王雁南，孫宇輝

（武漢大學(xué)藥學(xué)院，組合生物合成與新藥發(fā)現(xiàn)教育部重點實驗室，湖北 武漢 430071）

自DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)和重組DNA 技術(shù)發(fā)明以來，人們對于如何高效地實現(xiàn)基因的精準(zhǔn)分析和定向改造的探索就不曾停止過?；贑RISPR/Cas 系統(tǒng)開發(fā)的一系列基因編輯工具，因其靈活、高效、普適的特點得到了非常廣泛的應(yīng)用，2020年諾貝爾化學(xué)獎授予對CRISPR/Cas 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展做出重要貢獻的Emmanuelle Charpentier 和Jennifer Doudna，更使CRISPR/Cas 系統(tǒng)及其相關(guān)技術(shù)受到了人們的矚目和厚望。

原核生物的CRISPR/Cas 系統(tǒng)是一類可遺傳的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，它可以存儲原核生物曾被感染的信息，當(dāng)再次被感染時，可利用RNA 引導(dǎo)的核酸酶破壞噬菌體遺傳物質(zhì)，從而發(fā)揮防御或免疫功能。人們將該系統(tǒng)中成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列命名為CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）序列，而將一些鄰近CRISPR 序列且具有特征性的相關(guān)基因命名為Cas（CRISPR?associated gene）［1］。CRISPR/Cas 系統(tǒng)被用作基因編輯工具時，通常由單鏈引導(dǎo)RNA（single guide RNA， sgRNA）引導(dǎo)Cas 蛋白結(jié)合在目標(biāo)位點并產(chǎn)生雙鏈斷裂（double strand break，DSB），隨后經(jīng)細胞的同源修復(fù)（homology?directed repair， HDR）介導(dǎo)精準(zhǔn)編輯或非同源末端連接修復(fù)（nonhomologous end?joining， NHEJ）引入插入和缺失（insertions and deletions， Indels）等突變，從而實現(xiàn)對目標(biāo)序列的靶向編輯［2?3］。盡管CRISPR/Cas 系統(tǒng)相比于以往基因編輯技術(shù)，已經(jīng)展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢和成功，但人們發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas 系統(tǒng)在使用時仍存在不少問題，例如在對人類遺傳疾病中最常見的遺傳變異--點突變［4］進行編輯修復(fù)或是構(gòu)建遺傳疾病模型時，依靠HDR 進行修復(fù)的策略編輯效率較低，并且在應(yīng)用時還存在一系列的限制條件。此外，Cas 蛋白可能會在脫靶位點產(chǎn)生雙鏈斷裂，甚至目標(biāo)位點DNA 修復(fù)途徑的活化都可能對細胞產(chǎn)生不利影響［5?6］。因此，一種無需引入雙鏈斷裂即可實現(xiàn)堿基轉(zhuǎn)換的基因編輯工具--堿基編輯器（base editor， BE）應(yīng)運而生［7］。該工具通過將胞苷或腺苷脫氨酶以及其他功能元件與失去雙鏈切割活性的Cas 蛋白相融合，由sgRNA引導(dǎo)，實現(xiàn)對基因組上目標(biāo)位置的胞嘧啶或腺嘌呤的堿基轉(zhuǎn)換。堿基編輯技術(shù)一經(jīng)問世，便在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。

合成生物學(xué)是近些年發(fā)展日益蓬勃的交叉學(xué)科，它將工程原理應(yīng)用于對生命系統(tǒng)的研究和改造，以期對細胞行為進行創(chuàng)建、編程和控制。合成生物學(xué)在過去數(shù)十年中，在化工、能源、材料、農(nóng)業(yè)、環(huán)境和醫(yī)藥等領(lǐng)域已展露出巨大的生命力。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的化合物可以通過改造培養(yǎng)微生物獲得，人們也在不斷追求高效精準(zhǔn)地改造微生物的能力。而CRISPR/Cas 系統(tǒng)的人工靶向可設(shè)計性等優(yōu)點受到了合成生物學(xué)領(lǐng)域研究者的青睞，基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)開發(fā)的堿基編輯技術(shù)在保留上述CRISPR/Cas 系統(tǒng)優(yōu)點的同時，避免了對目標(biāo)位點DNA 造成雙鏈斷裂，降低了基因編輯產(chǎn)生的細胞毒性。因此，本文對目前已開發(fā)的幾類主要的DNA 堿基編輯器的發(fā)展和工作原理進行了闡述，并重點介紹了堿基編輯器靶向范圍受限和拓展措施，以及造成的脫靶編輯的檢測和優(yōu)化兩方面內(nèi)容。同時，本文還介紹了我國部分科研工作者在微生物合成生物學(xué)領(lǐng)域運用堿基編輯技術(shù)的一些應(yīng)用，并展望了堿基編輯技術(shù)的發(fā)展及其在微生物合成生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

1 堿基編輯技術(shù)概述

1.1 堿基編輯器的發(fā)展

1.1.1 胞嘧啶堿基編輯器和腺嘌呤堿基編輯器的發(fā)展

DNA 堿基編輯器最初是由美國哈佛大學(xué)David R. Liu 研究團隊于2016 年開發(fā)的一種基因編輯工具［7］，其開發(fā)的胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor， CBE）可以實現(xiàn)堿基對C?G 到T?A 的轉(zhuǎn)換。他們將大鼠來源的胞苷脫氨酶APOBEC1 通過一段XTEN linker 連接在dCas9（含D10A 和H840A 突變）的N 端，得到的第一代堿基編輯器BE1通過sgRNA引導(dǎo)結(jié)合在目標(biāo)位點，由dCas9打開雙鏈DNA形成DNA：RNA R?loop結(jié)構(gòu)。胞苷脫氨酶對暴露出的單鏈DNA 上局部的胞嘧啶脫氨，形成尿嘧啶。U·G 堿基對隨后經(jīng)過體內(nèi)DNA 修復(fù)或復(fù)制依次形成U·A、T?A 堿基對，即在DNA 非靶標(biāo)鏈上4～8 號位的窗口內(nèi)（將NGG PAM 所在位置定義為21～23，下同）實現(xiàn)了C 到T 的轉(zhuǎn)換。較低的編輯效率可能是由于體內(nèi)的尿嘧啶DNA 糖基化酶（uracil DNA glycosylase， UDG）切除了脫氨形成的U，使得DNA 被修復(fù)回C?G 堿基對。于是該團隊將抑制UDG活性的尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑（uracil DNA glycosylase inhibitor， UGI）連接于BE1 中dCas9 的C 端，得到的第二代堿基編輯器BE2 編輯活性有了明顯的提升。而第三代堿基編輯器BE3 則是將BE2 中的dCas9 替換為nCas9（D10A），通過在DNA 靶標(biāo)鏈上產(chǎn)生切刻，使DNA 以發(fā)生脫氨后的DNA 非靶標(biāo)鏈為模板進行修復(fù)，進一步提升了堿基編輯的效率，而且僅產(chǎn)生了1.1%的Indels突變（表1）。

