劉晚秋，季向陽，許慧玲，盧屹聰，李健

（上?？萍即髮W物質(zhì)科學與技術(shù)學院，上海 201210）

20 世紀50 年代，研究人員發(fā)現(xiàn)在細菌中存在一套可以切割噬菌體核酸序列，同時能保護自身核酸序列不被切割，從而抵御外源侵染的機制，這套機制包括作用于DNA 特定序列的內(nèi)切酶和識別自身基因組上相同序列而進行甲基化修飾保護的甲基化酶，研究人員將這一機制命名為限制性修飾系統(tǒng)（restriction modification system，RM system），據(jù)此將這一系統(tǒng)中核酸內(nèi)切酶命名為限制性內(nèi)切酶（restriction endonuclease）［1?2］。隨后，研究人員Werner Arber、Daniel Nathans和Hamilton O.Smith深入研究了這類酶的催化機制，發(fā)現(xiàn)其能識別特定的核苷酸序列，并對每條鏈中特定位點的兩個脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵進行切割，這一發(fā)現(xiàn)獲得了1978 年的諾貝爾生理學和醫(yī)學獎［3?5］。在此后的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)這類酶在自然界中廣泛存在，并根據(jù)酶的功能特性、大小及反應(yīng)時所需要的輔因子等將它們分為ClassⅠ～Ⅳ四大類。ClassⅡ類限制性內(nèi)切酶是4類酶中唯一不需要ATP、僅需Mg2+就能實現(xiàn)切割功能的酶，其識別序列多為較短的回文序列，剪切位點通常即為識別序列［6?8］，廣泛應(yīng)用于基因/染色體的結(jié)構(gòu)鑒定和圖譜繪制、基因的遺傳操作以及核酸蛋白相互作用等研究，是生物學研究中必不可少的工具之一［8?12］。

最早期限制性內(nèi)切酶的制備是通過產(chǎn)生菌大量發(fā)酵后經(jīng)過多步生物化學方法分離純化獲得目標酶［4］，步驟煩瑣、技術(shù)要求高、產(chǎn)量低且酶活穩(wěn)定性較差；目前限制性內(nèi)切酶主要通過異源重組表達純化獲得［13?14］。但在異源表達過程中，限制性內(nèi)切酶對特定DNA 序列的切割特性嚴重抑制了宿主的正常生長和重組蛋白的表達。甲基化保護重組表達是限制性內(nèi)切酶制備的主要策略，即共表達甲基化酶或構(gòu)建甲基化酶表達宿主后再表達目標酶，以甲基化酶修飾宿主DNA 中的酶切位點，從而保證宿主的正常生長和目標蛋白的穩(wěn)定表達［15?17］。由于底物識別特異性高，每個限制性內(nèi)切酶都有與之相對應(yīng)的甲基化酶，這使得每一個限制性內(nèi)切酶的制備都需要構(gòu)建相應(yīng)的甲基化酶共表達體系。另一方面，大多數(shù)具有類似催化功能的酶蛋白在氨基酸序列或結(jié)構(gòu)上具有一定的同源性而形成酶蛋白家族，據(jù)此可以進行新成員的挖掘、功能演化等研究，而限制性內(nèi)切酶沒有序列和結(jié)構(gòu)同源的酶蛋白家族，即使具有相似DNA切割活性的限制性內(nèi)切酶，其進化軌跡也相對獨立［18］。這樣“一酶一策略”的原則嚴重限制了此類酶的制備效率及新型限制性內(nèi)切酶的挖掘和應(yīng)用。因此，對限制性內(nèi)切酶的研究亟需一個簡單、普適性高的方法。

近年來，無細胞蛋白合成（cell?free protein synthesis， CFPS）技術(shù)快速發(fā)展，成為蛋白表達的新平臺，也為合成生物學和生物合成研究提供了新手段［19?22］。無細胞蛋白合成的基本原理是將細胞生長與蛋白合成分開進行，首先以最佳生長狀態(tài)的細胞（如微生物）制備出高活性的細胞提取物（包含與蛋白合成相關(guān)的核糖體、輔助因子等活性成分），再向其中添加能量（ATP）再生系統(tǒng)、基因模板（如DNA 或mRNA）以及底物和其他輔助因子等，即可快速合成目標蛋白。與傳統(tǒng)體內(nèi)蛋白表達系統(tǒng)相比，CFPS 體系具有反應(yīng)條件可控、反應(yīng)速率快、蛋白產(chǎn)量高、產(chǎn)物易分離、無細胞毒害作用等諸多優(yōu)點。鑒于以上優(yōu)勢，近年來CFPS 體系已被成功應(yīng)用于合成藥物蛋白、膜蛋白、金屬蛋白和在蛋白中定點引入非天然氨基酸等，顯示了其強大和廣泛的應(yīng)用前景［23?29］。

