孫美莉，王凱峰，陸然，紀曉俊

（南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816）

當前，基于性能卓越的微生物底盤細胞，開發(fā)高效的綠色生物制造技術(shù)，已經(jīng)成為合成生物學領(lǐng)域的研究熱點［1?2］。作為一種非常規(guī)酵母，解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一種重要的產(chǎn)油微生物，自1942年首次發(fā)現(xiàn)至今，在學術(shù)研究和工業(yè)生產(chǎn)中得到了眾多的關(guān)注，是目前研究和應用最為廣泛的微生物底盤細胞之一［3?4］。其先后被命名為Candida lipolytica、Endomycopsis lipolytica、Saccharomycopsis lipolytica，最終定名為Yarrowia lipolytica［5］。解脂耶氏酵母一般分布于富含脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的環(huán)境中，目前已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認證為一般認可安全的微生物（generally recognized as safe，GRAS）［6?7］。解脂耶氏酵母因具有獨特的生理生化特征，展現(xiàn)出了良好的學術(shù)研究與工業(yè)應用價值。第一，解脂耶氏酵母是典型的二型性酵母，因此其成為研究菌體二型性的模式生物；第二，它是一種嚴格的好氧菌，通過呼吸作用促進細胞生長，是一種典型的Crabtree 陰性酵母，具有許多優(yōu)異的工業(yè)應用潛能［5］；第三，其胞內(nèi)具有獨特的檸檬酸穿梭途徑而能夠高效地合成乙酰輔酶A 這一多種化合物生物合成的前體，因此非常適合于脂質(zhì)、萜烯類等化合物的合成［8?12］；第四，其胞內(nèi)具有較高的三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）通量，因此適用于系列有機酸化合物的生物合成［3］；第五，其可以分解油脂及烷烴類化合物，在油脂及石油污染的環(huán)境修復方面具有重要作用［13］。此外，解脂耶氏酵母可以在較低pH 和較高的滲透壓條件下生長，且可利用多種碳源為底物，如糖類、烴類、醇類、脂類、蛋白質(zhì)等［14］。正因為解脂耶氏酵母具有高效的多底物利用能力，且對多種極端環(huán)境具有耐受性，十分契合于生物制造所需的工業(yè)應用屬性條件，其日漸成為面向綠色生物制造的合成生物學領(lǐng)域研究的熱門底盤細胞（圖1）［15］。

圖1 解脂耶氏酵母底盤細胞合成各種化合物的簡化示意圖（不同顏色的圓點代表不同類別的產(chǎn)品）Cit-檸檬酸；iCit-異檸檬酸；α?KG-α?酮戊二酸；Suc-琥珀酸；Mal-蘋果酸；TAG-甘油三酯；MIT-線粒體；ER-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；LB-脂質(zhì)體Fig. 1 Schematic representation for various compounds synthesis in Yarrowia lipolytica chassis cell(The same type of products are labeled with dots using the same color)Cit-citrate; ICit-isocitrate; α?KG-α?ketoglutaric acid; Suc-succinate; Mal-malic acid;TAG-triacylglyceride; MIT-mitochondria; ER-endoplasmic reticulum; LB-lipid body

隨著合成生物學的快速發(fā)展，研究者們對解脂耶氏酵母底盤細胞的探索和認識也在不斷深入，尤其是對其生理生化代謝的研究不斷加深，對該酵母的遺傳改造技術(shù)和方法不斷創(chuàng)新，這促進了對解脂耶氏酵母底盤細胞的改造和升級，進一步拓寬了其應用領(lǐng)域。本文總結(jié)了近年來針對解脂耶氏酵母底盤細胞的工程改造及應用，并討論了解脂耶氏酵母在實際應用中的優(yōu)勢，以及面臨的限制和待解決方案。同時，也介紹了各類合成生物學技術(shù)在解脂耶氏酵母中的最新進展，包括基因編輯、基因的表達調(diào)控、基因組規(guī)模代謝模擬等。最后，對解脂耶氏酵母底盤細胞的應用前景和未來發(fā)展方向進行了展望。

1 遺傳改造技術(shù)及工具開發(fā)

高效的遺傳改造技術(shù)及成熟的遺傳操作工具將極大地方便細胞工廠的開發(fā)。近年來，隨著合成生物學技術(shù)的快速發(fā)展，已積累了很多解脂耶氏酵母可用的基因表達控制元件，包括啟動子、終止子和篩選標記。而將各種合成生物學元件及目標基因或途徑引入底盤菌株是對其進行合成生物學改造的必要步驟，這依賴于適合底盤菌株的基因表達及整合方法。近年來興起的CRISPR/Cas介導的基因編輯技術(shù)已在解脂耶氏酵母中初步成功應用，有力推進了解脂耶氏酵母底盤細胞的開發(fā)和應用。

1.1 基因表達的控制元件

對解脂耶氏酵母底盤細胞的工程改造往往需要構(gòu)建一個或多個基因表達盒，這些表達盒由啟動子、開放閱讀框和終止子組成。開放閱讀框通常包含目的基因，有時還包含一些人為添加的靶向序列，如細胞器定位信號等。代謝通路的創(chuàng)建往往需要多個表達盒進行多輪迭代轉(zhuǎn)化，因此對于表達盒構(gòu)建來說，篩選標記也是很關(guān)鍵的基因元件。

1.1.1 啟動子

啟動子是控制基因表達水平的關(guān)鍵元件，通過合成生物學在解脂耶氏酵母底盤細胞內(nèi)構(gòu)建代謝通路，需要選擇適用于解脂耶氏酵母的功能性啟動子。目前，解脂耶氏酵母中已經(jīng)分離和/或表征了多個啟動子，包括組成型和誘導型啟動子。1987 年，科學家首先從解脂耶氏酵母中分離出蛋白胨誘導型啟動子pXPR2［16］，這也是目前表征比較多的內(nèi)源啟動子。然而，其調(diào)控的復雜性和誘導劑的相對昂貴阻礙了pXPR2 的工業(yè)應用。隨后，科學家分離和表征了驅(qū)動翻譯延伸因子?1α 基因的強組成型啟動子pTEF，其目前仍是解脂耶氏酵母合成生物學研究中比較偏好使用的啟動子之一［17］。

由于解脂耶氏酵母具有積累高水平脂質(zhì)的能力，科學家們圍繞脂質(zhì)合成代謝途徑鑒定出了許多內(nèi)源性啟動子，如可誘導的pPOX2［18］、pG3P、pICL4、pPOT4、pPOX4、pPOX2 和pPOX5［19］。Wong 等［20］表征了12 個內(nèi)源啟動子，包括pTEF和其他11 個與脂肪代謝相關(guān)的啟動子，并比較了啟動子強度：pTEF＞pGAP＞pACL2＞pICL＞pIDH2＞pFAS1＞pDGA1＞pFAS2＞pZWF1＞pPOX4＞pACC＞pIDP2。隨后，利用這些啟動子設(shè)計了一組模塊化克隆載體YaliBricks，以允許在解脂耶氏酵母中快速組裝具有特定遺傳元件（啟動子、內(nèi)含子序列和終止子）的多基因代謝途徑，豐富了解脂耶氏酵母合成生物學工具包。最近，來自美國的一個研究小組從解脂耶氏酵母中鑒定了4個內(nèi)源啟動子，其在該酵母的生長階段轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)積累階段時可下調(diào)基因表達［21］。這些啟動子可進一步用于調(diào)控對細胞生長必要而對脂肪酸合成不利的基因的表達，在不改變發(fā)酵條件或向培養(yǎng)基中額外添加成分的條件下可實現(xiàn)脂質(zhì)合成途徑的動態(tài)調(diào)控，是解脂耶氏酵母合成生物學工具箱的重要補充。此外，近些年，科學家們還表征了解脂耶氏酵母中一些其他功能性啟動子，包括：赤蘚糖醇和赤蘚酮糖誘導啟動子pEYK1［18］，Cu2+誘導型啟動子pMT?1?pMT?6 和Cu2+抑制型啟動子pCTR1、pCTR2［22］，組成型啟動子pFBAin［23］，和氨離子響應啟動子pYAT1［24］。

啟動子的表達模式及強度只能通過報告基因來檢測，最初通過易于檢測和觀察的酶活來比較啟動子強度，如β?半乳糖苷酶（β?galactosidase，LacZ）等，但是酶活檢測需要進行酶促反應，不適合高通量篩選。通過檢測綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達水平量化啟動子強度也是常用的方法，該方法的優(yōu)點是可以直接檢測GFP，而無需進行酶促反應。但是由于酵母細胞的自發(fā)熒光會對該方法產(chǎn)生一定的干擾，因此不是最可靠的表征方法［20］。最近，有報道將基于生物發(fā)光熒光素酶的報告基因引入解脂耶氏酵母中，以表征內(nèi)源性啟動子。此方法靈敏可靠，但是需要制備無細胞提取物，并補充熒光素和ATP作為底物。各種啟動子表征方法見表1。

表1 啟動子強度比較及表征方法Table 1 Comparison of strength and characterization of promoters

1.1.2 終止子

和啟動子一樣，終止子也是重要的基因表達控制元件之一。終止子會影響mRNA 穩(wěn)定性和半衰期，對于轉(zhuǎn)錄完成過程至關(guān)重要［27］。通常認為終止子序列是表達盒中必要但相當中性的元件，除了由于在多個表達盒中重復使用而存在發(fā)生同源重組的潛在風險之外，終止子并沒有引起研究者的太多關(guān)注。XPR2和LIP2基因的終止子序列是解脂耶氏酵母中表達盒構(gòu)建過程最常用的內(nèi)源終止子［5］。來自釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的終止子也已成功用于解脂耶氏酵母，這表明終止子具有跨物種的高度可轉(zhuǎn)移性［28］。有趣的是，一些為釀酒酵母設(shè)計的短的合成終止子在解脂耶氏酵母中亦可功能性表達，且發(fā)現(xiàn)合成的終止子序列驅(qū)動綠色熒光蛋白的表達比使用野生型CYC1終止子獲得的結(jié)果高60%［29］。此外，與天然終止子序列相比，這些合成終止子具有較小的長度（35～70 bp），這極大地方便了載體的設(shè)計和表達盒的構(gòu)建，且降低了多個表達盒之間發(fā)生同源重組的風險。盡管終止子序列在解脂耶氏酵母基因的表達調(diào)控中很重要，然而其作用一直被低估，對其研究的廣度和深度遠不如啟動子。未來，研究終止子在解脂耶氏酵母基因表達調(diào)控中的作用將是一個有前景的領(lǐng)域，特別是設(shè)計并合成短的終止子序列，有望簡化基因表達盒的構(gòu)建難度并有助于提高工程菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.1.3 篩選標記