表1 代表性堿基編輯器比較Table 1 Comparison of representative base editors

隨后，David R. Liu研究團隊［30］通過更換BE3各功能元件之間的linker，并在UGI 的C 端再連接一個UGI，得到的第四代堿基編輯器BE4進一步提高了堿基編輯的效率。在BE4 的N 端連接來自噬菌體Mu 的Gam 蛋白，利用Gam 蛋白結(jié)合雙鏈斷裂的DNA 末端，使DNA 免于降解，BE4?Gam 相比BE4降低了Indels突變的產(chǎn)生頻率，并且BE4和BE4?Gam 均提高了C 轉(zhuǎn)換為T 的產(chǎn)物純度。此外，他們還通過在BE4 兩端加上核定位信號，并對BE4 進行密碼子優(yōu)化及祖先序列重構(gòu)（ancestral reconstruction），由此獲得的BE4max 和AncBE4 max 成為目前編輯效率最高的CBE 之一［10］。巧合的是，同在2016 年，日本神戶大學(xué)Akihiko Kondo研究團隊［8］也報道了他們研發(fā)的Target?AID（activation?induced cytidine deaminase）胞嘧啶堿基編輯器，由nCas9 （D10A）的C 端連接七鰓鰻來源的胞苷脫氨酶（Petromyzon marinuscytidine deaminase 1，PmCDA1）和UGI 組成，其編輯窗口相比于BE3更靠近PAM遠端的2～4號位。

2017 年，David R. Liu 研究團隊［22］進一步報道了可以實現(xiàn)堿基對A?T到G?C轉(zhuǎn)換的腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor， ABE）。與CBE 不同，自然界未發(fā)現(xiàn)以DNA 為底物的腺苷脫氨酶，于是該研究團隊通過定向進化和蛋白質(zhì)工程使大腸桿菌tRNA 腺苷脫氨酶（Escherichia colitRNA adenosine deaminase，ecTadA）克服了這一限制，利用二聚的TadA 與nCas9（D10A）相連接，并通過一系列優(yōu)化，獲得了腺嘌呤堿基編輯器ABE7.10（wtTadA?TadA*?nCas9，*表示蛋白變體）。ABE7.10在sgRNA 引導(dǎo)下結(jié)合在目標(biāo)位點，由nCas9 打開雙鏈DNA，二聚的TadA 對暴露的單鏈DNA 上局部的腺嘌呤脫氨，形成次黃嘌呤I，經(jīng)過體內(nèi)的錯配修復(fù)和復(fù)制過程，I·T 堿基對依次轉(zhuǎn)換為I·C，G?C 堿基對，實現(xiàn)在DNA 非靶標(biāo)鏈上4～7 號位編輯窗口內(nèi)A到G的轉(zhuǎn)換，產(chǎn)物純度極高，且該過程中Indels 突變的發(fā)生頻率幾乎可以忽略不計。之后，David R. Liu 研究團隊［10］一直在設(shè)法提高ABE 的編輯效率，通過在ABE7.10 兩端添加核定位信號和密碼子優(yōu)化，獲得了活性更強的ABEmax。進一步通過對TadA?7.10 使用噬菌體輔助進化方法進行優(yōu)化，獲得的ABE8e 催化速率相比ABE7.10提高了590倍，顯示出編輯活性以及與各種Cas蛋白變體和同系物兼容性的大幅提升，由此帶來更多的脫靶編輯也可以通過在TadA?8e中引入V106W突變來加以改善［23］。

1.1.2 其他堿基編輯器的發(fā)展

隨著CBE 和ABE 相繼問世，越來越多的堿基編輯需求寄望于依靠堿基編輯器來實現(xiàn)，但是CBE和ABE僅能實現(xiàn)在目標(biāo)位點C?G到T?A或A?T到G?C 的堿基對轉(zhuǎn)換，無法實現(xiàn)其他堿基之間的轉(zhuǎn)變。于是人們自然想到通過將胞苷脫氨酶和腺苷脫氨酶一起融合在nCas9的同側(cè)或兩側(cè)，獲得的ACBE（fusion adenine and cytocine base editor）可以同時實現(xiàn)目標(biāo)位點C?G 到T?A 和A?T 到G?C 堿基對的轉(zhuǎn)換［26，31?35］。人們將融合了胞苷脫氨酶和腺苷脫氨酶的版本ACBE在哺乳動物細胞和植物細胞中進行了測試，并對系統(tǒng)中的其他因素，例如蛋白之間的linker 及sgRNA 的長度進行了系統(tǒng)的考察，發(fā)現(xiàn)這些ACBE都具有較低的脫靶活性。除了將兩個不同的脫氨酶與nCas9融合的策略，也有研究團隊利用普通版本的CBE 或ABE 并通過在sgRNA 上引入MS2 RNA 適配體招募另一種脫氨酶的策略，也可以實現(xiàn)ACBE 的相似功能［27］。這些ACBE 豐富了目標(biāo)位點堿基轉(zhuǎn)換的產(chǎn)物種類，在遺傳疾病的治療、細胞譜系追蹤以及基因隨機突變領(lǐng)域都具有巨大的應(yīng)用前景［26，31?35］。

在堿基編輯器的研究和應(yīng)用過程中，人們發(fā)現(xiàn)CBE 和ABE 不僅僅介導(dǎo)C 到T 或A 到G 的堿基轉(zhuǎn)換，還可能會引起C 到G 或C 到A 的堿基顛換［36?38］。通過分析，發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象可能由于C脫氨后形成的U 被UDG 切除形成AP 位點（apurinic/apyrimidinic site）后，經(jīng)歷細胞內(nèi)的堿基切除修復(fù)過程而導(dǎo)致。于是人們利用UDG 替代CBE 中的UGI，促進細胞切除C 脫氨形成的U，提高了C 堿基顛換的效率。由此開發(fā)的GBE（glycosylase base editors）和CGBE（C?to?G base editors）可以實現(xiàn)哺乳動物細胞內(nèi)C 到G［28，39］，以及大腸桿菌中C 到A 的堿基顛換［39］。此外，有研究利用參與堿基切除修復(fù)途徑的rXRCC1蛋白，以及改善影響C 到G 轉(zhuǎn)變過程的其他因素，開發(fā)了不同版本的CGBE［29，40?41］。雖然相繼有這一類堿基編輯器的開發(fā)被報道，但是細胞內(nèi)C到G的轉(zhuǎn)變過程并未揭示清晰，這也使得該堿基編輯器在研究和使用過程中遇到的一些問題還難以解答，如GBE 在哺乳動物細胞和大腸桿菌中產(chǎn)生了不同的編輯結(jié)果［39］。不過隨著該過程的機制被逐漸闡明，更多更高效的CGBE版本有望被開發(fā)出來。

此外，人們還開發(fā)了可以同時編輯DNA 雙鏈的堿基編輯器：David R. Liu 研究團隊通過將能對DNA雙鏈中的胞嘧啶進行脫氨的細菌間毒素DddA蛋白拆分成兩個部分，并分別與靶向定位作用的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（transcription activator?like effector， TALE）或者不同的Cas 蛋白以及UGI 融合，可以實現(xiàn)當(dāng)兩個定位蛋白在DNA 上結(jié)合位置相距較近時，聚合的DddA 可以對兩者之間的DNA 雙鏈上的C 同時進行脫氨。而其他情況下，兩個拆分的DddA 無法在體內(nèi)聚合，大大降低了該編輯工具的細胞毒性［20］。其中，將拆分的DddA與兩個TALE融合得到的堿基編輯器DdCBEs（RNA?free DddA?derived cytosine base editors），因無需RNA 引導(dǎo)便可發(fā)揮作用，使其可以對無法通過CRISPR/Cas系統(tǒng)進行編輯的線粒體DNA 和葉綠體DNA實現(xiàn)有效的編輯［42］。但是，人們通過全基因組測序方法檢測到DdCBE 會在細胞核內(nèi)造成大量的DNA脫靶編輯［43］。而將分裂的DddA與兩個不同的Cas蛋白［如dSpCas9和SaKKH?Cas9（D10A）］融合之后形成的編輯器，由于系統(tǒng)過于繁復(fù)，反而使得其應(yīng)用變得有限。韓國首爾國立大學(xué)Jin?Soo Kim 研究團隊［21］也發(fā)表了類似的工作，他們開發(fā)的鋅指脫氨酶（zinc finger deaminase， ZFD）將分裂的DddA 與鋅指DNA 結(jié)合蛋白（zinc?finger DNA binding protein）相融合，也能在核DNA和線粒體DNA 上實現(xiàn)類似的編輯。之后，Jin?Soo Kim研究團隊［44］在DdCBE 的基礎(chǔ)上結(jié)合腺苷脫氨酶TadA，經(jīng)歷一系列優(yōu)化改造，開發(fā)出了可以在線粒體基因組實現(xiàn)A 到G 轉(zhuǎn)化的堿基編輯器TALED（TALE?linked deaminase）。