本研究將CFPS 技術(shù)應(yīng)用于限制性內(nèi)切酶的表達制備。CFPS 技術(shù)將宿主生長和蛋白表達時空分離，因而限制性內(nèi)切酶的無細胞表達過程中不存在細胞毒性的影響，不需要甲基化酶的共表達，同時以線性DNA為表達模板也避免了表達載體構(gòu)建過程中泄露表達對克隆宿主的細胞毒性，將大大簡化限制性內(nèi)切酶的重組表達。本研究中選擇限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ［30］、BamHⅠ［31］和BsaⅠ［32］為研究對象。EcoRⅠ和BamHⅠ分別來自于Escherichia coliRY13和Bacillus amyloliquefaciensH，是典型的ClassⅡ類限制性內(nèi)切酶，也是分子生物學中使用頻率最高的幾個限制性內(nèi)切酶。BsaⅠ來自于Bacillus stearothermophilus6?55，其切割位點位于識別位點之后，切割后產(chǎn)生黏性末端，屬于ClassⅡTypeⅡs限制性內(nèi)切酶，是Golden Gate技術(shù)進行DNA 組裝的必需成員［33］，受限于其制備、研發(fā)技術(shù)和成本，ClassⅡTypeⅡs 類限制性內(nèi)切酶的價格高于其他ClassⅡ類限制性內(nèi)切酶。EcoRⅠ、BamHⅠ和BsaⅠ的無細胞表達可以驗證CFPS 技術(shù)在不同限制性內(nèi)切酶制備研究中的適用性。為此，我們以大腸桿菌無細胞提取物為基礎(chǔ)，以線性DNA 片段為表達模板，經(jīng)過一系列的調(diào)控和優(yōu)化，成功構(gòu)建了限制性內(nèi)切酶的通用型體外表達及制備體系（圖1），實現(xiàn)了ClassⅡ類3 個限制性內(nèi)切酶的體外簡單快速制備。無細胞制備限制性內(nèi)切酶的方法突破了傳統(tǒng)技術(shù)中“一酶一策略”的表達原則，理論上可以適用于所有限制性內(nèi)切酶的表達與制備，將為今后限制性內(nèi)切酶的高效合成、快速發(fā)掘、篩選進化等深入研究和廣泛應(yīng)用提供嶄新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

E. coliDH5α 用于常規(guī)的克隆和質(zhì)粒擴增，E. coliBL21 Star（DE3）用于細胞提取物制備。質(zhì)粒pJL1、pET28a和pSUMO用于無細胞表達線性模板構(gòu)建，pG?KJE8（Takara）用于促進蛋白可溶表達。限制性內(nèi)切酶基因EcoRⅠ（GenBank：AAA26371.1）、BamHⅠ（GenBank：QDF53662）和BsaⅠ（GenBank：AAR96018.1）由蘇州金唯智生物科技有限公司合成并構(gòu)建至質(zhì)粒pUC?GW?Kan 上。本研究所用寡核苷酸引物［由生工生物工程（上海）股份有限公司合成］見表1。

表1 本研究中用到的引物序列Table 1 Oligonucleotide primers used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基和緩沖液

（1）培養(yǎng)基 LB 液體培養(yǎng)基（10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母浸出粉，10 g/L NaCl）用于大腸桿菌的常規(guī)培養(yǎng)；2×YTPG 培養(yǎng)基（16 g/L 胰蛋白胨，10 g/L酵母浸出粉，5 g/L NaCl，3 g/L KH2PO4，7 g/L K2HPO4，18 g/L 葡萄糖，pH 7.2）用于大腸桿菌細胞提取物制備。

（2）緩沖液 S30 緩沖液［10 mmol/L 三異丙基乙磺酰（Tris）?醋酸，14 mmol/L 醋酸鎂，60 mmol/L 醋酸鉀，2 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT），pH 8.2］用于細胞提取物制備；蛋白純化緩沖液（平衡緩沖液：Tris 40 mmol/L，NaCl 500 mmol/L，咪唑0.5 mmol/L，pH 7.5；洗雜緩沖液：Tris 40 mmol/L，NaCl 500 mmol/L，咪唑50 mmol/L，pH 7.5；洗脫緩沖液：Tris 40 mmol/L，NaCl 500 mmol/L，咪唑500 mmol/L，pH 7.5；脫鹽緩沖液：Tris 40 mmol/L，NaCl 500 mmol/L，DTT 1 mmol/L，pH 7.5）用于限制性內(nèi)切酶的純化。