篩選標記的選擇對于菌株改造和篩選也非常重要。在解脂耶氏酵母中，營養(yǎng)缺陷型和抗生素抗性標記均被采用過，而營養(yǎng)缺陷型標記是其最佳選擇，其中最常用的是Leu2 和Ura3 缺陷篩選標記［30］。營養(yǎng)缺陷型篩選標記中比較特殊的一個是Ura3d4，它是Ura3 缺陷篩選標記的啟動子截短版本，當目標基因存在單個拷貝時無法糾正營養(yǎng)缺陷，只有存在多個拷貝時才能糾正，因此可以用于實現(xiàn)目標基因的多拷貝表達［31］。盡管Leu2 作為篩選標記也被廣泛使用，但最近的研究揭示亮氨酸代謝對解脂耶氏酵母脂質(zhì)合成可能產(chǎn)生影響，引起了人們的擔憂［32?33］。

自20 世紀90 年代以來，Ura3 缺陷篩選標記由于可使用有毒的尿嘧啶前體類似物5?氟乳清酸（5?FOA）將篩選標記釋放來恢復營養(yǎng)缺陷，以允許其在多輪轉(zhuǎn)化中重復使用，而成為解脂耶氏酵母底盤細胞工程改造的最佳選擇［34］。盡管如此，這種被命名為Ura3?blaster 的方法，對于復雜代謝途徑的體內(nèi)組裝和底盤細胞改造仍有較大的限制?；诖耍瑏碜允删wP1 的Cre?loxP 重組系統(tǒng)被成功用于在解脂耶氏酵母中進行基因敲除和篩選標記釋放，即在載體構(gòu)建時，在篩選標記兩側(cè)添加loxP 位點，隨后可通過Cre酶介導的loxP 位點特異性重組實現(xiàn)篩選標記的刪除回收［35］。最近，為了簡化操作，科學家們開發(fā)出了一些新型的解脂耶氏酵母合成生物學工具，其中包含了不同的loxP切除標記，包括EasyClone YALI 工具箱［36］和Golden Gate 工具箱［37］。盡管如此，篩選標記的重復利用依然存在周期長、操作煩瑣等問題，因此，有必要進一步優(yōu)化并探索更為高效的篩選方法，而近年來不斷發(fā)展的CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)有望為此提供新的手段。

1.2 基因表達及整合方法

1.2.1 基于游離質(zhì)粒的基因表達

目前為止，解脂耶氏酵母中仍未識別到天然的游離質(zhì)粒，研究者利用自主復制序列/著絲粒（autonomously replicating sequence/centromeric，ARS/CEN）設(shè)計了可以在解脂耶氏酵母中進行自主復制的游離質(zhì)粒用于基因表達［38］。這種游離質(zhì)粒類似于微型染色體，其拷貝數(shù)較低（1～3 個/細胞），而且在有絲分裂時很容易丟失，遺傳穩(wěn)定性差［39?40］，因此并未得到廣泛應用。最近，游離載體被選擇用于開發(fā)解脂耶氏酵母底盤細胞改造的遺傳工具箱，例如YaliBricks系統(tǒng)［20］。通過對解脂耶氏酵母著絲粒區(qū)域進行一些改造（如與上游啟動子融合），提高了游離質(zhì)粒的拷貝數(shù)和表達水平［41］，這為使用游離載體進行基因表達調(diào)控提供了新的技術(shù)手段。此外，研究者也證實構(gòu)建適用于解脂耶氏酵母的游離質(zhì)粒時，ARS 序列中復制起始位點和CEN 之間的間隔序列對于維持質(zhì)粒穩(wěn)定性有重要作用。以熒光蛋白和β?胡蘿卜素合成途徑進行測試，發(fā)現(xiàn)含有間隔序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄水平比不含間隔序列的要高1.4～2.2倍，質(zhì)粒穩(wěn)定性也有1.7倍的提高［42］。最近，來自山東大學的研究者通過不斷截短47 916 bp 的線粒體DNA，鑒別出516 bp 的線粒體DNA 序列作為人工復制起點，也可以實現(xiàn)游離質(zhì)粒在解脂耶氏酵母中的自主復制［43］。以該516 bp 的線粒體人工復制起點代替ARS/CEN 構(gòu)建的質(zhì)粒，在有選擇壓力和無選擇壓力時，質(zhì)粒丟失率分別為10%和20%，比同等條件下ARS/CEN 質(zhì)粒的45%和近100%的丟失率有更穩(wěn)定的表現(xiàn)。

為了實現(xiàn)多基因在解脂耶氏酵母底盤細胞的穩(wěn)健表達，法國研究者還設(shè)計和構(gòu)建了人工染色體（ylAC），使目標基因和染色體組裝變得簡單和高效。ylAC 由兩個端粒和一個包含著絲粒（CEN3?1）的ARS 組成，確保了細胞分裂過程中的自主復制，且可以在有或沒有選擇性壓力的情況下進行多代穩(wěn)定遺傳。研究者以完整的纖維素二糖和木糖共利用途徑為例，以編碼5?氨基乙酰丙酸合成酶的必需基因HEM1作為篩選標記，發(fā)現(xiàn)ylAC 能夠在多代遺傳中保持穩(wěn)定［44］。該結(jié)果是對現(xiàn)有解脂耶氏酵母合成生物學工具箱的有力補充。

1.2.2 基于同源重組的基因組整合

目前，基于整合型載體的整合仍然是解脂耶氏酵母中基因表達的首選［45?46］。首先，相比較于游離質(zhì)粒，整合型載體非常穩(wěn)定，不易丟失。其次，它們可用于進行迭代整合，組合調(diào)控相關(guān)基因的表達［47］。通過同源重組可以將完整的線性化載體整合到解脂耶氏酵母基因組的特定位置。由于解脂耶氏酵母中非同源末端連接（non?homologous end joining，NHEJ）修復雙鏈斷裂（double strand breaks， DSB）占據(jù)主導地位，因此為了增加同源重組效率，需要抑制基于NHEJ 的DSB 修復方式。解脂耶氏酵母中比較常用的方式是將NHEJ修復機制相關(guān)的蛋白編碼基因KU70進行敲除，結(jié)合增加同源區(qū)域的長度（每側(cè)0.5～1 kb），以提高同源修復的頻率［30，35，48］。最近，本課題組將釀酒酵母中負責同源重組的關(guān)鍵基因元件RAD52導入解脂耶氏酵母中，將缺失可導致褐色菌落表型的基因ADE2作為報告基因，以評估同源重組效率。結(jié)果表明，同源臂長為1000 bp 時同源重組效率高達95%，是野生型菌株的6.5 倍，敲除KU70菌株的1.6 倍［49］。目前，解脂耶氏酵母中用于基因表達的質(zhì)粒主要是以整合質(zhì)粒為主，中國臺灣Yeastern 公司針對解脂耶氏酵母中蛋白的表達，開發(fā)了兩種商用的整合型載體：胞內(nèi)表達載體pYLEX1和分泌表達載體pYLSC1［50］。

基因組整合也會發(fā)生在重復的基因組序列中，例如rDNA 區(qū)域和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ylt1的長末端重復序列（或稱為Zeta區(qū)域）［46］。在解脂耶氏酵母基因組中，存在大約200 個rDNA 序列，它們位于每條染色體上并已用于多基因整合。當Zeta 序列作為同源區(qū)域進行整合時，整合主要發(fā)生在含有Zeta菌株中的Zeta 基因座處，而在不含Zeta 菌株中插入則是隨機的［51］。因此利用某些解脂耶氏酵母菌株中缺失Ylt1 的特點，開發(fā)了一種特殊位點的整合平臺，該平臺利用Zeta 序列，通過同源重組在URA3位點上進行靶向整合［52］。

1.2.3 基于非同源末端連接的基因組整合

由于解脂耶氏酵母中雙鏈斷裂時NHEJ 修復的主導地位，且NHEJ介導的基因組整合有利于片段在解脂耶氏酵母基因組中的隨機插入，因此，目前已有多個研究展示了NHEJ介導的基因組整合在解脂耶氏酵母文庫構(gòu)建方面的潛力，特別是多元模塊文庫的構(gòu)建［53?55］。DNA 片段在不需要同源臂的情況下，可以隨機整合到基因組的任何位點，從而獲得突變庫以篩選更好的表型。NHEJ 介導的基因隨機整合已被用于在解脂耶氏酵母中生產(chǎn)α?法尼烯，經(jīng)過MVA 路徑優(yōu)化和α?法尼烯合成路徑的迭代整合以及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，α?法尼烯的產(chǎn)量達到25.55 g/L［56］。

Li 等［57］開發(fā)了適用于解脂耶氏酵母的模塊化克隆工具包--Golden Gate 模塊化克隆系統(tǒng)（YALIcloneNHEJ），通過NHEJ 技術(shù)組裝多基因路徑。通過優(yōu)化關(guān)鍵因素，包括連接酶的量和反應循環(huán)數(shù)，組裝4 片段、7 片段和10 片段的效率分別達到90%、75%和50%。隨后以（-）?α?紅沒藥醇的生產(chǎn)為例，產(chǎn)量達到4.4 g/L。

綜上，NHEJ 策略除了可以節(jié)省載體構(gòu)建的時間，更重要的是，產(chǎn)生的突變庫能提供無限的可能性以篩選高效的目標，在促進路徑優(yōu)化方面有極大的潛能。