1.1.3 RNA堿基編輯器的發(fā)展

除了DNA 堿基編輯器，人們也開發(fā)了一系列RNA 堿基編輯器來避免DNA 編輯所帶來的遺傳信息不可逆改變以及安全與倫理問題。RNA 堿基編輯使用的脫氨酶大多來自ADAR （adenosine deaminases that act on RNA）家族的腺苷脫氨酶，ADAR 包含獨特的RNA 結(jié)合基序，識別定位雙鏈RNA 的部分區(qū)域，ADAR 脫氨酶域（ADAR deaminase domain， ADARDD）將腺苷脫去氨基，實現(xiàn)A 到I 的轉(zhuǎn)變［45?46］。人們利用引入發(fā)夾結(jié)構(gòu)或者化學(xué)修飾的反義RNA 與目標(biāo)RNA 互補，供融合了其他蛋白結(jié)合域或標(biāo)簽的ADARDD結(jié)合［47?53］，并將需要編輯的腺苷對側(cè)的反義RNA 設(shè)計為非互補的胞苷，提高更傾向在A·C 錯配處脫氨的ADAR在目標(biāo)腺苷處的編輯效率［50］，這一策略被應(yīng)用于大多數(shù)RNA 堿基編輯器的設(shè)計中。而北京大學(xué)魏文勝研究團隊［54］通過設(shè)計ADAR 招募RNA（ADAR?recruiting RNA， arRNA）來招募細胞內(nèi)天然的ADAR1 或ADAR2 蛋白，實現(xiàn)目標(biāo)RNA 從A 到I 的轉(zhuǎn)換。美國哈佛大學(xué)張鋒研究團隊將ADAR2DD與dPspCas13b 融合，通過RNA 引導(dǎo)至目標(biāo)位點，開發(fā)了新的RNA 堿基編輯工具REPAIR（RNA Editing for Programmable A?to?I Replacement）。

REPAIR 對報告基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的編輯效率高于之前通過反義RNA 實現(xiàn)的RNA 堿基編輯，而在細胞內(nèi)源全轉(zhuǎn)錄本的編輯中，其效率也與之前的技術(shù)相比更好或持平。為了提升REPAIR 的編輯特異性，張鋒研究團隊在ADAR2DD引入了E488Q 和T375G兩個點突變，開發(fā)出了REPAIRv2，大幅減少了全轉(zhuǎn)錄組水平和目標(biāo)腺苷上下游近端的脫靶編輯，但也一定程度上降低了目標(biāo)位點的編輯效率［55］。他們之后通過對ADAR2DD進行定向進化，開發(fā)出了RESCUE （RNA Editing for Specific C to U Exchange）系統(tǒng)，可以實現(xiàn)目標(biāo)位點RNA 堿基從C 到U 的轉(zhuǎn)換，同時保留了A 到I 轉(zhuǎn)換的活性，僅需通過在目標(biāo)核苷酸對側(cè)的gRNA中設(shè)計不同的錯配核苷酸即可實現(xiàn)差異化的編輯［56］。除了ADAR家族的脫氨酶，上海科技大學(xué)池天研究團隊和中國科學(xué)院植物生理生態(tài)研究所李軒研究團隊基于APOBEC3A 的RNA 的催化活性，構(gòu)建出可實現(xiàn)C到U 的RNA 堿基編輯器，其中郝沛研究團隊還基于晶體結(jié)構(gòu)開發(fā)了只具有RNA 催化功能的APOBEC3A（A3A）變體［57?58］。

1. 2 堿基編輯器編輯范圍的拓展

堿基編輯工具在不引入DNA 雙鏈斷裂的情況下，實現(xiàn)了高效率的堿基轉(zhuǎn)換（包括顛換），其優(yōu)異的性能使人們希望堿基編輯器可以適用于更多位點的編輯。堿基編輯器可編輯的位點受限于Cas蛋白的定位以及Cas 蛋白打開DNA 雙鏈之后形成的R?loop 與脫氨酶相互作用。人們從這兩方面入手，開發(fā)了一系列具有不同靶向位點和編輯窗口的堿基編輯器。

1.2.1 堿基編輯器靶向位點的拓展

David R. Liu研究團隊［59］通過將rAPOBEC1與Cas9 的工程變體融合，獲得了可以靶向非NGG PAM 的堿基編輯器SaBE3、Sa（KKH）?BE3、VQR?BE3、VRER?BE3 和EQR?BE3。2018 年，該研究團隊又開發(fā)了可識別NG、GAA 和GAT PAM 的xCas9，并考察了它與胞苷脫氨酶和腺苷脫氨酶融合后的編輯效果，發(fā)現(xiàn)xCas9 與BE3、ABE7.10（指除了Cas9 蛋白的其余部分）有很好的兼容性，可以靶向它們之前無法編輯的位點，且xCas9（3.7）?ABE 的編輯效率甚至高于ABE7.10［60］。之后，他們通過定向進化獲得了可以識別NRRH、NRTH和NRCH PAM的Cas9變體，結(jié)合脫氨酶后，使堿基編輯器可以對PAM 為NR 的位點進行編輯［61］。SpCas9?NG 和SpRY 也被用于對非NGG PAM的位點進行堿基編輯，研究發(fā)現(xiàn)nSpCas9?NG?AID（Target?AID?NG）的編輯效率要優(yōu)于xCas9?BE4［12］；而融合SpRY 的堿基編輯器幾乎可以獨立于PAM 靶向目標(biāo)位置［62］。此外，人們還開發(fā)了基于ScCas9 和SmacCas9 的堿基編輯器，分別識別NNG 和NAAA 序列的PAM［63?65］。除了利用Cas9 蛋白變體拓展靶向位點，Cas12a 蛋白也被用于脫氨酶的定位。上海科技大學(xué)陳佳研究團隊［11］通過將rAPOBEC1 與dLbCpf1（dLbCas12a）融合，獲得了可以識別富含胸腺嘧啶核苷酸PAM（TTTV）的dCpf1?BE。美國麻省總醫(yī)院J. Keith Joung 研究團隊［66］通過結(jié)構(gòu)改造獲得了可以識別非TTTV PAM的AsCas12a 蛋白變體enAsCas12a，其可以引導(dǎo)胞苷脫氨酶（enAsBE）在非TTTV PAM 的靶點進行堿基編輯。然而，與這些融合Cas9 變體的CBE 不同，使用Cas9 蛋白變體構(gòu)建的ABE 與經(jīng)典的ABE版本（ABE7.10）相比，大部分的堿基編輯效率較低，可能是因為TadA 蛋白最初是基于與SpCas9 融合后共同進化而來。此外，美國Beam Therapeutics公司Giuseppe Ciaramella 研究團隊［67］也通過基于ABE7.10 的進化獲得了TadA*8，其融合SpCas9?NG和SaCas9展現(xiàn)了較高的編輯活性。