1.1.3 主要試劑和儀器

（1）試劑 蛋白胨和酵母粉（OXOID），瓊脂粉、瓊脂糖、ATP、CTP、GTP、UTP、DTT［生工生物工程（上海）］，DMSO、異丙基?β?D?硫代半乳糖苷（IPTG）、磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、氧化型輔酶Ⅰ（NAD+）（上海阿拉丁生化科技），氨基酸（Sigma），tRNA（Roche），限制性內(nèi)切酶BsaⅠ（NEB），限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、DpnⅠ和BamHⅠ（ThermoFisher Scientific），Phanta Max Super?Fidelity DNA 聚合酶試劑盒、DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、同源重組克隆試劑盒（南京諾唯贊生物科技）。

（2）儀器 PCR 儀、qPCR 儀、核酸與蛋白質(zhì)電泳儀（Bio?Rad），凝膠成像儀（Analytikjena），超聲破碎儀（Qsonica），AKTA 蛋白純化儀（GE），恒溫振蕩儀與微量分光光度計（杭州奧盛）。

1.2 方法

1.2.1 無細胞表達線性模板的構(gòu)建

用于無細胞反應(yīng)的線性模板（linear DNA template，LDT）包括T7 啟動子及其上游序列?融合/純化標簽?目的基因序列?T7 終止子及其下游序列（如圖1）。其中T7 啟動子及其上游序列通過PCR 方法擴增質(zhì)粒pJL1 或pSUMO 獲得，T7 終止子及其下游序列通過擴增質(zhì)粒pJL1 獲得，限制性內(nèi)切酶基因片段通過擴增質(zhì)粒pUC?EcoRⅠ_Kan、pUC?BamHⅠ_Kan 和pUC?BsaⅠ_Kan 獲得，最后通過融合PCR 方法將3 個片段融合構(gòu)建線性表達模板，并保證線性模板中不含有目標限制性內(nèi)切酶的識別位點。融合PCR 反應(yīng)步驟：10 μL Phanta buffer（5×），1 μL dNTPs（10 mmol/L），3 個片段（約100 ng/片段），ddH2O 補齊至47 μL；98 ℃ 30 s預(yù)變性，98 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s/kb，10個循環(huán)，72 ℃ 5 min；引物1/2 各1.5 μL；98 ℃ 30 s預(yù)變性，98 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s/kb，30個循環(huán)，72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收濃縮后備用。

1.2.2 無細胞提取物的制備

以E. coliBL21 Star（DE3）菌株為宿主，活化后挑取單菌落于20 mL 的LB 培養(yǎng)基中，于32 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)；以初始OD600≈0.05的接種量轉(zhuǎn)接至1 L 2×YPTG培養(yǎng)基中，于34 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600≈0.8，添加0.5 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)T7 RNA 聚合酶表達，繼續(xù)培養(yǎng)2.5～3 h 至OD600＞2.5；于4 ℃、5000g離心15 min，收集菌體，用S30 緩沖液重懸洗滌菌體3次，得到菌體。

菌體稱重，1 g 菌體加入1 mL S30 緩沖液，渦旋重懸，得到菌懸液；1.4 mL 菌懸液置于1.5 mL離心管中超聲破碎，破碎程序為：50%功率，10 s超聲10 s 暫停，至能量達到600～620 J；然后于4 ℃、12 000g離心10 min，取上清；上清于4 ℃、10 000g離心10 min，獲得的上清即為細胞提取物。將細胞提取物于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 限制性內(nèi)切酶的無細胞表達和純化

（1）無細胞表達限制性內(nèi)切酶體系為（15 μL）12 mmol/L 谷氨酸鎂，10 mmol/L 谷氨酸銨，130 mmol/L 谷氨酸鉀，1.2 mmol/L 三磷酸腺苷（ATP），0.85 mmol/L三磷酸鳥苷（GTP），0.85 mmol/L三磷酸尿苷（UTP），0.85 mmol/L 三磷酸胞苷（CTP），34 μg/mL亞葉酸，170 μg/mL大腸桿菌tRNA混合物，2 mmol/L 20種必需氨基酸，0.33 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），0.27 mmol/L 輔酶A（CoA），1.5 mmol/L 亞精胺，1 mmol/L 腐胺，4 mmol/L 草酸鈉，33 mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），5 μmol/L 線性表達模板，4 μL 細胞提取物。反應(yīng)體系在1.5 mL 無酶離心管中于30 ℃靜置表達6 h。