1.3 CRISPR系統(tǒng)的開發(fā)

1.3.1 CRISPR系統(tǒng)介導的基因編輯

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspaced palindromic repeats，CRISPR）是原核生物基因組內(nèi)的一段重復序列，細菌能夠通過CRISPR 系統(tǒng)將病毒入侵的基因從基因組上切除，是細菌抵抗病毒等外源遺傳物質(zhì)入侵的一種獲得性免疫系統(tǒng)［58］。針對各種生物體的CRISPR系統(tǒng)逐漸被開發(fā)出來用于DNA 的切除，這種基因編輯技術(shù)具有精準、高效、廉價、易于使用的特點［59］?；贑RISPR系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)能夠在解脂耶氏酵母中實現(xiàn)高效且快速的無標記基因破壞或整合［圖2（a）～（c）］。CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括Cas9核酸內(nèi)切酶以及由CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracRNA）組成的向?qū)NA（sgRNA）［59?60］。sgRNA 識別出包含特定原間隔序列鄰近基序（PAM）的靶向序列NGG，引導Cas9蛋白靶向目標區(qū)域?qū)е翫NA 雙鍵斷裂。通常Cas9蛋白會融合核定位信號如SV40 等來提高入核效率。在解脂耶氏酵母中KU70基因編碼蛋白在DNA雙鏈斷裂后的NHEJ修復過程中起重要作用，將其破壞可以顯著提高同源重組（HR）的效率。在敲除KU70的解脂耶氏酵母中用自主復制質(zhì)粒表達來自化膿性鏈球菌的CAS9基因和雜合RNA聚合酶Ⅲ啟動子（SCR1'?tRNA）驅(qū)動的sgRNA，能夠有效地實現(xiàn)單基因敲除，其效率高達92%以上［61］。Holkenbrink等［62］將Cas9整合至解脂耶氏酵母基因組，同時利用自主復制的游離質(zhì)粒表達sgRNA，使得單基因敲除的效率達到80%以上，雙基因敲除的效率從6%到66%不等。此外，在sgRNA兩端接連HH/HDV 核酶結(jié)構(gòu)能夠?qū)崿F(xiàn)二型啟動子控制sgRNA 的轉(zhuǎn)錄［63］。利用二型啟動子表達Cas9 和sgRNA 并通過NHEJ修復機制破壞靶向區(qū)域，使得單基因、雙基因和三基因敲除效率分別達到85.6%、36.7%和19.3%［63］。隨后，一種由成對sgRNA指導的雙CRISPR/Cas9 切割技術(shù)被成功用于6 個基因的編輯，單敲除效率在14.3% 至32.6% 之間［64］。CRISPR/Cpf1是另一種準確、有效的多重基因組編輯技術(shù)，不同于Cas9，Cpf1 能夠識別TTTN 的PAM 序列，顯著降低了解脂耶氏酵母高GC含量基因組上誤讀PAM 的機會，從而降低基因編輯時的脫靶率［65］。Yang等［66］在解脂耶氏酵母中采用基于CRISPR/Cpf1的雙基因和三基因編輯效率分別達到了75%和42%。

圖2 CRISPR/Cas介導的基因編輯技術(shù)在解脂耶氏酵母中的應用CRISPRa-CRISPR/Cas介導的基因激活；CRISPRd-CRISPR/Cas介導的基因編輯；CRISPRi-CRISPR/Cas介導的基因干擾；crRNA-CRISPR RNA；DSB-DNA雙鏈斷裂；HR-同源重組；NHEJ-非同源末端連接；PAM-原間隔序列臨近基序；RNA P-RNA聚合酶；sgRNA-向?qū)NA；TF-轉(zhuǎn)錄因子Fig. 2 CRISPR/Cas based genome?editingtechnologies applied in Yarrowia lipolyticaCRISPRa-CRISPR/Cas based gene activation; CRISPRd-CRISPR/Cas based gene editing; CRISPRi-CRISPR/Cas based gene interference;crRNA-CRISPR RNA; DSB-DNA double strand breaks; HR-homologyrecombination; NHEJ-non?homologous endjoining;PAM-protospacer adjacent motif; RNA P-RNA polymerase; sgRNA-single?guide RNA; TF-transcription factor

1.3.2 CRISPR系統(tǒng)介導的基因抑制

建立CRISPR 系統(tǒng)的最初目的是利用核酸內(nèi)切酶結(jié)合DNA 并切割靶向基因序列，隨后的研究表明沒有切割活性的核酸內(nèi)切酶同樣可以靶向目標DNA［67］。以失活的Cas9 蛋白（dCas9）或者Cpf1蛋白（dCpf1）構(gòu)建CRISPR 干擾系統(tǒng)（CRISPRi）靶向不同的區(qū)域能夠不同程度地抑制目標基因的轉(zhuǎn)錄［圖2（a）、（b）、（d）］。當失活的核酸內(nèi)切酶融合轉(zhuǎn)錄阻遏物后可實現(xiàn)更高的抑制效率。解脂耶氏酵母中第一個CRISPRi 系統(tǒng)被應用于抑制NHEJ相關(guān)的9個基因，其中8個基因被有效抑制［68］。隨后采用多重sgRNA 策略以及dCas9 融合Mxi1 抑制因子來抑制KU70和KU80基因，使得HR效率提高接近90%。Zhang 等［69］比較了dCpf1、dCas9 以及融合轉(zhuǎn)錄阻遏物的dCas9?KRAB 和dCpf1?KRAB 的抑制效率，發(fā)現(xiàn)目標位點與抑制效率之間沒有明確的關(guān)系。當使用多重位點同時抑制時，dCpf1 和dCas9 的抑制效率分別達到85%和92%。這表明調(diào)節(jié)抑制位點的位置與同時抑制基因的個數(shù)可靈活調(diào)節(jié)抑制程度從而微調(diào)基因的表達。

1.3.3 CRISPR系統(tǒng)介導的基因激活

除了CRISPR 介導的基因干擾系統(tǒng)外，dCas9蛋白還可與轉(zhuǎn)錄激活劑融合以激活靶基因，稱作CRISPR 激活（CRISPRa） 系統(tǒng)［圖2（a）、（b）、（e）］。最近，有研究采用融合表達dCas9 和外源的轉(zhuǎn)錄激活因子VPR 構(gòu)建了CRISPRa 系統(tǒng)，成功激活了解脂耶氏酵母內(nèi)源的β?葡萄糖苷酶編碼基因BGL1和BGL2，研究發(fā)現(xiàn)靠近核心啟動子區(qū)域的sgRNA 可以顯著提高激活程度，最終選取最優(yōu)的靶向位點使得BGL1與BGL2的表達水平分別提高了112 倍和43 倍，通過這一操作，解脂耶氏酵母能夠消耗原先不能代謝利用的纖維二糖［70］。研究還發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cpf1 系統(tǒng)的sgRNA 可通過調(diào)節(jié)序列長度來控制Cpf1 蛋白的切割活性，而長度為16 nt 的直接重復序列（DR）會抑制Cpf1 的切割活性，但不阻止其與靶DNA 結(jié)合?；诖耍琑amesh 等［71］建立了雙用途CRISPR/Cpf1 系統(tǒng)，可以同時實現(xiàn)基因敲除和基因的抑制或激活。

1.3.4 CRISPR系統(tǒng)介導的堿基編輯

除了CRISPR 介導的基因干擾和激活系統(tǒng)外，將CRISPR/Cas9 系統(tǒng)與活化誘導胞苷脫氨酶（Target?AID）融合可精確靶向基因組位點并進行堿基編輯［72］。胞苷脫氨酶（Cda）是核堿基脫氨酶之一，負責催化單鏈DNA 上胞嘧啶（C）向尿嘧啶（U）的轉(zhuǎn)化。與dCas9 融合的Cda 會對非互補DNA 鏈上的C 殘基進行脫氨，該鏈在形成sgRNA/DNA雜交時未成對并會產(chǎn)生不匹配的U?G堿基對，再通過不匹配修復系統(tǒng)轉(zhuǎn)換為U?A堿基對，最終轉(zhuǎn)換為T?A 堿基對，從而導致C 到T 突變［圖2（a）］。尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑（Ugi）是一種抑制人和細菌堿基切除修復的DNA 模擬蛋白，將其過表達可提高C到T的突變效率。由于解脂耶氏酵母偏向利用NHEJ 機制修復DNA 的雙鍵斷裂，容易在胞苷脫氨酶脫氨基后通過NHEJ堿基切除修復形成插入或缺失突變，因此降低NHEJ效率有利于提高靶向堿基編輯的準確性。在敲除KU70的解脂耶氏酵母菌株中表達融合了Cda 和Ugi 的dCas9 蛋白以及sgRNA，該系統(tǒng)中的dCas9 負責將Cda 招募到靶向DNA，無需任何供體DNA 即可引發(fā)C 到T 的突變［73］。堿基C 到T 突變后可形成TAA 終止子，提前終止基因的轉(zhuǎn)錄。在優(yōu)化堿基編輯器融合蛋白的表達水平后，該Target?AID系統(tǒng)能實現(xiàn)單、雙基因破壞，效率分別為94%和31%。

1.3.5 CRISPR系統(tǒng)介導的全基因組分析

通過使用全基因組規(guī)模的sgRNA 將CRISPR/Cas9 靶向全基因組中大部分靶點可構(gòu)建突變文庫用于高通量分析基因的功能。在一定的篩選條件下，結(jié)合基因組測序可鑒定出感興趣的靶點，用于確定符合篩選條件的基因［圖2（f）］。然而，有效sgRNA 的設(shè)計往往具有挑戰(zhàn)性，需要sgRNA 能夠有效行使功能并覆蓋大部分基因組。Schwartz等［74］開發(fā)了一種方法來量化基因組規(guī)模文庫中每個sgRNA 的切割效率，從而設(shè)計出能夠有效覆蓋解脂耶氏酵母94%基因組的sgRNA文庫。進一步，利用該sgRNA 輔助進行全基因組分析，成功應用于鑒定必需基因以及篩選增加脂質(zhì)積累的靶點。最近，該研究小組采用類似的方法基于該文庫成功地在全基因組中篩選出影響解脂耶氏酵母形成菌絲的基因靶標，成功鑒定出5種具有零菌絲表型的突變體，其中RAS2（YALI1_E35305g）被鑒定出編碼參與饑餓反應和細胞形態(tài)GTP 結(jié)合蛋白的基因，將其敲除不影響番茄紅素合成并能抑制菌絲的形成［75］。Baisya 等［76］開發(fā)了一種基于深度學習的指南設(shè)計算法（DeepGuide），能夠準確預測化膿性鏈球菌Cas9和毛螺旋菌Cpf1的sgRNA 在解脂耶氏酵母中的活性，這將有利于指導構(gòu)建高活性全基因組sgRNA文庫。

2 基因表達的調(diào)控策略

高效、精準、可控的基因表達是實現(xiàn)細胞工廠生產(chǎn)效能最大化的關(guān)鍵步驟，其中平衡底盤細胞中各個代謝途徑，并最大化地導向目標代謝物途徑，從而提高目標產(chǎn)物的合成是合成生物學的重要目標之一。代謝途徑中酶的表達水平可以通過不同方式控制，下面對解脂耶氏酵母底盤細胞中常用的基因表達調(diào)控策略（包括提高基因拷貝數(shù)、提高啟動子強度和密碼子優(yōu)化）和基于生物傳感器的動態(tài)調(diào)控策略展開討論。

2.1 提高基因表達的策略

2.1.1 提高基因拷貝數(shù)