1.2.2 堿基編輯器編輯窗口的拓展

通過更換一些堿基編輯器的Cas蛋白，也可以拓寬堿基編輯器的編輯窗口。如SaABEmax 和SaKKH?ABEmax 編輯器，相較ABEmax（SpCas9）將編輯窗口擴大為4～14 號位［68］。David R. Liu 研究團隊［69］通過將脫氨酶與不同方式循環(huán)排列的SpCas9（Cas9 circular permutants， Cas9?CPs）相融合，試圖使脫氨酶更容易接觸到單鏈DNA底物。融合獲得的兩個CP?CBEmax 保持了與CBEmax 一致的編輯活性，而將編輯窗口拓展為4～11 號位，并且同時提高了C到T的產(chǎn)物純度。這一結(jié)果印證了循環(huán)排列的SpCas9 的新末端使融合的脫氨酶和UGI 更容易接觸到單鏈DNA 底物，從而擴大編輯窗口并阻止UDG 切除U 的推測。而融合后的CP?ABEmax 將編輯窗口擴大到了4～12 號位，還有一例雖未擴大編輯窗口，但是顯示出編輯窗口的平移，并且這些CP?CBEmax 和CP?ABEmax 造成的Indels突變比例均有所下降［68］。

除了可以通過更換Cas 蛋白靶向更多的位點，也可以通過更換脫氨酶拓展堿基編輯器的編輯窗口，并改變堿基編輯的序列偏好性。中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究團隊［13］通過用APOBEC3A 替換APOBEC1，將堿基編輯器的編輯窗口擴大到1～17 號位，并且有效地解決了APOBEC1 偏好編輯T 下游的C（5'?TC?3'基序偏好性），而對G 下游的C（GC 基序）編輯效率低的問題，A3A?PBE 堿基編輯器對C 上下游序列幾乎沒有選擇性。融合APOBEC3A 的堿基編輯器也彌補了APOBEC1 脫氨酶無法對甲基化的C 進行編輯的缺陷［9］。David R. Liu 研究團隊［70］通過用CDA1 替換APOBEC1，并經(jīng)過密碼子優(yōu)化構(gòu)建了CDA1?BE4max，將編輯窗口擴大到1～9 號位。將其進一步定向進化獲得的evoCDA1?BE4max 將編輯窗口擴大到1～13 號位，其與用類似方式優(yōu)化獲得的另外兩個堿基編輯器evoAPOBEC1?BE4max 和evoFERNY?BE4max 均對GC 基序中的C 展現(xiàn)良好的編輯活性。美國萊斯大學(xué)高雪研究團隊［15］通過利用僅保留C 端結(jié)構(gòu)域的APOBEC3G（A3G）替換APOBEC1，并通過蛋白質(zhì)工程改造，獲得了A3G?BE4.4、A3G?BE5.13 和A3G?BE5.14 三個版本的堿基編輯器，將編輯窗口擴大到約4～15 號位，并且在編輯底物為CC 基序的情況下只編輯第二個C，大幅減少了對第一個C 的編輯。上海科技大學(xué)黃行許研究團隊［71］通過優(yōu)化人A3G 蛋白，開發(fā)出的oA3G?BE3 對CC 和CCC 基序中下劃線所在位置的C的編輯相比BE3更具選擇性。吉林大學(xué)李占軍研究團隊［72］通過在AID 脫氨酶中引入突變，融合在nCas9（D10A）的N 端，獲得的堿基編輯器eAID?BE4max將編輯窗口拓展為1～11號位。中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心仇子龍研究團隊［73］通過融合nCas9（D10A）及一系列七鰓鰻胞苷脫氨酶開發(fā)了一系列編輯窗口位于PAM 遠端、近端以及覆蓋整個Protospacer 區(qū)域的堿基編輯器。

也有人通過改變脫氨酶與DNA 的相互作用來拓展編輯的范圍。黃行許研究團隊開發(fā)了BE?PLUS 編輯器，利用了包含多個GCN4 多肽的SunTaq 信號放大系統(tǒng)［74］，通過將SunTaq 標(biāo)簽融合在nCas9（D10A）的N 端，招募單獨表達的scFV?APOBEC?UGI?GB1（scFV 抗體特異性識別GCN4多肽，GB1 為促溶標(biāo)簽，消除蛋白質(zhì)聚集），可以將編輯窗口拓寬到4～16 號位［14］。華東師范大學(xué)李大力研究團隊通過在BE4max、A3A?BE4max 及eA3A?BE4max［75］三個堿基編輯器的脫氨酶與Cas蛋白之間融合Rad51 蛋白的單鏈DNA 結(jié)合域（single?stranded DNA?binding domain， ssDBD），獲得的hyBE4max、hyA3A?BE4max 和heyA3A?BE4max 三個堿基編輯器相比之前的版本大幅拓寬了編輯窗口［76］。四川大學(xué)姚少華研究團隊［77］將胞苷脫氨酶嵌合在Cas9 蛋白的PAM 相互作用域（PAM?interacting domain， PI domain）內(nèi)，獲得了編輯窗口拓展為4～14 號位的堿基編輯器BE?PIGS。復(fù)旦大學(xué)程天林研究團隊［25］通過將腺苷脫氨酶嵌合于Cas9 內(nèi)部的特定位點，獲得了多個版本的ABE?nSpCas9?DS 堿基編輯器，這一系列的堿基編輯器將ABE 編輯窗口拓寬為2～16 號位，并且降低了RNA 脫靶編輯的風(fēng)險。瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院Gerald Schwank 研究團隊［78］通過用TadA替換Cas9 的HNH 結(jié)構(gòu)域，縮小了整個編輯器的大小，并獲得了編輯窗口靠近PAM的堿基編輯器。

此外， Jin?Soo Kim 研究團隊［79］通過在sgRNA 5'端延長2～3 nt，將ABE7.10 的編輯窗口向PAM 遠端延伸2～3 nt。類似編輯窗口延伸的現(xiàn)象也在dCas?CDA?UL、nCas9（D10A）?AID 和CRISPR?CDA?nCas9?UGI等堿基編輯器結(jié)合5'端延長的sgRNA時被發(fā)現(xiàn)［80?82］。

除了拓寬編輯窗口，許多的堿基編輯場景需要堿基編輯器擁有更小的編輯窗口從而產(chǎn)生更精準(zhǔn)的編輯。David R. Liu 研究團隊通過引入突變降低rAPOBEC1 的編輯活性及底物結(jié)合能力，獲得了四種（YE1?BE3、EE?BE3、YE2?BE3 和YEE?BE3）相比于BE3略微降低了編輯活性但是將編輯窗口范圍縮小到1～2 nt 的堿基編輯器，而通過使用截短的sgRNA 未能很好地實現(xiàn)這一點［59］。之后李占軍研究團隊［83］在YE1 的基礎(chǔ)上構(gòu)建了YFE?BE4max，同樣將編輯窗口縮小到3 nt 并在兔子中實現(xiàn)高效率、低脫靶的編輯。德國馬普分子植物生理所Ralph Bock 研究團隊［16，84］通過用5～7 個氨基酸的剛性linker（PAPAP/PAPAPAP）替換BE3 中原有的XTEN linker，將編輯窗口縮小到了5～7 號位，而在nSpCas9 的N 端融合截短C 端的CDA1 或A3A，分別使得堿基編輯幾乎只發(fā)生在3 號位或5～6 號位。J. Keith Joung 研究團隊［19］為了減少堿基編輯器引發(fā)的RNA 隨機突變，開發(fā)了兩個在脫氨酶中引入突變的堿基編輯器變體--BE3?R33A和BE3?R33A/K34A，其在大幅降低RNA 隨機突變頻率的同時，也將編輯窗口縮小到了5～7 號位。中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所張學(xué)禮研究團隊［85］通過設(shè)計非完全匹配的sgRNA 增加了堿基編輯器對目標(biāo)序列單個堿基的編輯比例，并且提高了堿基編輯的效率。