（2）產(chǎn)物檢測 反應(yīng)體系不離心樣品為全菌表達蛋白（total，T），反應(yīng)體系于13 000g離心10 min取上清，為可溶表達蛋白（soluble，S）。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測表達情況，其中一抗為6*His?標簽鼠單克隆抗體。

（3）產(chǎn)物純化 等比例擴大無細胞反應(yīng)體系至4 mL，反應(yīng)體系在50 mL 離心管中于30 ℃振蕩（250 r/min）表達6 h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)體系于4 ℃、21 000g離心40 min，取上清，加入等體積的平衡緩沖液，進行Ni?NTA 親和色譜純化（Superflow Agarose，1 mL 預(yù)裝柱，GE），10 mL洗雜緩沖液去除未結(jié)合的雜蛋白，2 mL 洗脫緩沖液洗脫收集目標蛋白，以聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE）檢測純化產(chǎn)物。目標蛋白經(jīng)脫鹽濃縮（超濾管，分子截留10～30 kDa）至1 mL，測定吸光度A280nm計算蛋白濃度。目標蛋白經(jīng)凝膠色譜方法進一步純化（柱型號：Hiload 26/600 superdex 75 pg），以脫鹽緩沖液進行等度洗脫，洗脫后的樣品經(jīng)SDS?PAGE 驗證純度，濃縮后測定280 nm 下的吸光度，結(jié)合目標蛋白的摩爾消光系數(shù)（A1mg/mL280nm）確定最終的蛋白濃度，向蛋白樣品中補充甘油至終濃度為10%，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 限制性內(nèi)切酶的活性檢測

（1）實時酶活檢測 以pJL1?sfGFP質(zhì)粒為基礎(chǔ)，構(gòu)建sfGFP表達盒區(qū)域（T7啟動子至T7終止子區(qū)）含有目標限制性內(nèi)切酶識別位點的質(zhì)粒作為實時酶活檢測底物。在15 μL 無細胞反應(yīng)體系中共表達目標限制性內(nèi)切酶和對應(yīng)的sfGFP質(zhì)粒，以不含限制性內(nèi)切酶表達模板的反應(yīng)為陰性對照，在qPCR儀中反應(yīng)（30 ℃）并實時檢測sfGFP的產(chǎn)量（即熒光信號）。限制性內(nèi)切酶在無細胞體系中成功表達后，有活性的酶蛋白即會識別相應(yīng)酶切位點對底物DNA進行切割，導(dǎo)致sfGFP的表達模板被破壞，使得sfGFP產(chǎn)量不再增加，熒光值趨于平穩(wěn)。反應(yīng)過程中實驗組和對照組sfGFP熒光值的變化即可反映無細胞表達目標限制性內(nèi)切酶的活性。

（2）酶活測定 根據(jù)限制性內(nèi)切酶酶活定義，1 U表示在37 ℃下，總體積為20 μL的反應(yīng)體系中，能夠在1 h內(nèi)消化1 μg的質(zhì)粒DNA（含有1個相應(yīng)限制性內(nèi)切酶位點）所需的酶量。選擇或構(gòu)建含有目標限制性內(nèi)切酶識別序列的質(zhì)粒作為酶活測定底物，以脫鹽緩沖液梯度稀釋成不同濃度的目標限制性內(nèi)切酶為實驗組，以商業(yè)化限制性內(nèi)切酶為陽性對照，反應(yīng)體系為（20 μL）：2 μL 10×Buffer（ThermoFisher Scientific），5 μL 梯度稀釋后目標限制性內(nèi)切酶（陽性對照添加1 μL商業(yè)化酶），1 μg底物質(zhì)粒，ddH2O 補足體系至20 μL。反應(yīng)條件為：37 ℃，1 h。反應(yīng)結(jié)束后取樣進行瓊脂糖核酸電泳，根據(jù)酶切結(jié)果判定目標限制性內(nèi)切酶的比活。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性模板構(gòu)建

