105個(gè)/孔接種96孔板；培養(yǎng)過(guò)夜后加入不同濃度EFBS，培養(yǎng)24 h后采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率。②EFBS對(duì)IL-1β誘導(dǎo)ADTC5細(xì)胞膠原降解抑制作用：取誘導(dǎo)分化培養(yǎng)21 d的ADTC5細(xì)胞，用分化培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，以5×105個(gè)/孔接種12孔板；培養(yǎng)過(guò)夜后加入不同濃度EFBS預(yù)培養(yǎng)2 h，加入終濃度為10 ng/mL的IL-1β刺激培養(yǎng)3 d。去上清液，4%多聚甲醛固定30 min，PBS潤(rùn)洗3次，加1%阿利新藍(lán)染色30 min，PBS潤(rùn)洗3次，拍照分析膠原降解情況［10］。③EFBS對(duì)Ⅱ型膠原蛋白α1（COL2A1）和基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13）基因表達(dá)影響：按照上述方法傳板，藥物預(yù)處理和IL-1β刺激培養(yǎng)3 d；去上清液，預(yù)冷PBS潤(rùn)洗2次，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書操作，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，熒光定量PCR測(cè)定COL2A1和MMP13基因表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件分析處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)量資料以（）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EFBS質(zhì)譜表征 EFBS經(jīng)UPLC分離QTOF-MS檢測(cè)，其基峰離子色譜圖如圖1所示。通過(guò)查閱文獻(xiàn)建立白及化合物庫(kù)，MassLynxV 4.1軟件搜庫(kù)比對(duì)作初步鑒定，并進(jìn)一步通過(guò)分析各峰保留時(shí)間，化合物裂解規(guī)律、標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照及與文獻(xiàn)中相關(guān)數(shù)據(jù)比對(duì)分析，共鑒定了12個(gè)峰物質(zhì)，其中菲類和聯(lián)芐各6個(gè)。

圖1 EFBS正離子模式的基峰離子色譜圖

2.2 EFBS對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨炎癥因子分泌和基質(zhì)降解抑制作用 IL-1β可劑量依賴性促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨釋放IL-6和MCP-1，但20 ng/mL和40 ng/mL無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（圖2 A-B）；切片番紅-固綠染色結(jié)果表明，正常組軟骨基質(zhì)染色均勻呈深紅色，5 ng/mL IL-1β刺激切片外緣染色明顯變淺呈粉紅色，表明膠原基質(zhì)降解明顯；而＞10 ng/mL切片外緣幾乎呈白色，但繼續(xù)增加濃度變化并不明顯（P＞0.05）（圖2 C）；從文獻(xiàn)資料看，大多研究采用10 ng/mL IL-1β刺激［11］，因此，確定該濃度用于后續(xù)研究。與模型組比較，EFBS預(yù)處理可劑量依賴性抑制IL-1β誘導(dǎo)的IL-6和MCP-1升高（P＜0.05），其中40 μg/mL處理組兩個(gè)因子抑制率分別達(dá)88.736%±19.305%和69.189%±26.366%（圖2 D、E）。切片結(jié)果表明，EFBS也可劑量依賴性抑制膠原基質(zhì)降解（圖2 F）。

圖2 軟骨培養(yǎng)上清液中炎癥因子水平及軟骨切片番紅-固綠染色結(jié)果。注：A、B中與對(duì)照組比較，**P＜0.01；D、E中與模型組比較，**P＜0.01

2.3 EFBS對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的ATDC5細(xì)胞膠原蛋白降解抑制作用 CCK-8結(jié)果表明，EFBS在50 μg/mL劑量范圍內(nèi)對(duì)ATDC5細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響（P＞0.05），但60 μg/mL濃度時(shí)相比對(duì)照組存活率顯著下降（P＜0.05）（圖3 A）。10 ng/mL IL-1β處理后，經(jīng)阿利新藍(lán)染色與對(duì)照組相比顯著變淺，而20～40 μg/mL濃度范圍內(nèi)隨EFBS劑量增加染色明顯加深，表明EFBS對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的膠原蛋白降解具有較好的抑制作用（圖3 B）。

圖3 EFBS對(duì)ATDC5細(xì)胞存活率影響及對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的ATDC5細(xì)胞基質(zhì)降解抑制作用。注：A. 細(xì)胞存活率，與對(duì)照組比較，**P＜0.01；B. ATDC5細(xì)胞基質(zhì)阿利新藍(lán)染色