1.3 堿基編輯器編輯特異性的優(yōu)化

1.3.1 堿基編輯器脫靶編輯的檢測

在開發(fā)和應(yīng)用單堿基編輯器的過程中，人們發(fā)現(xiàn)單堿基編輯器可以在目標(biāo)位點及脫靶位點產(chǎn)生多種不需要的編輯副產(chǎn)物。因此，研究者針對性地開發(fā)出了一系列具有更高特異性的單堿基編輯器，以改善這些問題。

通用的編輯產(chǎn)物檢測方法包括對目標(biāo)位點，以及對通過軟件預(yù)測或文獻已發(fā)表的脫靶位點進行桑格測序（Sanger sequencing）或深度測序（deep sequencing），從而進行定點考察［7］，或是通過全基因組測序（whole?genome sequencing， WGS）了解在全基因組的脫靶情況［80］，這些方法都具有各自的局限性。

Jin?Soo Kim研究團隊［86］最早在CBE脫靶編輯的全基因組檢測方面取得突破，他們使用BE3ΔUGI在體外對編輯位點脫氨并在DNA 靶標(biāo)鏈上產(chǎn)生切刻，之后利用尿嘧啶特異性切除試劑，即一種尿嘧啶DNA 糖基化酶及DNA 糖基化酶?裂解酶內(nèi)切酶Ⅷ的混合物，將C脫氨形成的U所在位置的DNA 鏈切斷，形成雙鏈斷裂。之后，DNA 樣本在末端修復(fù)和連接后通過全基因組測序，與參考基因組序列或未經(jīng)編輯處理的對照基因組測序序列比對，尋找基因組上BE3ΔUGI 的編輯位點，該方法被稱為Digenome?seq（digested?genome sequencing）。隨后，中山大學(xué)松陽洲研究團隊和Jin?Soo Kim 研究團隊［87?88］分別開發(fā)了針對ABE 脫靶編輯全基因組檢測的方法，通過類似的策略，先用ABE7.10 在體外對基因組DNA 編輯并產(chǎn)生切刻，之后用內(nèi)切酶Ⅴ對DNA 再次進行處理，切斷脫氨形成的肌苷3'下游的第二個磷酸二酯鍵，從而產(chǎn)生雙鏈斷裂，經(jīng)過DNA 末端修復(fù)后通過全基因組測序?qū)ふ揖庉嬑稽c。但是這種檢測ABE 脫靶位點的方法會遺漏ABE 導(dǎo)致的C 到其他堿基的轉(zhuǎn)變，并且以上幾種方法都是檢測體外編輯的產(chǎn)物，并不能客觀地展示體內(nèi)真實發(fā)生的編輯，于是高彩霞研究團隊和中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所楊輝研究團隊分別對水稻和小鼠體內(nèi)的堿基編輯進行了全基因組分析：高彩霞研究團隊［89］分別用三種不同的堿基編輯器編輯水稻，并設(shè)置只轉(zhuǎn)化堿基編輯器而不轉(zhuǎn)化sgRNA 的對照，之后對編輯植株及野生型植株基因組DNA 進行測序，用野生型植株的測序結(jié)果過濾背景突變，便可觀測到堿基編輯器所引發(fā)的突變；楊輝研究團隊［90］在小鼠受精卵分裂為兩個細胞的時候，對其中一個細胞注射堿基編輯的相關(guān)元件以及熒光蛋白基因，在胚胎成長后的第14.5 天，對胚胎進行消化，通過流式細胞儀對基于熒光蛋白表達分選出發(fā)生編輯和未發(fā)生編輯的細胞，并對二者進行全基因組測序。對比測序結(jié)果，過濾掉未編輯細胞中的背景突變，便可得到發(fā)生編輯細胞的突變情況，這種方法被命名為GOTI（genome?wide off?target analysis by two?cell embryo injection）。David R. Liu 研究團隊和美國Beam Therapeutics 公司Nicole M. Gaudelli研究團隊［18，91］還利用報告系統(tǒng)或者通過其他Cas9蛋白結(jié)合DNA 形成R?loop 結(jié)構(gòu)暴露出單鏈DNA，分別設(shè)計了在細菌和哺乳動物細胞中不需要通過全基因組測序即可檢測堿基編輯器脫靶編輯的方法。之后北京大學(xué)伊成器研究團隊［92］開發(fā)了針對胞嘧啶堿基編輯敏感度更高的檢測技術(shù)Detect?seq（dU?detection enabled by C?to?T transition during sequencing）， 通過利用化學(xué)標(biāo)記和生物素Pulldown 技術(shù)，追蹤CBE 體內(nèi)編輯后的基因組產(chǎn)物中的中間體脫氧尿苷來揭示CBE 的編輯組（editome）。

1.3.2 堿基編輯器在目標(biāo)位點產(chǎn)生的編輯副產(chǎn)物及優(yōu)化策略

通過上述檢測手段，人們發(fā)現(xiàn)堿基編輯器造成的非預(yù)期編輯包括堿基顛換、旁觀者編輯（bystander editing）以及Indels 突變。產(chǎn)生堿基顛換的原因在前文已有介紹，即C脫氨后形成的U被UDG切除，形成AP位點后經(jīng)歷細胞內(nèi)的堿基切除修復(fù)而產(chǎn)生C 到A 或G 的顛換；而ABE 的編輯A的過程中發(fā)生堿基顛換則未見報道，可能由于體內(nèi)從DNA 中切除肌苷的酶的活性或豐度較低，導(dǎo)致A 被編輯后經(jīng)歷堿基切除修復(fù)的可能性極小［22］。當(dāng)編輯窗口內(nèi)存在多個C 或者A 時，除了目標(biāo)堿基，周圍的堿基也被編輯，這種情況被稱為旁觀者編輯。雖然在某些情況下旁觀者編輯的影響不大，例如由于密碼子簡并性，旁觀者編輯可能只會導(dǎo)致沉默突變，或者導(dǎo)致同類型氨基酸的轉(zhuǎn)變，但是其他情況下，旁觀者編輯可能會產(chǎn)生非預(yù)期的嚴(yán)重后果。Indels 突變的產(chǎn)生則主要由堿基編輯器中nCas9產(chǎn)生的切刻或是堿基脫氨之后經(jīng)歷堿基切除修復(fù)所導(dǎo)致。檢測結(jié)果顯示，堿基編輯后確實有少量的Indels突變發(fā)生，并且CBE產(chǎn)生的頻率一般要高于ABE［22］，但堿基編輯導(dǎo)致Indels 突變產(chǎn)生的機理還未被完全揭示［93］。

