李銀鳳，黎華，唐小玉，朱文麗，劉曉柱

（貴州理工學院，貴州 貴陽 550003）

空心李（Prunus salicina Lindl. cv‘Kongxinli’），薔薇科李屬植物，因其果實成熟后果核和果肉分離而得名，主要分布在貴州省東北部、湖北省西南部以及重慶市的東部[1]?？招睦罟麑崰I養(yǎng)豐富，酸甜可口，風味獨特，深受人們的喜愛[2]。特別是貴州沿河的空心李，品質(zhì)更為獨特，已成為國家地理標志產(chǎn)品。但空心李的采收期為炎熱的夏季，其保鮮貯藏手段還不成熟，導致鮮果保質(zhì)期和貨架期較短，易褐化，品相、口感和風味均易受到影響[3]。因此，對采摘后的鮮果進行精深加工，如加工成飲品[4-5]（如發(fā)酵果酒、飲料）、果脯[6]等，是一種有效延長鮮果保存期的手段。但目前空心李果酒釀造所用菌種均為葡萄來源的商業(yè)化釀酒酵母，缺乏優(yōu)質(zhì)的空心李野生酵母菌株。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為果酒發(fā)酵的主要菌種，其乙醇耐受性高，發(fā)酵性能強，可將果汁原料中的糖類代謝成乙醇、二氧化碳以及各種風味物質(zhì)[7-9]。利用釀酒酵母進行果酒的生產(chǎn)，操作簡單、品質(zhì)易于控制[10-11]。但目前商業(yè)化的釀酒酵母，大多分離于葡萄果實，為葡萄酒生產(chǎn)專用菌種，缺乏其它類果酒生產(chǎn)菌株，更未見有針對空心李果酒生產(chǎn)釀酒酵母的相關(guān)報道。

本課題組前期采用純培養(yǎng)法對貴州沿河空心李酵母多樣性進行了鑒定，從空心李果皮上分離鑒定出包括釀酒酵母在內(nèi)的5 大類酵母[12]。在此基礎(chǔ)上，本研究對分離出的2 株釀酒酵母的釀造學特性進行深入分析，以期為空心李果酒的生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母H9、H18：分離于沿河空心李，保存于貴州理工學院非釀酒酵母生理生化研究實驗室；商業(yè)化釀酒酵母ZYMAFLORE X16（X16）、果膠酶：法國LAFFORT 公司；空心李：市售；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉、亞硫酸鉍培養(yǎng)基：貴州博奧瑞杰生物科技有限公司；蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、對硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D glucopyranoside，p-NPG）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計（UH5300）：日本日立公司；pH 計（PHSJ-3F）：上海儀電科學儀器股份有限公司；體視顯微鏡（SZM）：寧波舜禹儀器有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（Biorad T100TM）：美國伯樂公司；離心機（H3-18KR）：湖南可成儀器設(shè)備有限公司；手持式糖度計（PAL-1）：日本愛拓公司；超低溫冰箱（DW-86L388J）：青島海爾特種電器有限公司；恒溫搖床（ZD-85A）：常州朗越儀器制造有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（DHP-420）：天津天泰儀器有限公司；電子舌味覺分析系統(tǒng)（SA402B）：日本INSENT 公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（TQ8040NX）：日本島津公司；頂空固相微萃取系統(tǒng)（TQ8040）：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

將超低溫冰箱保存的釀酒酵母H9、H18 以及X16（對照菌株） 劃線至酵母提取物蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）（酵母浸粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L）固體平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)48 h，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌株生長曲線測定

采用劉曉柱等[13]的光密度法測定菌株的生長曲線。將菌株H9、H18 以及X16 接種至YEPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)40 h，每4 h 進行取樣，于600 nm 波長處測定其光密度值（OD600nm）。測定結(jié)束后，以各時間點為橫坐標，以對應的OD600nm為縱坐標，繪制菌株的生長曲線。

1.3.3 菌株糖代謝性能測定

將菌株H9、H18 以及X16 分別接種至0.6%的酵母浸粉溶液中，并添加2%的不同糖類（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖）。然后在發(fā)酵液中倒置一支杜氏小管。28 ℃發(fā)酵48 h，觀察杜氏小管頂部是否有氣泡產(chǎn)生。有氣泡產(chǎn)生，則表明可代謝該糖，標記為“+”，反之，則標記為“-”。

1.3.4 菌株釀造環(huán)境耐受性分析

將菌株H9、H18 以及X16 分別接種至YEPD 培養(yǎng)基中。YEPD 含有不同濃度的葡萄糖、乙醇、二氧化硫或檸檬酸。各處理組置于搖床上，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)34 h。培養(yǎng)結(jié)束后，測定各處理組的OD600nm。