在解脂耶氏酵母中構(gòu)建合成高附加值產(chǎn)品的代謝通路過程中往往需要對關(guān)鍵酶進行過表達，提高基因拷貝數(shù)來提高關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平是一種可行的策略。例如，在解脂耶氏酵母中，當LacZ 表達盒的拷貝數(shù)從5 增加到13 時，多拷貝轉(zhuǎn)化子中β?半乳糖苷酶的活性呈線性增加［77］。同樣，在該酵母中，當兩拷貝表達密碼子優(yōu)化的（-）?α?紅沒藥醇合酶基因MrBBS后，發(fā)現(xiàn)（-）?α?紅沒藥醇的產(chǎn)量比單拷貝MrBBS時產(chǎn)量提高了4倍［7］。為了增加目標基因在解脂耶氏酵母中的拷貝數(shù)，可將多個表達盒連接成一個片段并結(jié)合一個篩選標記通過HR 或NHEJ 的方式整合到基因組的一個位點，亦可將表達盒通過多輪整合的方式結(jié)合不同的篩選標記靶向基因組的不同位點，這種通過多輪整合提高基因拷貝數(shù)的方式需要消耗多個篩選標記，而基于Cre?loxP 系統(tǒng)和Ura3?blaster 的篩選標記回收技術(shù)，可僅用一個篩選標記實現(xiàn)基因的多輪迭代整合［7，78?80］。無論基因是在多個位點整合還是在單個位點整合，它們都需要通過HR 或NHEJ 整合到酵母基因組。目前，已有研究鑒定出一系列對解脂耶氏酵母生長沒有影響且整合效率較高的位點，結(jié)合HR 或者CRISPR 技術(shù)可實現(xiàn)基因的定點整合。而NHEJ整合具有隨機性，不同位點的基因表達水平不同，可通過篩選優(yōu)勢的陽性轉(zhuǎn)化子來進一步促進基因的表達。

上述基于篩選標記的整合方式通常單輪整合只能實現(xiàn)一個拷貝數(shù)的增加，這是因為這些篩選標記僅需要一個拷貝就足以恢復菌株在相應缺陷型培養(yǎng)基中生長。對尿嘧啶缺陷型篩選標記基因Ura3 進行啟動子截短，構(gòu)建新的缺陷型篩選標記（例如啟動子截短的Ura3d4 僅含6bp 的啟動子），使得解脂耶氏酵母中必須整合多個拷貝Ura3d4 才能在尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基中生長。研究還表明，Ura3 的啟動子被截短到不同長度可實現(xiàn)不同拷貝數(shù)水平的多拷貝整合。通過調(diào)節(jié)Ura3 啟動子長度可尋找最佳拷貝數(shù)的多拷貝整合菌株從而優(yōu)化基因的表達水平。高拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中并不穩(wěn)定，如Ura3d4 篩選標記在YPD 培養(yǎng)基中平均拷貝數(shù)穩(wěn)定在大約10 個［31］。Bai 等［54］發(fā)現(xiàn)不同啟動子長度的Ura3 篩選標記可結(jié)合基于NHEJ 的隨機整合而構(gòu)建基因拷貝數(shù)不同的解脂耶氏酵母表達文庫，基于顏色反應或者產(chǎn)物產(chǎn)量可篩選出最優(yōu)的表達菌株，這顯著加快了菌株改造的進程。Zeta是一種存在于轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ylt1中的長末端重復序列（LTR），它在解脂耶氏酵母的某些菌株（例如JMY1212）基因組上具有較高的拷貝數(shù)，表明其作為多整合位點的潛力［81］。但是Zeta位點只存在于少數(shù)被改造過的解脂耶氏酵母菌株中，限制了其在其他株系中的應用。但是，所有的解脂耶氏酵母株系體內(nèi)均存在大約200多拷貝的核糖體26S rDNA 簇，利用其作為同源臂結(jié)合啟動子截短的Ura3d4 篩選標記，可實現(xiàn)目標基因在26S rDNA位點的多拷貝整合［77，82］。

2.1.2 提高啟動子強度

為了提高啟動子的強度和可調(diào)性，許多啟動子工程策略已經(jīng)用于改進內(nèi)源啟動子［15］。解脂耶氏酵母中廣泛使用的雜合啟動子php4d，是由來自pXPR2 的4 個UAS1B 和pLEU2 的核心啟動子融合組成，將其用于異源蛋白的表達具有顯著的優(yōu)越性：不受環(huán)境條件（pH 或碳/氮源）的影響，并且能夠在任何培養(yǎng)基中驅(qū)動基因強表達［45，83?84］。最近，Zhao 等［85］對解脂耶氏酵母的常見啟動子成分（UAS、TATA 盒和核心啟動子）進行了表征，以探索各種元件之間的協(xié)同機制。研究者對這些啟動子元素進行重排，構(gòu)建了不同轉(zhuǎn)錄水平的啟動子庫，隨后以異戊醇的異源合成為例，將啟動子庫用于優(yōu)化路徑表達。與對照菌株相比，用此文庫中最強啟動子pUAS1B8-LEUm 調(diào)控關(guān)鍵基因表達時，異戊醇的產(chǎn)量提高了7.7 倍，而在一個相對弱的啟動子pUAS1B4-EXPm 控制下，異戊醇的產(chǎn)量提高了30.3 倍，這表明蛋白質(zhì)的表達水平并不總是與啟動子的強度呈正相關(guān)。此外該研究也發(fā)現(xiàn)來自釀酒酵母三種不同的UAS 也可用于構(gòu)建適用于解脂耶氏酵母的雜合啟動子，表明啟動子元件具有從釀酒酵母到解脂耶氏酵母的可轉(zhuǎn)移性。

通過內(nèi)含子增強啟動子強度也是提高解脂耶氏酵母中基因表達的一種常用策略。在內(nèi)源啟動子pTEF和pFBA插入相應的內(nèi)含子序列獲得pTEFin和pFBAin，其強度分別提高了17 倍和5 倍［23，26］。類似地，Cui 等［53］在php4d、pEXP1 和pTDH1 啟動子添加相同的內(nèi)含子序列，發(fā)現(xiàn)其強度均有不同程度的提高。盡管添加內(nèi)含子序列是增強啟動子強度的一種簡單的方法，并且這種方法適用于許多真核生物，然而，內(nèi)含子增強的機制仍不清楚。因此，需要挖掘其調(diào)控機制，以更好地設(shè)計具有更高活性的啟動子元件。

2.1.3 密碼子優(yōu)化

與模式微生物的GC 含量相比（如大腸桿菌中GC 含量50%、釀酒酵母中GC 含量為38%），解脂耶氏酵母基因組中的GC 含量比較高（49.6%～51.7%），具有獨特的生理生化特性，與釀酒酵母的氨基酸同源性只有50%～60%［86］。解脂耶氏酵母的RNA 聚合酶Ⅱ啟動子和轉(zhuǎn)錄因子與釀酒酵母有比較大的差異，故解脂耶氏酵母的基因幾乎不能直接在釀酒酵母中表達。在釀酒酵母中，只有5%的基因含有內(nèi)含子，而解脂耶氏酵母中內(nèi)含子的含量達到15%［87?88］。解脂耶氏酵母的密碼子偏好性不同于釀酒酵母而類似于曲霉菌。

對于解脂耶氏酵母底盤細胞的工程改造，經(jīng)常需要表達異源基因，而每個宿主有自己偏好的密碼子，因此需要對密碼子進行優(yōu)化以適應不同的底盤細胞。使用優(yōu)化的密碼子不僅影響異源蛋白質(zhì)的翻譯速率，還有利于蛋白質(zhì)的折疊［89］。密碼子優(yōu)化是提高外源基因在解脂耶氏酵母底盤細胞中表達的一個常用策略。研究者以人干擾素α2b（hIFN 2b）為模型研究低的翻譯表達效率與外源蛋白表達之間的關(guān)系。根據(jù)密碼子在解脂耶氏酵母中的使用頻率合成了密碼子優(yōu)化的hIFN 2b 基因，結(jié)果顯示，與野生型基因相比，密碼子優(yōu)化的基因?qū)fn 蛋白表達提高了11 倍［90］，表明了在解脂耶氏酵母底盤細胞中進行密碼子優(yōu)化以提高基因表達的必要性。來自比利時的研究者通過優(yōu)化密碼子使用和調(diào)整GC含量與解脂耶氏酵母相近（約50.5% GC），有效提高在解脂耶氏酵母中異源表達的α?1，2?甘露糖苷酶的活性，且異源表達沒有抑制細胞的生長，再次確認了優(yōu)化密碼子和GC含量的必要性［91］。

2.2 基因表達的動態(tài)調(diào)控

近年來，基于對解脂耶氏酵母底盤細胞代謝的深入了解以及成熟的合成生物學工具的開發(fā)，人們對其進行了深度改造，最大限度地提高了相關(guān)產(chǎn)物的產(chǎn)量。然而，經(jīng)過工程改造的底盤細胞往往由于代謝失衡而限制了目標產(chǎn)物產(chǎn)量的進一步提高［92］。最近，基于各種轉(zhuǎn)錄因子響應特定的細胞內(nèi)代謝物的動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，特別是基于原核生物轉(zhuǎn)錄因子相對簡單的調(diào)控機制，已廣泛用于構(gòu)建真核生物的生物傳感器以解決這一問題（圖3）［93?94］。

圖3 解脂耶氏酵母中用于基因表達動態(tài)調(diào)控的生物傳感器（a）響應代謝物的生物傳感器調(diào)控原理，包括響應代謝物存在時的啟動表達“ON”模式，以及沒有響應代謝物存在條件下關(guān)閉表達“OFF”模式；（b）基于綠光響應抑制的基因表達動態(tài)調(diào)控原理，包括綠光光照條件下的關(guān)閉表達“OFF”模式，以及黑暗條件下的啟動表達“ON”模式；（c）基于藍光響應激活的基因表達動態(tài)調(diào)控原理。包括藍光光照條件下的啟動表達“ON”模式，以及黑暗條件下的關(guān)閉表達“OFF”模式。DBD-DNA結(jié)合域；LDB-配體結(jié)合域；RNA P-RNA聚合酶Fig. 3 Dynamic regulation of gene circuits through biosensors in Yarrowia lipolytica(a) Mechanism of the metabolites response biosensor,“ON” mode represents turning on the gene expression in the presence of the response metabolites,and “OFF” mode represents turning off the gene expression in theabsence of the response metabolites; (b) Mechanism of the green light response biosensor,“ON” mode represents turning on the gene expression in the dark condition;and “OFF” mode represents turning off the gene expression under the green light; (c) Mechanism of the blue light response biosensor, “ON” mode represents turning on the gene expression under the blue light, and “OFF” mode represents turning off the gene expression inthe dark condition.DBD-DNA binding domain; LDB-ligand binding domain; RNA P-RNA polymerase