針對上述情況，人們采取了一系列的改進措施。為了避免產(chǎn)生堿基顛換，人們在堿基編輯器中引入更多的UGI 來降低堿基顛換的概率［14，30］。為了減少旁觀者編輯，人們一方面通過上文介紹的縮小編輯窗口的方法，減少脫氨酶可接觸的底物數(shù)量。另一方面利用脫氨酶編輯序列的偏好性，使得脫氨酶只編輯某些位置的C，例如改造的A3G幾乎只編輯CC 基序中的第二個C［15］。此外，韓國漢陽大學(xué)Sangsu Bae 研究團隊［94］通過在TadA7.10中引入突變，降低了其對旁觀者胞嘧啶脫氨的活性及RNA 編輯的活性。美國萊斯大學(xué)Anatoly B.Kolomeisky 等研究團隊［95］通過數(shù)學(xué)建模分析預(yù)測目標(biāo)堿基和旁觀者堿基的編輯效率，并據(jù)此開發(fā)了提高目標(biāo)堿基與旁觀者堿基編輯比的A3A 版本。針對Indels突變，通過使用dCas9［7］或AsCas12a［66］引導(dǎo)脫氨酶，或者利用噬菌體Mu 的Gam 蛋白［30］均可以降低Indels突變的發(fā)生頻率。

1.3.3 堿基編輯器造成的sgRNA 依賴和非sgRNA依賴的DNA脫靶編輯及優(yōu)化策略

除了在目標(biāo)位點產(chǎn)生非預(yù)期的編輯外，堿基編輯器脫靶到其他DNA 位點也會產(chǎn)生非預(yù)期的編輯產(chǎn)物，包括sgRNA 依賴的DNA 脫靶編輯以及非sgRNA依賴的DNA脫靶編輯。

堿基編輯器所造成的sgRNA 依賴的DNA 脫靶編輯的發(fā)生位點并不完全與sgRNA 引導(dǎo)Cas 蛋白所造成的脫靶編輯的位點相同，其中還受到編輯窗口內(nèi)是否存在脫氨底物、底物上下游的核苷酸種類以及脫氨酶能否接觸到R?loop 結(jié)構(gòu)中DNA 鏈等因素影響。人們發(fā)現(xiàn)這一類脫靶編輯的發(fā)生相比非sgRNA 依賴的脫靶編輯概率較小［89］，但仍給堿基編輯器的應(yīng)用帶來了潛在的風(fēng)險，因此人們對該問題進行了一系列的優(yōu)化。通過使用高保真Cas 蛋白替換野生型Cas 蛋白可以有效降低CBE 和ABE 這一類脫靶編輯發(fā)生頻率，例如HF?Cas9，xCas9（3.7）、Sniper?Cas9、HypaCas9 等［17，60，75，87，96］。中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學(xué)與五邑大學(xué)鄒慶劍研究團隊合作將腺苷脫氨酶或胞苷脫氨酶與轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子融合，并依靠靶向附近的dCas9 打開DNA 雙鏈，開發(fā)了TaC9?ABE 和TaC9?CBE 堿基編輯器。該系統(tǒng)可以消除sgRNA 依賴的脫靶編輯，而不影響靶向編輯效率［24，97］。有研究顯示使用截短的sgRNA 可以在不大幅降低目標(biāo)位點編輯活性的情況下，減少堿基編輯器sgRNA依賴的DNA脫靶編輯［96］，但是也有研究發(fā)現(xiàn)使用截短的sgRNA 會導(dǎo)致堿基編輯器在目標(biāo)位點和脫靶位點的編輯活性均有所降低，并且當(dāng)sgRNA 與DNA 的錯配出現(xiàn)在PAM 遠端時，使用截短的sgRNA 反而會展現(xiàn)出更高的脫靶活性［86］，表明在堿基編輯器中使用截短sgRNA 來提升特異性的方法并不如在Cas9 中適用［98］。而使用5'端添加1～2 個G 的sgRNA 則可以在不降低目標(biāo)位點編輯活性的情況下減少sgRNA 依賴的DNA 脫靶編輯［86］，但也有研究顯示脫靶的減少只在sgRNA 5'端添加2個G的情況下出現(xiàn)［88］。武漢大學(xué)孫宇輝研究團隊［99］通過在sgRNA 的5'端引入氣泡發(fā)夾結(jié)構(gòu)，也可以有效地提升堿基編輯器的編輯特異性。

堿基編輯器所造成的非sgRNA 依賴的DNA 脫靶編輯通常由CBE 引發(fā)，即使在沒有sgRNA 的情況下，CBE 也能引發(fā)一定量的非sgRNA 依賴的DNA 脫靶編輯。而在ABE 的編輯產(chǎn)物中幾乎沒有檢測到此類脫靶編輯，發(fā)生頻率僅接近自發(fā)突變。這些突變主要是C到T的單核苷酸變異，被認(rèn)為是由胞苷脫氨酶和UGI 在整個基因組中長期隨機的反應(yīng)而產(chǎn)生。而DNA 腺苷脫氨酶本身由RNA 腺苷脫氨酶進化而來，與DNA 結(jié)合能力較弱，所以ABE 幾乎不引發(fā)非sgRNA 依賴的DNA 脫靶編輯［89?90，100］。針對這一問題，David R. Liu 研究團隊［18］通過測試， 發(fā)現(xiàn)YE1?BE4、 YE2?BE4、R33A+K34A?BE4 等7 個堿基編輯器均減少了DNA層面的各種脫靶問題，其中YE1與其他Cas變體展現(xiàn)了更好的兼容性，可以高效地編輯更多的位點。Nicole M. Gaudelli 研究團隊［91］從153 個脫氨酶中篩選出4 個脫氨酶變體--PpABOBEC1、RrA3F、AmAPOBEC1和SsAPOBEC3b，由它們所構(gòu)建的堿基編輯器降低了非sgRNA 依賴的脫靶編輯活性，并通過對這些脫氨酶進行工程改造，進一步降低了融合這些脫氨酶的堿基編輯器DNA 和RNA 的脫靶編輯頻率。楊輝研究團隊［101］從23 個理性設(shè)計的CBE 變體中篩選出在目標(biāo)位點保留了高編輯效率，同時引發(fā)極低DNA 和RNA 脫靶編輯和旁觀者編輯的YE1?BE3?FNLS變體。

1.3.4 堿基編輯器造成的RNA 脫靶編輯及優(yōu)化策略

此外，人們還通過RNA 測序，發(fā)現(xiàn)堿基編輯器除了造成DNA 層面的脫靶編輯，還會引起大量的非sgRNA 依賴的RNA 脫靶編輯［19，102?104］，脫靶的原因被認(rèn)為是CBE 和ABE 脫氨酶均具有對RNA脫氨的活性。而RNA 脫靶編輯除了低水平、廣泛而隨機地發(fā)生在內(nèi)源RNA 上，也可能造成對sgRNA 和堿基編輯器mRNA 的編輯，進而可能誘發(fā)DNA 層面脫靶編輯的發(fā)生［19］。針對這些問題，人們通過在脫氨酶中引入突變，構(gòu)建了多種堿基編輯器變體，減少了RNA脫靶編輯的發(fā)生，其中一些突變也減少了DNA脫靶編輯的發(fā)生［19，23，67，91，101?104］。另外，也有研究通過將腺苷脫氨酶嵌合于Cas9 內(nèi)部的特定位點，限制了腺苷脫氨酶的活性，減少了RNA脫靶編輯的發(fā)生［25］。