1.3.5 菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶性能測定

菌株H9、H18 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶性能采用劉曉柱等[14]的p-NPG 法進行測定。酶活力單位（U）定義為pH5.0、50 ℃條件下，1 min 水解p-NPG 產(chǎn)生1 μmol 對硝基苯酚所需酶量。

1.3.6 菌株產(chǎn)硫化氫性能測定

參考Loira 等[15]的方法對菌株H9、H18 產(chǎn)硫化氫性能進行測定。比較菌株H9、H18 在亞硫酸鉍培養(yǎng)基上的顏色深淺從而確定其產(chǎn)硫化氫性能強弱。

1.3.7 菌株發(fā)酵性能測定

1.3.7.1 發(fā)酵空心李果酒的制備

選取成熟、新鮮、無霉爛的空心李，破碎榨汁，加入100 mg/L 偏重亞硫酸鉀和20 mg/L 果膠酶處理12 h，調(diào)整糖度至24 °Brix，并分成2 組。一組為H9 組，接種終濃度為107cfu/mL 的H9 菌株；另一組為H18 組，接種終濃度為107cfu/mL 的H18 菌株。每組平行重復3 次，25 ℃靜置發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，將空心李發(fā)酵液以3 000 r/min 離心20 min，作為空心李果酒的基酒，用于果酒基本理化指標與香氣成分分析。

1.3.7.2 空心李果酒基本理化參數(shù)測定

空心李果酒的乙醇體積分數(shù)、總糖與總酸含量的測定參照劉曉柱等[13]的方法進行測定?？招睦罟频膒H 值采用pH 計進行測定。

1.3.7.3 空心李果酒香氣成分測定

采用頂空固相微萃取系統(tǒng)于40 ℃條件下對空心李果酒香氣成分進行萃取，萃取時間為30 min。以環(huán)己酮為內(nèi)標，采用氣相質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS） 系統(tǒng)測定空心李果酒香氣成分[16]。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標準差表示，采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)單因素方差分析檢驗差異顯著性，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 空心李釀酒酵母的生長特性

菌株H9、H18 的生長曲線如圖1 所示。

圖1 菌株H9、H18 的生長曲線Fig.1 Growth curves of strains H9 and H18

由圖1 可知，在培養(yǎng)期40 h 內(nèi)，包含了適應期、對數(shù)生長期、減速期和穩(wěn)定期4 個階段。前4 h 為適應期，4～12 h 為對數(shù)生長期，16～20 h 為減速期，20 h 以后為穩(wěn)定期。在對數(shù)生長期菌株H18 的生長速率高于商業(yè)化釀酒酵母X16；在減速期，菌株H9、H18 的生長速率較為一致，高于X16；在穩(wěn)定期，菌株H9 和H18 的生長特性與X16 一致。因此，菌株H9 和H18 在對數(shù)生長期的生長特性優(yōu)于X16，在穩(wěn)定期，菌株H9 和H18 生長特性與X16 一致。綜上，菌株H9、H18 生長特性優(yōu)于X16。

2.2 空心李釀酒酵母的糖代謝特性

菌株H9、H18 的糖代謝特性結(jié)果見表1。

表1 菌株H9、H18 糖代謝特性Table 1 Characteristics of sugar metabolism of strains H9 and H18

由表1 可知，2 株空心李釀酒酵母均可代謝所測試的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和半乳糖，與商業(yè)化的釀酒酵母X16 的特性一致。因而，菌株H9、H18 具有較好的糖代謝特性。

2.3 空心李釀酒酵母的釀造環(huán)境耐受性

菌株H9、H18 釀造環(huán)境耐受性結(jié)果見圖2。

圖2 菌株H9、H18 釀造環(huán)境耐受性Fig.2 The brewing environment tolerances of strains H9 and H18

由圖2 可知，菌株H9、H18 在葡萄糖濃度為100～300 g/L、SO2濃度50～300 mg/L 以及檸檬酸濃度15～40 g/L 處理下均可生長，菌體的OD600nm與X16 之間無顯著差別（P＞0.05）。因此，2 株空心李釀酒酵母對葡萄糖、SO2以及檸檬酸具有較好的耐受性。菌株H9、H18在3%～6%乙醇處理下生長較好；在9%乙醇處理下可以生長，但菌體的OD600nm低于3%和6%乙醇處理組；在12%乙醇處理下，菌體幾乎不能生長。因此，H9 和H18 可耐受9%乙醇脅迫環(huán)境。各處理組，H9、H18 和X16 菌體的OD600nm沒有顯著差異（P＞0.05），因此，菌株H9、H18 對釀造環(huán)境的耐受性與商業(yè)化釀酒酵母X16性能一致。

2.4 空心李釀酒酵母的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶特性

β-葡萄糖苷酶是一類可水解含β-葡萄糖苷鍵化合物的酶，有助于游離態(tài)香氣化合物的釋放，可用于食品、化妝品等領(lǐng)域的增香[17-18]。采用p-NPG 法測定的菌株H9、H18 的β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生能力結(jié)果如表2 所示。