2.2.1 脂肪酰輔酶A生物傳感器

脂肪酰輔酶A 是脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵中間體，也是脂肪酸衍生物的直接前體，包括脂肪醇、脂肪酸乙酯、脂肪酸甲酯、烯烴和烷烴等。來自大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄因子FadR 及其操縱子fadO被用于構(gòu)建解脂耶氏酵母中的脂肪酰輔酶A 生物傳感器［95］。該傳感器在結(jié)合到其響應物脂肪酸時，可對其調(diào)控的基因進行激活調(diào)節(jié)［圖3（a）］。研究者將其用于調(diào)控將棕櫚酸轉(zhuǎn)化為ω?羥基棕櫚酸的細胞色素P450酶，以解耦細胞生長和產(chǎn)物合成。FadR由強組成型啟動子控制，不同數(shù)量fadO（0個、1個和3個）插入3 種強組成型啟動子（pGPD、pTEF 和pLEU）中以優(yōu)化脂肪酰輔酶A傳感器。發(fā)現(xiàn)在這些FadR合成啟動子中，pTEFR1（1個fadO插入到pTEF）可以有效地提高ω?羥基棕櫚酸的產(chǎn)量。

2.2.2 柚皮素生物傳感器

柚皮素可以從莽草酸途徑中間體衍生的丙二酰輔酶A和香豆酰輔酶A合成，是合成其他營養(yǎng)補充劑和藥物的黃酮類化合物的關(guān)鍵中間體。來自血清草桿菌的類黃酮感應轉(zhuǎn)錄激活因子FdeR 及其操作子FdeO 已經(jīng)被用于構(gòu)建解脂耶氏酵母中的柚皮素生物傳感器［96］。該傳感器由pTEF 表達的FdeR 和雜合FdeO?TEF 啟動子組成，工作范圍為0～50 mg/L 柚皮素。將柚皮素敏感的生物傳感器用于調(diào)控細胞生長的必需基因亮氨酸合成編碼基因的合成，然后選擇性地富集產(chǎn)生柚皮素的種群，從而使產(chǎn)柚皮素的菌株具有了生長優(yōu)勢。不含傳感器的菌株在經(jīng)過300 代以上的傳代后失去了94.5%的柚皮素產(chǎn)量，而含有傳感器的菌株在經(jīng)過324 代傳代后仍具有90.9%的柚皮素產(chǎn)量，這種將化學成癮與負反饋調(diào)控相結(jié)合來提高代謝穩(wěn)定性和產(chǎn)量的策略對于排除長期和大規(guī)模發(fā)酵過程中的代謝異質(zhì)性具有重要作用。

2.2.3 木糖生物傳感器

木糖是木質(zhì)纖維素中含量最豐富的糖類之一，微生物對木糖的有效利用對于提高生物燃料和生物基化學品的經(jīng)濟性至關(guān)重要［97?98］。許多研究人員試圖工程改造解脂耶氏酵母以利用木糖［99］。Wei等［100］利用來自大腸桿菌的木糖響應轉(zhuǎn)錄因子（XylR）構(gòu)建適用于解脂耶氏酵母的木糖可誘導的生物傳感器（xylbiosensor），它僅在木糖存在的情況下與其同源結(jié)合位點（xylO）結(jié)合。添加木糖后，生物傳感器能夠觸發(fā)其調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄激活。此外，研究者將異源木糖利用基因引入到解脂耶氏酵母中，置于生物傳感器的控制之下，構(gòu)建以木糖為底物的工程菌［100］，發(fā)現(xiàn)含木糖誘導系統(tǒng)的解脂耶氏酵母，基于木糖作為底物和誘導劑的雙功能，被用于合成柚皮素，其產(chǎn)量達到（715.3 ±12.8）mg/L，遠高于組成型啟動子UAS1B8TEF控制下的產(chǎn)量（239.1 ± 5.1）mg/L［101］。

2.2.4 赤蘚糖醇生物傳感器

基因動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)還可以作為一種高通量工具，用于篩選和表征突變文庫中的高產(chǎn)菌株。Qiu等［102］基于流產(chǎn)布魯氏菌（Brucella abortus）的赤蘚糖醇響應轉(zhuǎn)錄因子EryD 建立了赤蘚糖醇傳感器調(diào)節(jié)系統(tǒng)，首先配置了EryD 傳感器?調(diào)節(jié)器的最佳架構(gòu)，其對赤蘚糖醇的響應范圍為5～250 mmol/L。結(jié)合紫外和ARTP誘變及生物傳感器菌株篩選，在一周內(nèi)從包含1152 個解脂耶氏酵母突變庫中篩選出性能最佳的菌株，能產(chǎn)生148 g/L 的赤蘚糖醇。該生物傳感器能夠快速提高菌株性能，并為工業(yè)應用設(shè)計高效的微生物細胞工廠提供很好的參考。

2.2.5 光控生物傳感器

除了利用底物或中間代謝物作為傳感器的響應物質(zhì)，研究者在解脂耶氏酵母中還建立了光控生物傳感器。利用細菌來源的CarH 作為綠光誘導因子，結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子VPRH，構(gòu)建綠光響應元件的光控表達系統(tǒng)［圖3（b）］。該系統(tǒng)可在綠光和黑暗條件下調(diào)控前體及產(chǎn)物合成，研究者將該系統(tǒng)用于動態(tài)調(diào)控對香豆酸和柚皮素的合成，黑暗條件下的對香豆酸產(chǎn)量是綠光誘導下的2.0 倍，柚皮素產(chǎn)量是綠光誘導下的2.6 倍［103］。盡管本研究的產(chǎn)量與其他研究相比尚有一定的差距，但其在解脂耶氏酵母中建立的綠光調(diào)控抑制某一特定基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)具有一定的通用性。最近，華中科技大學的研究者利用來自赤桿菌的光敏反應蛋白EL222 和其響應因子C120，在解脂耶氏酵母中構(gòu)建了藍光誘導系統(tǒng)［圖3（c）］［104］。以GFPMut3 作為報告蛋白，在藍光誘導8 h 后熒光信號比黑暗條件下高128.5 倍。該傳感器進一步被用于調(diào)控抗性基因博來霉素（BleoR）抗性蛋白的表達，結(jié)果表明在黑暗條件下50～250 g/mL 的博來霉素可完全抑制或延緩解脂耶氏酵母的生長，而在恒定的藍光誘導下，BleoR 可誘導抗性基因表達并促進細胞生長。光作為誘導因子具有響應速度快、無損、可逆和獨特的時空特異性等優(yōu)勢，因此具有規(guī)?；瘧玫臐摿?。

3 基因組規(guī)模代謝模擬

基因組規(guī)模代謝模擬（genome?scale metabolic modelling）是通過構(gòu)建基因組規(guī)模代謝模型（GEM）來研究微生物底盤細胞代謝特性的重要手段，是預測代謝通量分布的有力工具，有助于理解復雜的細胞生理代謝，并指導底盤細胞的設(shè)計和生產(chǎn)性能的改善。GEM的構(gòu)建為合成生物學研究提供了必要的工具，可以顯著加快合成生物學研究過程中設(shè)計-構(gòu)建-測試-學習迭代循環(huán)的進程［105］。GEM以及各種基于約束的建模方法為深入理解微生物底盤細胞的代謝過程鋪平了道路［106］。此外，通過與眾多菌株計算優(yōu)化方法（CSOM）相結(jié)合，GEM已經(jīng)成功用于尋找新的基因操作靶標而服務于各種工業(yè)微生物底盤細胞的合成生物學［107］。

為了將該工具應用于解脂耶氏酵母底盤細胞的合成生物學，幾種針對解脂耶氏酵母的GEM 陸續(xù)被開發(fā)出來［108］。早在2012年，就有兩個解脂耶氏酵母的GEM（iNL895［109］和iYL619_PCP［110］）被報道，然而，對這兩種解脂耶氏酵母的GEM 關(guān)注更多的是重建和表征解脂耶氏酵母的代謝網(wǎng)絡(luò)，而不是有關(guān)GEM 的應用。2015年和2016年，奧地利和瑞典的兩個研究小組重新構(gòu)建了解脂耶氏酵母的GEM，分別為iMK735［111］和iYali4［112］。這兩個新模型比前兩個模型更面向應用，其中iMK735被成功用于優(yōu)化野生解脂耶氏酵母補料分批發(fā)酵產(chǎn)油脂［111］，而iYali4 則作為一個框架，用于裝載轉(zhuǎn)錄組、脂質(zhì)組以及發(fā)酵物譜，以揭示解脂耶氏酵母的脂質(zhì)代謝調(diào)控新機制［112］。

以上4 種解脂耶氏酵母的GEM 均是基于不同的基礎(chǔ)模型、資源和數(shù)據(jù)庫而獨立開發(fā)出來的［108］。其中，iNL895 和iYali4 來源于不同版本的釀酒酵母代謝網(wǎng)絡(luò)模型［113］，iYL619_PCP 是基于多個數(shù)據(jù)庫中的生化和基因組信息組裝而成，如KEGG 和BiGG［110］，而iMK735則是使用高質(zhì)量的釀酒酵母GEM--iND75 作為基礎(chǔ)重建而來［114］。最近，Wei 等［115］和Mishra 等［116］利用更新的解脂耶氏酵母GEM（iYL_2.0 和iYLI647，分別是基于iYL619_PCP 和iMK735 的更新版本） 和現(xiàn)有CSOM探索了相應的工程策略。在這兩項探索中，研究者測試了各種CSOM，例如，將OptGeneKnock［117］和APGC［118］用于脂質(zhì)的高產(chǎn)，將tSOT和輔因子修飾分析用于十二碳二元酸的高產(chǎn)［119］。然而，盡管這些新模型提出了一些有建設(shè)性的建議，它們均未能成功地發(fā)現(xiàn)新的基因操作靶點，而且沒有經(jīng)過實驗驗證。2019 年，Kim 等［120］基于模型iMK735，證明了環(huán)境代謝調(diào)節(jié)最小化算法（eMOMA）可以用于預測氮限制條件下解脂耶氏酵母的代謝通量分布，并可用于鑒定提高脂質(zhì)產(chǎn)量的基因操作靶標。基于eMOMA的設(shè)計方法，不僅驗證了已知的工程改造靶標，而且成功預測了新穎的和非直覺的靶標。通過敲除新鑒定的基因操作靶標YALI0F30745g，使解脂耶氏酵母的脂質(zhì)產(chǎn)量增加了45%。