1.3.5 堿基編輯器特異性優(yōu)化的其他策略

除了蛋白層面的工程改造，也可以通過時空控制減少堿基編輯器的劑量或作用時間來提升堿基編輯器的特異性。堿基編輯器可以通過核糖核蛋白［17?18，23，105?106］、mRNA［61，67，79，107］或逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒［108］的方式遞送到細胞內(nèi)。通過這幾種方式遞送的堿基編輯器在體內(nèi)都更容易被降解，減少了堿基編輯器在體內(nèi)的存在時間，從而減少脫靶編輯發(fā)生的機會。利用anti?CRISPR 蛋白AcrⅡA5 可以有效地抑制Cas9的活性［109］，利用anti?deaminase（Ade）蛋白可以有效地抑制脫氨酶APOBEC3A 的活性［110］，從而減少堿基編輯器的脫靶。通過在sgRNA 中設(shè)計RNA 適體酶（aptamer）來招募脫氨酶編輯可以提升編輯的特異性［111］。此外通過類似于拆分Cas蛋白的方式［112?113］拆分脫氨酶［114］，可以精準(zhǔn)地控制編輯的時間，減少額外編輯的發(fā)生。陳佳研究團隊［115］利用其首次發(fā)現(xiàn)的、具有胞苷脫氨酶抑制作用的胞苷脫氨酶的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域調(diào)控胞苷脫氨酶，開發(fā)了高特異性的堿基編輯器tBEs（transformer base editors）。

2 堿基編輯技術(shù)在微生物合成生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

由于堿基編輯器可以在不引入雙鏈DNA 斷裂的情況下實現(xiàn)堿基的轉(zhuǎn)換，于是人們可以方便地將堿基編輯器應(yīng)用于提前終止密碼子的引入和修復(fù)。如CBE 可以將CAA、CAG、CGA 或TGG 密碼子轉(zhuǎn)換為終止密碼子TAA、TAG 和TGA 來提前終止基因的表達［116?117］，以及通過ABE 將起始密碼子ATG 轉(zhuǎn)變成ACG 擾亂基因翻譯的起始，都可以起到類似基因失活的作用［118］，用于考察基因的功能或定向改造生物代謝途徑。相反，ABE 也可以通過將提前的終止密碼子變成谷氨酰胺（CAA、CAG）或精氨酸（CGA）的密碼子，使提前終止的基因翻譯恢復(fù)正常［119］。在以代謝產(chǎn)物為主要研究目標(biāo)的微生物中，人們對于脫靶所帶來的非預(yù)期后果的容忍度遠高于以人類疾病治療為目標(biāo)的研究。因此，堿基編輯技術(shù)和策略迅速被運用于微生物合成生物學(xué)研究領(lǐng)域，我國科研工作者在許多重要微生物天然產(chǎn)物的生物合成途徑研究及改造中一展身手，也為基因編輯技術(shù)的發(fā)展提供了持續(xù)不斷的驅(qū)動力。例如：

中國科學(xué)院分子植物卓越中心楊晟研究團隊［120］利用其構(gòu)建的適用于梭菌Clostridium beijerinckii的胞嘧啶堿基編輯器pCBEclos?opt，在C. beijerinckiiNCIMB 8052 中使得編碼木糖代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子xylR產(chǎn)生C?G 至T?A 的突變，所獲得的突變株木糖消耗量比野生型菌株高10%。

北京大學(xué)席建中研究團隊通過CBE（dCas9?CDA1?UL）在基因中引入提前的終止密碼子，逐個敲除了紅細菌Rhodobacter sphaeroides2.4.1 中參與抗氧化劑輔酶Q10生物合成的系列基因，揭示了這些基因在合成輔酶Q10過程中的重要性。還通過敲除八氫番茄紅素合酶基因crtB，以及同時敲除crtB和參與光合氧化還原信號調(diào)節(jié)的基因ppsR，將野生型中輔酶Q10的產(chǎn)量分別提高了6% 和39%［121］，向人們展現(xiàn)出了該技術(shù)和策略的實用性。

孫宇輝研究團隊［122］構(gòu)建了適用于鏈霉菌屬的CBE 和ABE，并通過CBE 在Streptomyces avermitilisMA?4680中olm、rpp、pks1、pks4和pks8五個甚至多達九個PKS 基因簇內(nèi)同時引入提前終止密碼子，提高S. avermitilisMA?4680 中阿維菌素的產(chǎn)量。之后，該研究團隊將其開發(fā)的適用于鏈霉菌的堿基編輯器成功應(yīng)用于揭示潮霉素B 的生物合成途徑。他們利用CBE 在Streptomyces hygroscopicussubsp.hygroscopicusDSM 40578 參與潮霉素B 生物合成的五個候選基因內(nèi)引入提前的終止密碼子或突變編碼區(qū)內(nèi)的保守殘基序列使基因失活。結(jié)合體內(nèi)外的實驗證據(jù)揭示了蛋白HygJ、HygL 和HygD 負責(zé)核苷二磷酸庚糖的連續(xù)脫氫、轉(zhuǎn)氨基和轉(zhuǎn)糖基化，HygY 是一種不同尋常、作用于羥基碳的自由基S?腺苷甲硫氨酸依賴的差向異構(gòu)酶，而HygM 是一個在多平行代謝網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用的多功能甲基轉(zhuǎn)移酶。這些工作，特別在多基因同步考察上都展現(xiàn)出了堿基編輯器有別于傳統(tǒng)方法和策略在天然產(chǎn)物生物合成機制研究領(lǐng)域的獨特優(yōu)越性［123］。

中國科技大學(xué)俞漢青研究團隊［124］也在希瓦氏菌Shewanella oneidensisMR?1 中開發(fā)了快速且強大的堿基編輯器pCBEso，并應(yīng)用該工具快速鑒定出S. oneidensisMR?1 內(nèi)參與N?乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）或葡萄糖代謝的關(guān)鍵基因。此外，他們還利用pCBEso 構(gòu)建了具有擴展碳源利用譜的S.oneidensisMR?1 工程菌株，當(dāng)葡萄糖或GlcNAc 成為唯一碳源時，其對多種有機污染物（偶氮染料和有機砷化合物）的降解率高于野生型菌株。

上海交通大學(xué)肖毅研究團隊［125］針對假單胞菌屬的腺嘌呤堿基編輯器開發(fā)了一種基于ABE 的蛋白質(zhì)功能障礙預(yù)測方法DABE?CSP（dysfunctionviaABE through CRISPOR?SIFT prediction），利用該方法，他們發(fā)現(xiàn)了黏康酸（muconic acid）代謝途徑中的基因catB失活或catB和catC同時失活會導(dǎo)致黏康酸的積累，并且后者以100%的產(chǎn)率積累黏康酸。DABE?CSP 方法的建立可以加快對假單胞菌屬物種的研究。

上海師范大學(xué)蘆銀華研究團隊［126］利用其構(gòu)建的胞嘧啶堿基編輯器dCas9?CDA?ULstr，在鏈霉菌Streptomyces rapamycinicus2001 內(nèi)抑制雷帕霉素合成的基因rapS中引入提前終止密碼子，使雷帕霉素產(chǎn)量提高了63.3%。

浙江大學(xué)吳堅平研究團隊［127］利用其構(gòu)建的適用于假單胞菌屬的多重胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng)提高了Pseudomonas putidaKT2440 中兒茶酸的產(chǎn)量。他們利用該系統(tǒng)在原兒茶酸3，4?雙加氧酶的β亞基（PcaH）和丙酮酸激酶（PykA）編碼基因中引入提前終止密碼子，并通過該系統(tǒng)在3?脫氧?2?阿拉伯庚酮糖?7?磷酸合成酶的同工酶AroF?2 內(nèi)引入了不同的點突變（G136E、G136K 和G136R），其中KT2440：：AroF2（G136E）?PJ23119ΔpcaHΔpykA 菌株搖瓶發(fā)酵的兒茶酸產(chǎn)量較AroF?2 未編輯菌株和原始菌株分別增加了69.01%和611.17%。