表2 菌株H9、H18 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力Table 2 β-glucosidase activities of strains H9 and H18

由表2 可知，菌株H9、H18 的β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量分別為（25.52±0.00）U/L 和（25.18±0.02）U/L，與商業(yè)化釀酒酵母X16 產(chǎn)酶量無顯著差異（P＞0.05）。

2.5 空心李釀酒酵母的產(chǎn)硫化氫特性

硫化氫是一種具有臭雞蛋味道的氣體，會對酒體的風味產(chǎn)生不良影響[19-20]。不同菌株產(chǎn)硫化氫特性的比較如圖3 所示。

圖3 不同菌株產(chǎn)硫化氫特性的比較Fig.3 Analysis of hydrogen sulfide production ability of strains H9 and H18

由圖3 可知，菌株H9、H18 濾紙片顏色為棕黃色，與商業(yè)化釀酒酵母X16 的顏色基本一致。因此，菌株H9、H18 的產(chǎn)硫化氫性能與X16 一致。

2.6 空心李釀酒發(fā)酵性能分析

2.6.1 空心李果酒基酵母本理化參數(shù)

采用H9 和H18 釀造的空心李果酒的基本理化參數(shù)如表3 所示。

表3 空心李果酒的理化指標Table 3 Basic physical and chemical indicators of Prunus salicina Lindl. cv 'Kongxinli' fruit wine

由表3 可知，2 組發(fā)酵空心李果酒的酒精度之間沒有顯著差異（P＞0.05），2 組空心李果酒的總糖含量、總酸含量和pH 值具有顯著差異（P＜0.05）。其中，菌株H18 發(fā)酵空心李果酒的總糖含量和pH 值顯著高于H9 組（P＜0.05），而總酸含量顯著低于H9 組（P＜0.05）。

2.6.2 空心李果酒揮發(fā)性香氣特性

空心李果酒香氣化合物檢測結(jié)果如圖4 所示。

圖4 空心李果酒揮發(fā)性香氣化合物種類與含量Fig.4 Types and amounts of volatile aroma compounds in Prunus salicina Lindl. cv 'Kongxinli' fruit wine

由圖4A 可知，2 組空心李果酒中共檢測出52 種揮發(fā)性香氣化合物，其中醇類物質(zhì)10 種、酯類物質(zhì)22 種、酸類物質(zhì)9 種、醛酮類物質(zhì)4 種、其它類物質(zhì)7 種。H9 和H18 發(fā)酵的空心李果酒中檢測出相同數(shù)量的醇類和酸類化合物；H18 發(fā)酵的空心李果酒含有更多數(shù)量的酯類和醛酮類化合物，但其它類化合物的數(shù)量低于H9 組。

由圖4B 可知，盡管H9 和H18 兩組發(fā)酵空心李果酒中醇類化合物的種類相同，但H18 酵母發(fā)酵的空心李果酒中醇類化合物的含量顯著高于H9 酵母發(fā)酵的空心李果酒（P＜0.05）。此外，H18 組中酯類化合物和其它類化合物的含量顯著低于H9 組（P＜0.05）。

綜上，2 株空心李釀酒酵母對空心李果酒香氣特性的影響不同，H18 菌株可增加發(fā)酵果酒中酯類和醛酮類化合物的種類，提高醇類化合物的含量；而菌株H9 則增加其它類化合物的種類，提高酯類和其它化合物的含量。因而，菌株H9 和H18 可調(diào)節(jié)空心李果酒的香氣特性，發(fā)酵的空心李果酒香氣特性各具特色。

3 結(jié)論與展望

本研究分析了2 株空心李來源的釀酒酵母的釀造學特性。結(jié)果表明，菌株H9 和H18 生長性能整體優(yōu)于商業(yè)化的釀酒酵母X16，對來自于釀造環(huán)境的脅迫因素均具有較好的耐受性，與X16 基本一致。此外，產(chǎn)β-葡萄糖糖苷酶和硫化氫的性能也與X16 之間無明顯差別。因此，2 株空心李釀酒酵母具有較優(yōu)的生理性能。

H9、H18 可較好地發(fā)酵空心李果酒，發(fā)酵酒的酒精度高、總糖含量低。2 株酵母發(fā)酵的空心李果酒香氣特性迥異，H9 菌株具有調(diào)節(jié)揮發(fā)性酯類和其它類化合物的能力，而菌株H18 則具有調(diào)節(jié)揮發(fā)性酯類和醛酮類化合物的特性。因此，2 株空心李釀酒酵母具有釀造空心李果酒的潛能。但本研究僅局限于實驗室規(guī)模的測試，其是否具有較好的工業(yè)應用潛能，還需要進行中試以及工業(yè)化性能的深入分析。