最近，我國科學家［121］構(gòu)建了解脂耶氏酵母模式菌株W29的GEM--iYli21，并基于該模型整合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)系統(tǒng)解析了碳代謝途徑。該模型預測190 種Biolog 碳源利用達到85.7%的準確率。以轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)為約束，利用該模型計算了解脂耶氏酵母在葡萄糖、甘油、十六烷、油酸、三油酰甘油酯、三丁酰甘油酯6種碳源下的代謝流分布。當以葡萄糖和甘油為唯一碳源時，代謝流集中在糖酵解，而當以脂肪酸、烷烴和甘油酯為唯一碳源時，大部分代謝流分布于糖異生和脂肪酸氧化。隨后，利用該模型預測了46種底物生產(chǎn)5種常見產(chǎn)物（檸檬酸、赤蘚糖醇、3?脫氫莽草酸、油酸、檸檬烯）的得率，發(fā)現(xiàn)己酸在最大理論產(chǎn)率方面相比其他底物具有明顯優(yōu)勢。經(jīng)對比分析，iYli21 與已報道的解脂耶氏酵母其他代謝模型相比，具有表型預測一致性高、代謝反應覆蓋全等特點（表2）。該模型將成為研究解脂耶氏酵母代謝機制，理性設(shè)計解脂耶氏酵母底盤細胞的有力工具。

表2 解脂耶氏酵母各種基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型統(tǒng)計Table 2 Summary of the different GEMs available for Yarrowia lipolytica

4 解脂耶氏酵母底盤細胞的應用

解脂耶氏酵母獨特的生理生化特征使其在多種化合物的生物合成方面具有獨特的優(yōu)勢。合成生物學技術(shù)的發(fā)展和工具的開發(fā)，極大地促進了解脂耶氏酵母底盤細胞工程改造與應用的快速發(fā)展。本節(jié)主要對近年來利用解脂耶氏酵母底盤細胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)、有機酸、萜烯類、功能糖及糖醇類、脂肪酸及衍生物、聚酮類和黃酮類以及氨基酸衍生物類等化合物的應用實例進行了總結(jié)，解脂耶氏酵母底盤細胞合成各種化合物的代謝途徑如圖1所示。

4.1 蛋白類

異源蛋白由于其較高的學術(shù)和商業(yè)應用價值，已引起科學家廣泛的興趣。部分絲狀真菌由于具有高效的蛋白分泌能力，已被廣泛研究用于生產(chǎn)異源重組蛋白，例如曲霉和木霉［122?123］，但是絲狀真菌也面臨諸多局限性，例如細胞形態(tài)不易控制、生長緩慢、發(fā)酵周期長和表達蛋白種類少等。解脂耶氏酵母在生產(chǎn)異源蛋白方面具有獨特的優(yōu)勢，可使用廣泛的底物，具有后翻譯轉(zhuǎn)錄機制及大量分泌蛋白質(zhì)的能力，且不受高糖基化問題或代謝物在有氧條件下轉(zhuǎn)向乙醇生產(chǎn)的阻礙，使其可以高效分泌表達復雜的異源蛋白［84，124］。解脂耶氏酵母中堿性胞外蛋白酶基因（XPR2）可在蛋白胨誘導下高水平表達，堿性胞外蛋白酶產(chǎn)量達1～2 g/L，其已經(jīng)成為蛋白質(zhì)分泌研究的模型［125］。此外，解脂耶氏酵母其他幾種內(nèi)源蛋白質(zhì)（脂肪酶、磷酸酶和酸性胞外蛋白酶）也有較高的分泌水平［30］。2006 年，中國臺灣Yeastern 公司開發(fā)商用YLEX?試劑盒用于異源蛋白的分泌和表達［50］。該試劑盒目前已用多種工業(yè)酶蛋白的表達，如脂肪酶、α?淀粉酶、木聚糖酶A、溶解性多糖單氧酶和葡萄糖氧化酶等［126?130］。此外，單細胞蛋白中的氨基酸組分齊全，可利用率高，還含維生素、無機鹽、脂肪和糖類等，具有很好的營養(yǎng)價值，解脂耶氏酵母由于其獨特的生理生化特征，也一直用于生產(chǎn)單細胞蛋白［131?133］。

重組治療蛋白的生產(chǎn)是分子醫(yī)學快速發(fā)展的領(lǐng)域之一，目前在多種疾病的治療中發(fā)揮著重要作用。人干擾素α2b（hIFN 2b）是包含兩個二硫鍵的復合細胞因子，作為抗病毒和抗腫瘤藥物應用。由于解脂耶氏酵母具有較高效的分泌途徑和較低的糖基化水平，hIFN 2b 已經(jīng)作為模型蛋白在解脂耶氏酵母中生產(chǎn)，通過培養(yǎng)基和培養(yǎng)過程的優(yōu)化，其產(chǎn)量增加了3500 倍，生物活性提高了25倍［134?135］。解脂耶氏酵母也被開發(fā)作為生產(chǎn)人型末端甘露糖糖基化蛋白的平臺，即Man8GlcNAc2或Man5GlcNAc2，并鑒別出高爾基體α?1，6?甘露糖基轉(zhuǎn)移酶YlOCH1，發(fā)現(xiàn)其對N?寡糖鏈的延伸至關(guān)重要，可為其他糖蛋白的改造提供指導［91］。相似地，另一研究團隊也鑒別了解脂耶氏酵母中YlMPO1在甘露糖基磷酸化中的重要作用［136］，可為解脂耶氏酵母中特異性糖基修飾構(gòu)建人源化糖基化途徑提供指導。盡管目前解脂耶氏酵母中重組治療蛋白的研究還比較基礎(chǔ)，但是因解脂耶氏酵母底盤細胞的優(yōu)勢以及重組治療性蛋白極大的市場（數(shù)十億美元），通過現(xiàn)有合成生物學工具進一步優(yōu)化菌株，對未來提高治療性蛋白的生產(chǎn)效率是十分必要的。

4.2 有機酸

包括TCA 循環(huán)前體和中間體在內(nèi)的有機酸的分泌，是解脂耶氏酵母最為顯著的生化特征之一。解脂耶氏酵母底盤細胞具有較高的TCA 循環(huán)通量及低pH 值耐受性，意味著該底盤細胞具有高水平生產(chǎn)TCA 循環(huán)中間體--各種有機酸的潛力。在這些有機酸中，檸檬酸積累的優(yōu)勢尤為明顯［137］。基于與釀酒酵母的氨基酸序列比對，Yuzbasheva等［138］鑒別和表征了解脂耶氏酵母中唯一的檸檬酸轉(zhuǎn)運蛋白YlYhm2，該蛋白負責檸檬酸鹽在線粒體膜上的轉(zhuǎn)運。YlYhm2 和磷酸腺苷脫氨酶YlAmpd的共表達導致細胞質(zhì)檸檬酸滴度顯著增加，產(chǎn)量和生產(chǎn)強度分別達到97.1 g/L 和0.93 g/（L·h）。該研究團隊還報告了線粒體琥珀酸?富馬酸轉(zhuǎn)運蛋白YlSfc1在調(diào)控線粒體異檸檬酸逸出中的作用，通過共表達YlSfc1和YlAmpd并失活YlYhm2后，異檸檬酸的積累顯著增強，產(chǎn)量達到（136.7 ± 2.5）g/L［139］。

除此之外，解脂耶氏酵母也用于生產(chǎn)琥珀酸、衣康酸、α?酮戊二酸和丙酮酸。例如，通過轉(zhuǎn)運蛋白工程，即鑒別琥珀酸線粒體轉(zhuǎn)運蛋白加強琥珀酸分泌出線粒體，并通過篩選C4?二羧酸轉(zhuǎn)運體加強琥珀酸的胞外分泌，同時優(yōu)化琥珀酸生物合成途徑，最終琥珀酸的產(chǎn)量達到101.4 g/L［140］。同樣地，通過異源表達線粒體順烏頭酸轉(zhuǎn)運蛋白Mtt，強化順烏頭酸從線粒體轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)，極大地促進了解脂耶氏酵母中衣康酸的積累，達到22.03 g/L［141］。此外，通過篩選野生菌株，結(jié)合隨機突變和培養(yǎng)基優(yōu)化，解脂耶氏酵母分別產(chǎn)生67.4 g/L α?酮戊二酸和39.1 g/L 丙酮酸［142?144］。總的來說，這些結(jié)果表明解脂耶氏酵母作為底盤細胞生產(chǎn)有機酸具有很大的優(yōu)勢和良好的前景。

4.3 萜烯類

得益于固有的甲羥戊酸（MVA）途徑、高通量的乙酰輔酶A 和NADPH 供給以及天然疏水性微環(huán)境，解脂耶氏酵母是生產(chǎn)萜烯類的理想底盤細胞［145?147］。萜烯類化合物是一種來源于植物的次級代謝產(chǎn)物，廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化妝品和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域［148］。所有萜烯類化合物均來自異戊烯焦磷酸鹽（IPP）及其異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），兩者都是五碳結(jié)構(gòu)單元。根據(jù)異戊二烯的數(shù)量，萜類化合物可分為單萜（C10）、倍半萜（C15）、二萜（C20）、三萜（C30）和四萜（C40）［10］。解脂耶氏酵母中萜烯類化合物的合成通常通過過表達MVA 途徑的關(guān)鍵酶HmgR（或截短N 端的tHmgR）和下調(diào)競爭路徑（如角鯊烯和脂質(zhì)途徑）實現(xiàn)。結(jié)合異源萜烯合酶的引入，解脂耶氏酵母底盤細胞已被改造用于生產(chǎn)多種萜烯類化合物，如檸檬烯［149?150］、α?法尼烯［56］、β?法尼烯［150］、α?葎草烯［151］、（-）?α?紅沒藥醇［57，152］、赤霉素［153］、角鯊烯［154］、樺木酸［155］、番茄紅素［156］、β?胡蘿卜素［157］和蝦青素［158］等。

作為產(chǎn)油酵母，解脂耶氏酵母是合成和積累疏水性萜烯類化合物的理想底盤。由于細胞質(zhì)的親水環(huán)境，疏水化合物在這一環(huán)境下高通量的積累具有一定的難度。越來越多的研究表明疏水化合物一般在細胞膜或脂質(zhì)體中積累［157，159］，如大腸桿菌和釀酒酵母就以細胞膜積累這些疏水性物質(zhì)［159?160］，然而細胞膜儲存一方面容易造成膜流動性受損，另一方面其溶解度受到很大的限制。與之對應的，解脂耶氏酵母可利用其獨特的細胞器脂質(zhì)體儲存疏水性物質(zhì)，具有一定的優(yōu)勢，在解脂耶氏酵母的脂質(zhì)體中積累的番茄紅素和β?胡蘿卜素分別能達到4.2 g/L 和6.5 g/L［157，161］，顯著高于釀酒酵母的同類研究。此外，由于其轉(zhuǎn)錄后修復機制以及豐富的細胞內(nèi)膜，解脂耶氏酵母也被認為是膜蛋白（例如P450 酶）功能表達的優(yōu)選底盤。P450 酶是萜烯類化合物合成生物學研究中重要的生物元件，例如通過P450 酶修飾萜烯骨架，已經(jīng)在解脂耶氏酵母中實現(xiàn)了樺木酸［155］、圓柚酮［162］、赤霉素［153］、脫落酸［163］和人參皂苷CK［164］等具有復雜結(jié)構(gòu)萜烯類化合物的合成。

