趙洪杰

（山東省肥城市潮泉鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，山東 肥城 271614）

禽大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的禽多病型的總稱，嚴(yán)重者可導(dǎo)致病禽的死亡[1]。其中鵪鶉大腸桿菌病的發(fā)生無明顯的季節(jié)性，各日齡均可感染，飼養(yǎng)條件不良、飼養(yǎng)管理不善和應(yīng)激反應(yīng)等均可導(dǎo)致鵪鶉免疫力的下降，引發(fā)鵪鶉發(fā)病[2]，臨床表現(xiàn)為食欲不振、機(jī)體消瘦、羽毛蓬松、產(chǎn)蛋量下降，主要病理變化為多器官組織的實(shí)質(zhì)性損傷并伴有氣囊炎、心包炎、卵泡液化和卵黃性腹膜炎等癥狀。鵪鶉的大腸桿菌病感染率高，給鵪鶉養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。目前治療該病的主要手段為使用抗菌藥物，但隨著抗生素在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，致病性大腸桿菌對(duì)常用抗生素的耐藥性日益增強(qiáng)，多重耐藥性菌株不斷增多，為該病的防控和治療帶來困難[4]。因此，對(duì)分離菌株進(jìn)行藥物敏感性分析，可為該病的藥物防治提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例來源 山東省一鵪鶉養(yǎng)殖場發(fā)病死亡的42日齡產(chǎn)蛋鵪鶉。

1.1.2 主要儀器與試劑 MALDI-TOF質(zhì)譜儀（德國BRUKER）；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；革蘭染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌藥敏試紙購自杭州濱和微生物有限公司；超凈工作臺(tái)購自蘇州凈化設(shè)備有限公司。

圖1 剖檢病理變化A. 口腔有黏液；B. 氣管環(huán)出血；C. 心包炎；D. 腸黏膜脫落；E. 心包積液；F. 心臟干酪樣壞死。

圖2 細(xì)菌的分離鑒定及鏡檢結(jié)果A. 麥康凱培養(yǎng)基上培養(yǎng)形態(tài)；B. 可疑菌鏡檢圖片（1000 X）。

圖3 疑似菌落的質(zhì)譜測(cè)定

1.2 方法

1.2.1 病理剖檢觀察 對(duì)病死鵪鶉進(jìn)行病理剖檢，觀察各臟器的病理變化。

1.2.2 病原學(xué)檢測(cè) （1）細(xì)菌的分離培養(yǎng)。于超凈臺(tái)內(nèi)無菌采集病死鵪鶉的肝臟，用滅菌接種環(huán)進(jìn)行取樣，分別劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h。（2）革蘭染色。挑取上述（1）步驟中培養(yǎng)基所長菌落進(jìn)行革蘭染色，具體操作步驟參照北京索萊寶科技有限公司革蘭染色試劑盒說明書進(jìn)行，染色后于顯微鏡下觀察細(xì)菌染色情況及形態(tài)特征。

1.2.3 質(zhì)譜測(cè)定 挑取麥康凱培養(yǎng)基上的單菌落，利用MALDI-TOF細(xì)菌質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 將分離到的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，然后稀釋均勻涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基，最后將藥敏試紙有序貼至培養(yǎng)基上，于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h，觀察抑菌效果。

2 結(jié)果

2.1 剖檢結(jié)果

剖檢可見病死鵪鶉機(jī)體干癟呈脫水狀，口腔嗉囊有黏液分泌，氣管環(huán)渾濁出血，腸道壁變薄，腸黏膜脫落，內(nèi)容物呈黃褐色，彌漫性條帶狀出血。卵泡液化變性，卵黃性腹膜炎，肝臟充血壞死，心臟、肝臟有纖維滲出、干酪樣分泌物。具體病變見圖1。

2.2 細(xì)菌的分離鑒定及鏡檢結(jié)果

將病料用接種環(huán)接種于麥康凱培養(yǎng)基上，可見粉紅色的菌落（圖2 A）。革蘭染色后于顯微鏡下觀察，見紅色短小桿狀菌（圖2 B），初步判斷為大腸桿菌。