中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所馬延和研究團隊［128］開發(fā)了基于堿基編輯器的一種多重自動化谷氨酸棒桿菌堿基編輯方法（multiplex automatedCorynebacterium glutamicumbase editing method，MACBETH），并利用MACBETH 產(chǎn)生多重基因失活、用于提高谷氨酸產(chǎn)量的突變株文庫，發(fā)現(xiàn)丙酮酸激酶編碼基因pyk和乳酸脫氫酶編碼基因ldhA雙基因失活菌株可將谷氨酸產(chǎn)量相較野生型提高3 倍。此外，他們通過集成機器人系統(tǒng)實現(xiàn)了MACBETH 的自動化，使該方法能夠每月生成數(shù)千個定向設(shè)計的C. glutamicum代謝工程的菌株。該研究團隊利用自動化平臺構(gòu)建了一個包含94 個轉(zhuǎn)錄因子基因失活的文庫，成功率達到100%，該工作展現(xiàn)了堿基編輯器快速便捷地生成突變菌株庫的能力，成為工業(yè)應(yīng)用中多重自動化細菌基因組編輯的強大工具［128］。隨后該研究團隊利用拓展了PAM序列的Cas蛋白變體（nVQR?Cas9（D10A）、nVRER?Cas9 （D10A）、 nxCas9 3.7 （D10A） 和nCas9?NG（D10A）），替換了MACBETH方法中構(gòu)建的CBE 中的野生型nCas9，拓展了CBE 在C.glutamicum中的編輯范圍，利用nxCas9 3.7（D10A）?AID去除了lysC基因編碼的天冬氨酸激酶產(chǎn)生的反饋抑制，使工程菌株產(chǎn)生1.7 g/L 賴氨酸，而在野生型菌株中，賴氨酸的產(chǎn)量低至幾乎無法檢測［82］。之后，該研究團隊還開發(fā)了一種基于堿基編輯器靶向且無模板的表達調(diào)控方法（base editor?targeted and template?free expression regulation， BETTER）用于在微生物中大規(guī)模微調(diào)基因的表達，它可以在原位生成大量不同的核糖體結(jié)合位點、5'非翻譯區(qū)或啟動子的遺傳組合，并無需合成、轉(zhuǎn)化和整合DNA 供體。他們應(yīng)用BETTER 在模式微生物C.glutamicum和Bacillus subtilis中同時調(diào)節(jié)多達十個基因的表達，以增強宿主的底物攝取或天然產(chǎn)物生物合成，分別獲得改善了木糖分解代謝、甘油分解代謝或番茄紅素生物合成的工程菌株［129］。

江南大學(xué)周哲敏研究團隊［81］構(gòu)建了可以實現(xiàn)體內(nèi)原位蛋白進化的工具CRISPR?CDA?nCas9?UGI，并利用該工具在芽孢桿菌B. subtilis中對影響細胞功能的Sec轉(zhuǎn)位酶進行進化突變，獲得了提升運輸能力的突變株。此外，他們還利用CRISPR?CDA?nCas9?UGI 對抗菌肽抗性決定因子bceB基因進行進化，獲得了對抗菌肽抗性更高的突變株。BceB 蛋白在保護細胞壁生物合成靶點免受抗菌肽的抑制方面發(fā)揮重要作用，桿菌肽抗性突變體的創(chuàng)建對于構(gòu)建產(chǎn)生桿菌肽的細胞工廠具有重要價值［81］。

此外，脫氨酶還可以與隨機結(jié)合DNA 的蛋白融合，設(shè)計成為產(chǎn)生DNA 隨機突變的工具。浙江大學(xué)連佳長研究團隊［130］將不同的非特異性ssDNA 結(jié)合蛋白與胞苷脫氨酶融合，理論上可以實現(xiàn)在酵母菌Saccharomyces cerevisiae全基因組將胞嘧啶替換成胸腺嘧啶的突變。他們利用這些rBE，提高了S. cerevisiae對異丁醇和乙酸鹽的耐受性并增加了產(chǎn)β?胡蘿卜素S. cerevisiae的β?胡蘿卜素產(chǎn)量。他們還使用rBE 對S. cerevisiae基因組進行持續(xù)進化，獲得了對濃度為9%的異丁醇具有抗性的S. cerevisiae細胞。張學(xué)禮研究團隊［131］將DNA 解旋酶與活化誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶（AID）融合形成酶復(fù)合物Helicase?AID，Helicase?AID 可以在細胞內(nèi)整個染色體中隨機引入堿基突變。該研究團隊利用這一工具分別對產(chǎn)β?胡蘿卜素的E. coliKH001 和S. cerevisiae4742crt 進行多輪隨機突變，使得突變株β?胡蘿卜素產(chǎn)量分別增加371.4%和75.4%。

3 展 望

堿基編輯器自問世以來，從最初可以實現(xiàn)目標(biāo)位點編輯窗口內(nèi)C 到T、A 到G 的堿基轉(zhuǎn)換，到之后開發(fā)和優(yōu)化出的堿基變換種類不斷豐富，編輯窗口、靶向位點不斷拓展以及特異性不斷優(yōu)化的新版本，極大地加速了堿基編輯器在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用。然而，堿基編輯器的堿基編輯偏好性，可以靶向編輯的位點和堿基受限，以及脫靶編輯的問題仍有待進一步完善。例如，雖然目前較多的堿基編輯器在編輯窗口上都比早期版本有所拓展，但是堿基編輯器對于單個或少數(shù)堿基的精確編輯仍較難實現(xiàn)，而精確地在基因元件中進行堿基轉(zhuǎn)換對于改造微生物來說也至關(guān)重要。此外，堿基編輯器的脫靶編輯所造成的細菌毒性以及微生物的表型變化也會給微生物代謝途徑改造帶來障礙，雖然目前已報道了一些脫靶效應(yīng)低至與自發(fā)突變水平相當(dāng)?shù)膲A基編輯器，但是這些系統(tǒng)往往包含較多的元件，系統(tǒng)繁復(fù)，效能有限，因此開發(fā)或者尋找到適合微生物的簡便精準(zhǔn)的堿基編輯器還需要合成生物學(xué)研究工作者的不斷努力。同時，還可以通過對以堿基為底物的酶的發(fā)現(xiàn)和改造或是對生物體內(nèi)核酸參與的生化反應(yīng)的深入了解，利用堿基結(jié)構(gòu)的變化或是體內(nèi)不同的核酸修復(fù)途徑，創(chuàng)造更多堿基變換的可能，例如由嘌呤變嘧啶等，將更能拓展堿基編輯器的應(yīng)用場景。

此外，與其他在微生物中使用的基因編輯工具一樣，堿基編輯器也存在著對難以建立遺傳操作的微生物無法遞送外源DNA 的障礙。而由堿基編輯器實現(xiàn)的堿基轉(zhuǎn)變也需要考慮到微生物產(chǎn)生回復(fù)突變的可能性。

堿基編輯器在微生物合成生物學(xué)中的應(yīng)用雖然較CRISPR/Cas 系統(tǒng)的基因編輯有較大優(yōu)勢，但是主要的問題仍舊是堿基編輯所能實現(xiàn)的堿基變換種類較少，雖然可以實現(xiàn)引入提前終止密碼子等，但是對于某些氨基酸密碼子的轉(zhuǎn)變?nèi)詿o能為力。因此創(chuàng)造堿基編輯器更多堿基變換的可能變得尤為重要。

可以相信隨著人們研究的不斷深入，堿基編輯器的性能也將日趨完善，在基礎(chǔ)科學(xué)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更大的作用。