2.4 EFBS對(duì)COL2A1和MMP13基因表達(dá)影響 熒光定量PCR結(jié)果表明IL-1β誘導(dǎo)可顯著下調(diào)COL2A1基因表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)MMP13基因表達(dá)（P＜0.05）；EFBS可劑量依賴性上調(diào)COL2A1基因mRNA水平，尤其40 μg/mL處理組甚至超過(guò)正常對(duì)照組（P＜0.05）（圖4 A）；雖然相比模型組EFBS各劑量組MMP13基因表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），但并不呈劑量關(guān)系，30 μg/mL表達(dá)量最低，而40 μg/mL處理組又有所升高，但與正常組相當(dāng)（圖4B）。

圖4 EFBS對(duì)COL2A1和MMP13基因表達(dá)影響。注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

3 討論

HPLC分析表明貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、3’-O-甲基山藥素Ⅲ和3-羥基-5-甲氧基聯(lián)芐四個(gè)成分含量＞50%［8］，但其余成分尚不清楚；本研究通過(guò)UPLCQTOF-MS進(jìn)一步對(duì)EFBS化合物組成進(jìn)行了表征。結(jié)果共鑒定了12個(gè)峰，菲類和聯(lián)芐類是其主要成分，這為進(jìn)一步制備成分基本清楚、含量相對(duì)穩(wěn)定、療效確切的白及藥物制劑奠定了良好基礎(chǔ)。

OA的發(fā)生、發(fā)展與多種因素有關(guān)，多是由于關(guān)節(jié)局部損傷、炎癥、長(zhǎng)期慢性勞損或軟骨組織新陳代謝失衡造成［12］，但確切機(jī)制不完全清楚。藥物注射誘導(dǎo)、關(guān)節(jié)制動(dòng)或撞擊和手術(shù)方法等建立的各種關(guān)節(jié)炎模型為闡明OA發(fā)病機(jī)制和藥效評(píng)價(jià)奠定了良好基礎(chǔ)［13］。但動(dòng)物模型周期較長(zhǎng)，成本高，也不利于高通量篩選，在這方面體外組織、細(xì)胞模型具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也是對(duì)體內(nèi)模型的重要補(bǔ)充［14］。軟骨組織對(duì)于關(guān)節(jié)功能的發(fā)揮至關(guān)重要，當(dāng)關(guān)節(jié)軟骨損傷后，力的吸收作用降低，關(guān)節(jié)損傷、退變會(huì)進(jìn)行性加重。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一存在的細(xì)胞，其功能失調(diào)與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。大量研究表明，關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)IL-1β水平異常升高，其可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分泌IL-6、MMP13等因子，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解，軟骨細(xì)胞凋亡，最終形成關(guān)節(jié)炎［15］。因此，本研究首先采用IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨炎癥模型，從組織水平探究白及EFBS對(duì)其保護(hù)作用；結(jié)果表明，EFBS可劑量依賴性抑制IL-1β誘導(dǎo)的IL-6和MCP-1炎癥因子分泌和軟骨基質(zhì)降解。進(jìn)一步采用IL-1β誘導(dǎo)的ATDC5軟骨細(xì)胞模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明EFBS在20～40 μg/mL范圍內(nèi)也可劑量依賴性抑制膠原基質(zhì)降解。

IL-1β可通過(guò)誘導(dǎo)MMPs，尤其MMP13促進(jìn)II型膠原蛋白降解，同時(shí)其也可抑制II型膠原蛋白合成進(jìn)一步加劇軟骨基質(zhì)降解［16］；因此，本研究采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)COL2A1和MMP13基因表達(dá)情況進(jìn)行了初步分析。結(jié)果表明，IL-1β刺激顯著上調(diào)MMP13 mRNA水平，并抑制COL2A1基因表達(dá)從而減少膠原沉積，使得阿利新藍(lán)染色變淺；而EFBS處理可劑量依賴性增加COL2A1 mRNA水平，同時(shí)顯著抑制MMP13基因表達(dá)，使得阿利新藍(lán)染色加深?？梢?jiàn)，EFBS可抑制炎癥因子的分泌和MMP13的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)II型膠原蛋白合成等多個(gè)方面抑制軟骨基質(zhì)的降解；結(jié)果表明EFBS在治療OA疾病方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值，值得進(jìn)一步深入系統(tǒng)研究。