2.3 細(xì)菌質(zhì)譜檢測(cè)

質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果顯示，麥康凱培養(yǎng)基上的紅色菌落為大腸桿菌。

2.4 藥敏結(jié)果

藥物敏感性試驗(yàn)見圖4，可見1、2、5、6、9、12號(hào)藥物周圍具有抑菌圈，結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表1所示，分離到的大腸桿菌對(duì)阿米卡星敏感，對(duì)慶大霉素、頭孢他啶、氨芐西林、頭孢噻吩、鏈霉素、頭孢噻肟、頭孢唑林、頭孢哌酮、氧氟沙星、卡那霉素和妥布霉素耐藥。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖4 大腸桿菌分離株的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

鵪鶉是家禽中體型較小的品種，在國內(nèi)外家禽養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)重要地位，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]。鵪鶉大腸桿菌病是由埃希氏大腸桿菌引起的鵪鶉常見病，各日齡鵪鶉均易感染發(fā)病，感染鵪鶉常表現(xiàn)為精神萎頓、羽松翅垂、閉眼昏睡、站立不穩(wěn)、食欲不振或廢絕、飲水增加、腹瀉下痢甚至死亡，同時(shí)對(duì)產(chǎn)蛋率及蛋的品質(zhì)影響很大，給鵪鶉養(yǎng)殖帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。大腸桿菌在環(huán)境中常在，且絕大多數(shù)大腸桿菌不會(huì)影響動(dòng)物的健康，但當(dāng)機(jī)體因各種原因出現(xiàn)免疫力下降和應(yīng)激等情況下，大腸桿菌就會(huì)成為影響動(dòng)物健康的“罪魁禍?zhǔn)住?。在?jīng)詢問病史、臨床癥狀觀察及剖檢檢查后，初步確定發(fā)病原因?yàn)榇竽c桿菌感染。因此，采集病死雞肝臟進(jìn)行細(xì)菌的病原學(xué)檢測(cè)，分離物在特定培養(yǎng)基上的菌落特點(diǎn)及革蘭染色結(jié)果符合大腸桿菌的特征。常規(guī)的細(xì)菌鑒定方法可通過生化試驗(yàn)來確證，為實(shí)現(xiàn)疾病的及時(shí)診斷，采用微生物MALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行了細(xì)菌的快速鑒定。微生物MALDI-TOF質(zhì)譜儀檢測(cè)方法具有操作簡單、快速、通量高、靈敏度高、準(zhǔn)確度好的優(yōu)點(diǎn)[6]，在本次診斷中，將質(zhì)譜儀檢測(cè)運(yùn)用到大腸桿菌的鑒定中，快速獲得了陽性結(jié)果，為疾病的控制贏得了時(shí)間。通過剖檢變化、細(xì)菌分離鑒定，特別是質(zhì)譜快速測(cè)定，該鵪鶉場產(chǎn)蛋鵪鶉大量死亡的原因可判定為致病性大腸桿菌的感染導(dǎo)致。建議飼養(yǎng)場加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，保持籠舍干燥通風(fēng)，定期進(jìn)行消毒，同時(shí)減少對(duì)動(dòng)物的應(yīng)激。

目前治療鵪鶉大腸桿菌病的常用方法為使用抗生素，但隨著抗生素在鵪鶉養(yǎng)殖中的廣泛應(yīng)用，大腸桿菌對(duì)常用抗生素的耐藥性日益增強(qiáng)，本試驗(yàn)對(duì)分離到的大腸桿菌做了藥物敏感性測(cè)定。結(jié)果顯示分離株只對(duì)阿米卡星敏感，對(duì)其他11種抗生素均耐藥，因此建議該飼養(yǎng)場可選擇阿米卡星進(jìn)行治療。

4 結(jié)論

本文利用臨床診斷、細(xì)菌分離鑒定，特別是質(zhì)譜快速測(cè)定方法，對(duì)發(fā)病產(chǎn)蛋鵪鶉的病原做了快速檢測(cè)，并分析了大腸桿菌分離菌株的藥物敏感性，為鵪鶉大腸桿菌病的及時(shí)防治提供了借鑒與參考。