4.4 功能糖及糖醇類

糖醇是一組無環(huán)氫化碳水化合物，在生物醫(yī)學、制藥、綠色化學和農(nóng)業(yè)食品等領(lǐng)域具有廣泛的應用前景［165］。例如，赤蘚糖醇不會影響血液中的胰島素水平，因此是一種安全的甜味劑，在飲料、食品和藥品原料方面都有廣泛的應用［166］。2017 年，來自波蘭的科學家揭示解脂耶氏酵母中以甘油和葡萄糖為底物合成赤蘚糖醇的主要代謝途徑［167］。赤蘚糖醇主要是通過磷酸戊糖途徑生產(chǎn)，其中轉(zhuǎn)酮酶起著最重要的作用，其過表達可提高赤蘚糖醇產(chǎn)量2 倍。最近，結(jié)合UV 和ARTP聯(lián)合突變產(chǎn)生解脂耶氏酵母突變庫，利用2.2.4 節(jié)所述的赤蘚糖醇生物傳感器，研究者快速表征了含1152 個突變菌株，最終在解脂耶氏酵母底盤細胞中生產(chǎn)高達148 g/L的赤蘚糖醇［102］。D?蘇糖醇是赤蘚糖醇的非對映異構(gòu)體，也廣泛應用于醫(yī)藥、食品、綠色化學等領(lǐng)域。通過木糖醇脫氫酶（Xdh）從赤蘚糖醇合成D?蘇糖醇是目前研究最多的方法。通過在產(chǎn)赤蘚糖醇的解脂耶氏酵母中過表達來自樹干畢赤酵母（Scheffersomyces stipitis）的XDH基因，D?蘇糖醇的產(chǎn)量達到了112 g/L［168］。

木糖醇是一種用作甜味劑的糖醇，具有良好的抗炎作用，可有效治療慢性炎癥性疾病，在牙科和口腔疾病方面有極大的應用［169］。盡管解脂耶氏酵母中有完整的木糖利用途徑，但由于控制該途徑的關(guān)鍵酶（Xdh 和Xks）受到嚴格調(diào)控，導致解脂耶氏酵母無法在木糖上生長。Prabhu 等［170］建立并優(yōu)化了將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇的生物過程，顯示了解脂耶氏酵母將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇的巨大潛力，其產(chǎn)量接近理論值（＞90%），且產(chǎn)生的木糖醇濃度與最佳木糖醇生產(chǎn)者（熱帶假絲酵母）相似，表明解脂耶氏酵母具備從廉價原料合成木糖醇的潛力。

2'?巖藻糖基乳糖（2'?fucosyllactose，2'?FL）是人乳中含量最高的乳糖，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、免疫調(diào)節(jié)及促進神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和修復等多種活性功能［171］。最近，DuPont 研究團隊［172］以解脂耶氏酵母為底盤細胞，導入異源乳糖轉(zhuǎn)運蛋白（Lac12）和將GDP?甘露糖轉(zhuǎn)化為GDP?巖藻糖的酶，結(jié)合α?1，2?巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的表達，在解脂耶氏酵母中實現(xiàn)2'?FL 的生產(chǎn)，且其產(chǎn)量與傳統(tǒng)生產(chǎn)者大腸桿菌相當。此外，工程解脂耶氏酵母菌株也是合成異麥芽酮糖和海藻糖的有力的底盤細胞，產(chǎn)量可分別達到572.1 g/L和219 g/L［173?174］。

4.5 脂肪酸及衍生物

解脂耶氏酵母作為一種安全的產(chǎn)油酵母，已被研究用于生產(chǎn)各類常規(guī)和非常規(guī)的脂肪酸及其衍生物。解脂耶氏酵母體內(nèi)的脂質(zhì)主要以中性甘油三酯（TAG）為主，且含有少量的甾醇酯。TAG的合成主要以3?磷酸甘油（G3P）為骨架將各類脂肪?；o酶A 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中組裝，最終會被儲存到脂滴（LB）中。解脂耶氏酵母的天然脂肪酸主要為棕櫚酸（C16：0）、棕櫚油酸（C16：1Δ9）、硬脂酸（C18：0）、油酸（C18：1Δ9）和亞油酸（C18：2Δ9Δ12），還含有極少的C20～C24偶數(shù)鏈飽和脂肪酸［8］。其體內(nèi)豐富的乙酰輔酶A 得益于獨特的檸檬酸穿梭途徑，這為脂肪酸的合成提供了充足的前體［8，175］。從頭合成脂肪酸以乙酰輔酶A以及乙酰輔酶A羧化酶催化合成的丙二酰輔酶A為原料。其中乙酰輔酶A充當起始單元，丙二酰輔酶A 充當延伸單元由脂肪酸合成酶（Fas）催化每次通過Claisen?like 反應延長2 個碳鏈，終產(chǎn)物為飽和的C16和C18脂肪?；o酶A（C16：0和C18：0）。隨后C16和C18脂肪?；o酶A進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進一步延長去飽和修飾并結(jié)合到G3P骨架通過Kennedy途徑組裝成TAG。

基于內(nèi)源的脂肪酸和脂質(zhì)合成代謝，已經(jīng)開發(fā)了一系列工程策略用于提升解脂耶氏酵母的總脂質(zhì)。經(jīng)典的工程策略主要包括過表達內(nèi)源或表達外源基因加強脂肪酸的合成與積累，以及破壞脂肪酸降解途徑。具體包括加強脂肪酸合成前體乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A的供應，加強脂質(zhì)合成骨架G3P 的供應，加強脂肪酰輔酶A 到TAG 的積累，以及阻斷TAG 和脂肪酰輔酶A 的降解。另外新興的工程策略主要包括重構(gòu)NADPH 途徑、抵御活性氧、加強脂肪酸的分泌、實驗室適應性進化、組學工程以及計算機輔助設(shè)計等［9］。這些策略促進了解脂耶氏酵母中脂肪酸及其衍生物的合成，最高的脂質(zhì)滴度達到了115 g/L［176］，最高脂質(zhì)含量超過細胞干重的90%［32］。在高脂質(zhì)積累的菌株中過表達脂肪酶并破壞激活游離脂肪酸至脂肪酰輔酶A 途徑的酶可有效積累游離脂肪酸，過量的游離脂肪酸會分泌到胞外，首次突破了解脂耶氏酵母胞內(nèi)脂質(zhì)生產(chǎn)100%占比的物理限制，最高占細胞干重的120%［177］。這些案例顯示出利用解脂耶氏酵母生產(chǎn)脂質(zhì)產(chǎn)品的可能性。這類脂質(zhì)產(chǎn)品可衍生為一系列化合物如脂肪醛、烷烴、烯烴、脂肪酸酯等，有潛力作為新一代的生物能源代替化石燃料［178］。

除了解脂耶氏酵母中的天然脂肪酸外，許多具有特殊碳鏈長度或官能團的非常規(guī)脂肪酸廣泛應用于化工、材料、營養(yǎng)和制藥行業(yè)。非常規(guī)脂肪酸包括但不限于奇鏈脂肪酸、共軛脂肪酸、多不飽和脂肪酸、環(huán)丙烷脂肪酸、甲基支鏈脂肪酸、羥基脂肪酸和中鏈脂肪酸。隨著合成生物學的快速發(fā)展，許多新的基因工具箱已被建立以工程改造微生物生產(chǎn)非常規(guī)的脂肪酸及其衍生物［8］。碳鏈長度不同的脂肪酸具有顯著不同的特性，在能源、材料、醫(yī)藥和營養(yǎng)等領(lǐng)域有著廣泛的應用。通過改造脂肪酸合成酶、硫酯酶、β?氧化途徑、延長和去飽和途徑、多不飽和脂肪酸合成酶途徑和奇鏈脂肪酸合成途徑可調(diào)控脂肪酸的碳鏈長度生產(chǎn)定制鏈長的脂肪酸及其衍生物［9］。表達異源的硫酯酶以及改造內(nèi)源Fas 的延伸域能夠縮短脂肪酸的鏈長以生產(chǎn)中鏈脂肪酸，含量最高達到總脂肪酸的45%［179］。激活的脂肪酸會進入β?氧化途徑被降解，通過調(diào)節(jié)不同鏈長特異性的?；o酶A 氧化酶基因（POX1-6）可調(diào)控碳鏈長度從而生產(chǎn)中鏈的甲基酮［180］、聚羥基脂肪酸酯［181］、γ?癸內(nèi)酯［182］等。通過改造延長去飽和途徑和表達多不飽和脂肪酸合成酶能夠生成各類ω?3 和ω?6 型的多不飽和脂肪酸，如α?亞麻酸（ALA）、γ?亞麻酸（GLA）、花生四烯酸（ARA）、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）等［183?189］。杜邦公司在解脂耶氏酵母中改造延長去飽和途徑、破壞β?氧化途徑以及加強磷脂途徑能夠合成占總脂肪酸56.6%的EPA，并通過進一步改造成功將其推向商業(yè)化［184，190］。通常解脂耶氏酵母中的脂肪酸從頭合成是以乙酰輔酶A 為起始單元每次延伸兩個碳原子，將起始單元換成C3或者C5的底物可實現(xiàn)奇數(shù)鏈脂肪酸的合成［191］。在解脂耶氏酵母體內(nèi)構(gòu)建丙酰輔酶A 從頭合成途徑能夠以葡萄糖為底物從頭合成奇數(shù)鏈脂肪酸，最高達到總脂肪酸的5.64%［192］。

4.6 聚酮類和黃酮類

聚酮化合物，作為具有生物活性的天然產(chǎn)物，在細胞防御機制中發(fā)揮重要作用。聚酮化合物通常由多功能酶聚酮化合物合酶（PKS）合成。三乙酸內(nèi)酯是一種典型的Ⅲ型聚酮化合物，以丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A為前體。研究者首先嘗試通過大腸桿菌［193］和釀酒酵母［194］等模式微生物合成三乙酸內(nèi)酯，然而最高產(chǎn)量僅為5.2 g/L［194］。由于高水平的內(nèi)源性前體（如丙二酰輔酶A 和乙酰輔酶A），結(jié)合提高的β?氧化效率和丙酮酸旁路途徑，工程解脂耶氏酵母產(chǎn)生的三乙酸內(nèi)酯比傳統(tǒng)宿主高7 倍多，達到（35.9±3.9）g/L［195］。此外，研究者在解脂耶氏酵母體內(nèi)異源表達非洲菊來源的2?吡喃酮合酶基因，實現(xiàn)三乙酸內(nèi)酯的生產(chǎn)，并以其為前體轉(zhuǎn)為一種有價值的抗生素廣藿香酮，其轉(zhuǎn)化率可達到96%［196］。最近，研究者使用廉價的碳源乙酸鹽代替葡萄糖，以丙酮酸脫氫酶復合途徑實現(xiàn)乙酸鹽到乙酰輔酶A 的快捷通路，三乙酸內(nèi)酯產(chǎn)量達到4.76 g/L［197］，該研究表明解脂耶氏酵母具有將低成本乙酸生成其他高價值聚酮化合物的潛力。

此外，黃酮作為植物著色劑天然存在，黃酮化合物及其衍生物具有重要的藥學功能，代表了一個多樣化的生物活性化合物家族［198］。由于其較高的內(nèi)源前體水平以及疏水脂質(zhì)體的存在，解脂耶氏酵母也是生產(chǎn)植物源黃酮類化合物的合適底盤細胞。目前，解脂耶氏酵母底盤細胞已經(jīng)被成功改造用于生產(chǎn)白藜蘆醇［199?200］、柚皮素［96，101，198］和圣草酚［201］等黃酮類化合物。傳統(tǒng)上，柚皮素在大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌和釀酒酵母中產(chǎn)生，最大滴度分別為191.9 mg/L［202］、35 mg/L［203］和648.63 mg/L［204］。而在解脂耶氏酵母中，通過修飾β?氧化途徑和乙酰輔酶A 合成途徑，柚皮素的產(chǎn)量已經(jīng)達到898 mg/L，這是目前在異源宿主中合成的最高柚皮素水平［199］。圣草酚是以柚皮素為底物，通過黃酮?3?羥化酶和細胞色素P450還原酶（CPR）合成。通過將柚皮素途徑以及來自不同植物的黃酮?3?羥化酶和CPR 整合到解脂耶氏酵母基因組中來生產(chǎn)圣草酚，進一步通過增加CPR 拷貝數(shù)以及過程優(yōu)化將產(chǎn)量提高到134.2 mg/L［201］，產(chǎn)量相較于大腸桿菌中達到的114 mg/L 具有優(yōu)勢［205］，但是仍然低于釀酒酵母中的產(chǎn)量200 mg/L［206］，還需要進一步工程改造優(yōu)化。

4.7 氨基酸衍生物類

由L?苯丙氨酸（L?Phe）可以生物轉(zhuǎn)化合成2?苯乙醇，2?苯乙醇是一種高價值芳香族化合物，廣泛用于食品、香料和香精行業(yè)。2013 年，研究者首先考察了6種不同解脂耶氏酵母菌株合成2?苯乙醇的能力，發(fā)現(xiàn)不同菌株合成2?苯乙醇的能力有差異（0.01～0.24 g/L），并且生產(chǎn)效率取決于菌株，在添加L?Phe 的培養(yǎng)基中，2?苯乙醇的產(chǎn)量達到2 g/L［207］。隨后，該研究團隊通過全蛋白質(zhì)組定量質(zhì)譜分析獲得直接或間接參與L?Phe 轉(zhuǎn)化為2?苯乙醇的蛋白質(zhì)圖譜，為進一步工程改造提高解脂耶氏酵母產(chǎn)2?苯乙醇提供指導［208］。最近，另一個研究團隊表征了從L?Phe 轉(zhuǎn)化為2?苯乙醇的艾氏途徑，并逐步重構(gòu)艾氏途徑確定最佳的催化模塊，結(jié)合細菌來源胞質(zhì)α?酮戊二酸途徑重構(gòu)和阻斷競爭路徑，在搖瓶水平合成了2669.54 mg/L的2?苯乙醇，L?Phe 的轉(zhuǎn)化率達到95%［209］。該研究團隊還系統(tǒng)表征和刪除莽草酸途徑的限速步驟，實現(xiàn)了5 種芳香族化學物質(zhì)在解脂耶氏酵母的從頭合成，包括來源于L?Phe的2?苯乙醇、來源于L?酪氨酸的對香豆酸、來源于L?色氨酸的紫桿菌素、白藜蘆醇和脫氧紫芥子苷。其中，2?苯乙醇、紫桿菌素和脫氧紫芥子苷是酵母中從頭合成的最高產(chǎn)量，分別達到（2426.22±48.33）mg/L、（366.30±28.99）mg/L 和（55.12±2.81）mg/L［210］。這些結(jié)果表明解脂耶氏酵母是生產(chǎn)各種氨基酸衍生物的極具潛力的宿主。最近，研究者使用GoldenGate 克隆工具包構(gòu)建產(chǎn)紫桿菌素的解脂耶氏酵母文庫，擴展解脂耶氏酵母合成天然產(chǎn)物的工具箱［211］。

犬尿酸是一種L?色氨酸分解代謝的化合物，具有抗氧化和神經(jīng)保護作用，這使其成為具有生物醫(yī)學意義的重要代謝物。已有研究發(fā)現(xiàn)解脂耶氏酵母在優(yōu)化的添加L?色氨酸的培養(yǎng)基中，可生產(chǎn)犬尿酸，由此確認解脂耶氏酵母中存在犬尿酸的合成代謝路徑［212］。隨后，研究者通過在培養(yǎng)基中添加不同來源的蜂蜜作為碳源和能源提高犬尿酸的產(chǎn)量，結(jié)果表明，使用栗子蜂蜜時，培養(yǎng)液和酵母生物量中犬尿酸含量最高。盡管這一發(fā)現(xiàn)的實用性有待進一步研究，但本研究為在解脂耶氏酵母中合成犬尿酸提供了新的數(shù)據(jù)和資源［213］。此外，組氨酸、半胱氨酸和S?腺苷甲硫氨酸衍生的麥角硫因是一種天然存在的抗氧化劑，在改善神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病方面有顯著的作用，解脂耶氏酵母也是生產(chǎn)麥角硫因的有潛力的底盤細胞。來自丹麥的學者通過在解脂耶氏酵母中整合麥角硫因合成途徑以及途徑基因多拷貝，在1L 生物反應器中采用磷酸鹽限制補料分批發(fā)酵，麥角硫因的產(chǎn)量達到1.63 g/L［214］。

5 總結(jié)與展望

解脂耶氏酵母因具有獨特的生理生化特征，在多種化合物的生物合成方面展現(xiàn)了獨特的優(yōu)勢。合成生物學工具的開發(fā)，極大地促進了解脂耶氏酵母底盤細胞工程改造與應用的快速發(fā)展。隨著合成生物學的快速發(fā)展，針對解脂耶氏酵母的新調(diào)控元件逐漸被開發(fā)出來，如新的啟動子、終止子元件、新的篩選標記等，這使得其合成生物學工具箱得以進一步完善，并用于改造解脂耶氏酵母底盤細胞，使其能夠更高效地合成各種化學品、燃料和天然產(chǎn)物（表3）。近年來，CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)在解脂耶氏酵母中建立并不斷完善，已得到了初步的應用，顯著提升了基因操作的效率，為解脂耶氏酵母底盤細胞的進一步升級改造奠定了基礎(chǔ)。

表3 解脂耶氏酵母底盤細胞的應用實例Table 3 Representative application examples of engineered Y. lipolytica chassis cell

然而，與傳統(tǒng)模式微生物（如大腸桿菌、釀酒酵母等）相比，解脂耶氏酵母底盤細胞的遺傳改造仍然存在工具少、效率低、操作煩瑣等問題，在底盤系統(tǒng)化改造、復雜途徑組裝優(yōu)化等方面存在較大的挑戰(zhàn)。依然需要進一步挖掘新的合成生物學元件，如新的啟動子和終止子元件，前期研究工作中雖然已經(jīng)開發(fā)了諸多高效野生型和雜交型啟動子，但與模式微生物釀酒酵母相比依然很少，未來工作可集中于構(gòu)建序列更短、功能更強、轉(zhuǎn)錄活性范圍更廣的啟動子，并挖掘更多的可誘導啟動子以控制基因表達進行開關(guān)操作，同時探究解脂耶氏酵母中啟動子和終止子工程的聯(lián)合開發(fā)與應用；在此基礎(chǔ)上構(gòu)建適用于解脂耶氏酵母底盤細胞的穩(wěn)定性外源高效表達載體，用于快速和高效的基因工程操作。在復雜途徑組裝與優(yōu)化方面，可進一步提高外源基因的轉(zhuǎn)化效率，建立高效的DNA 組裝方法，全面實施和利用CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)，在此基礎(chǔ)上開發(fā)基因表達的精細調(diào)控策略。此外，針對異源蛋白在解脂耶氏酵母中表達活性偏低、內(nèi)源途徑和異源途徑難以適配的問題，未來可利用細胞器工程、輔因子工程以及轉(zhuǎn)運體工程等手段，克服諸如前體供應、通量平衡、產(chǎn)物抑制等限制性因素，進一步促進解脂耶氏酵母底盤細胞的升級改造與應用。

為了充分利用并挖掘解脂耶氏酵母底盤細胞的潛能，未來的研究重點還應該包括兩個方面：一是進一步完善該酵母的合成生物學工具箱，提高其遺傳改造效率，具體包括在鑒定新的合成元件的基礎(chǔ)上，開發(fā)新的方法實現(xiàn)基因表達的精細調(diào)控，進一步提高CRISPR/Cas 的編輯效率實現(xiàn)對該酵母的基因組精確快捷的編輯，進一步完善DNA 組裝的效率以快速驗證外源途徑的有效性；二是有效地進行合成生物學與系統(tǒng)生物學等學科的交叉，包括采用自上而下（高通量組學分析）和自下而上（數(shù)學建模方法）的系統(tǒng)生物學工具來確定解脂耶氏酵母底盤細胞高產(chǎn)目標化合物的潛在遺傳改造靶標，進一步在上述完善的解脂耶氏酵母的合成進生物學工具箱基礎(chǔ)上，基于系統(tǒng)生物學方法鑒定的遺傳靶標，對目標基因靶標進行微調(diào)或干擾，最終實現(xiàn)解脂耶氏酵母底盤細胞的升級改造與應用。