基因模板是無細胞蛋白表達最重要的組分之一，研究表明環(huán)狀質(zhì)粒、線性DNA 片段和mRNA序列均可作為模板用于目的蛋白的體外表達，其中質(zhì)粒因其穩(wěn)定性好、制備簡便等優(yōu)點，是CFPS中首選的模板形式。大腸桿菌無細胞表達體系常用的T7啟動子在克隆宿主E. coliDH5α中有一定的泄露表達，而限制性內(nèi)切酶對DNA 序列的切割活性較高，使得T7 系列啟動子的泄露表達足以對宿主細胞造成一定的毒性，從而影響限制性內(nèi)切酶質(zhì)粒模板的構(gòu)建和擴增。因此，本研究選擇線性DNA 片段作為表達模板，可以適用于表達水平或酶切活性有差異的所有限制性內(nèi)切酶。為了提高線性模板在無細胞體系中的穩(wěn)定性，在模板表達盒（expression cassette）上下游各增加約300 bp 序列，以降低無細胞體系中核酸酶對線性模板降解的影響。以限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ為例（LDT?EcoRⅠ），在基因編碼區(qū)N 端添加6*His?tag 作為純化標簽，選擇性添加融合蛋白如SUMO 以促進可溶表達，添加蛋白酶酶切位點如HRV 3C 以去除N 端標簽［示意圖見圖1“（1）線性模板構(gòu)建”］，表達盒內(nèi)所有序列以突變方式優(yōu)化去除EcoRⅠ的酶切位點。

2.2 無細胞表達限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ

EcoRⅠ的無細胞表達基于常用的E. coliBL21 Star（DE3）無細胞提取物。當以線性片段為表達模板時可以獲得大量的目的蛋白，但可溶性較差［不足10%的可溶表達，見圖2（a）］。隨后對表達模板和無細胞體系進行了優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在含有促可溶分子伴侶（DnaK?DnaJ?GrpE，GroES?GroEL，pG?KJE8）的體系中目的蛋白的可溶性有所提高（約30%的可溶表達）。為了進一步提高目的蛋白的可溶表達，選擇融合標簽蛋白SUMO（small ubiquitin?related modifier），SUMO 蛋白來源于真核細胞釀酒酵母翻譯后修飾系統(tǒng)中的Smt3 蛋白，常以N 端融合標簽促進原核生物中目的蛋白的異源表達。SUMO 等泛素蛋白具有快速折疊的結(jié)構(gòu)［34］，快速折疊完成的SUMO 蛋白為C 端融合的目的蛋白提供了折疊成核位點［35?36］，引導(dǎo)并促進目的蛋白的正確折疊，從而提高目的蛋白的可溶表達。SUMO 融合標簽促可溶能力強［37］，且與EcoRⅠ蛋白分子量相差適宜（20 kDa），便于進一步分離純化，因此本部分實驗選用SUMO標簽融合EcoRⅠ在無細胞體系中表達。由于SUMO蛋白編碼序列中包含有一個EcoRⅠ的酶切位點，為避免表達產(chǎn)物對模板的降解，通過同義密碼子優(yōu)化去除此酶切位點（R71，aga→cgt）后構(gòu)建表達模板。結(jié)果表明，以N端融合SUMO標簽的線性片段作為表達模板，在BL21 Star（DE3）無細胞體系中，SUMO?EcoRⅠ可以實現(xiàn)100%的可溶表達［圖2（b）］。

圖2 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ的無細胞制備（Western blot和SDS?PAGE檢測無細胞表達、純化的限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ）CE-cell extract，以BL21 Star （DE3）制備的細胞提取物；CE+ -含有分子伴侶（pG?KJE8）的BL21 Star（DE3）細胞提取物；T-全菌蛋白；S-可溶蛋白；M-蛋白標準樣品；FT-純化上樣穿出液；W-洗雜流出液；Eluate-洗脫液Fig. 2 Cell?free production of restriction endonuclease EcoRⅠ(Western blot and SDS?PAGE analyses of cell?free expressed and purified restriction endonuclease EcoRⅠ)CE-cell extract of BL21 Star (DE3); CE+ -cell extract of BL21 Star (DE3) with chaperone (pG?KJE8); T-total protein;S-soluble protein; M-marker; FT-flow throughout sample; W-washed sample; Eluate-eluted sample

為了檢測無細胞表達EcoRⅠ的產(chǎn)量并進一步驗證其催化活性，將無細胞表達體系由15 μL 擴大至4 mL，并對表達產(chǎn)物進行分離純化。如圖2 所示，經(jīng)親和色譜純化后目的蛋白［SUMO?EcoRⅠ，45.4 kDa，見圖2（c）］濃度約為1 mg/mL（體積為1 mL）。經(jīng)蛋白酶HRV 3C 酶切去除SUMO 標簽后［圖2（d）］，進一步進行凝膠色譜純化，得到最終目的蛋白EcoRⅠ［32.0 kDa，0.54 mg/mL，1 mL，純度約95%，見圖2（e）］。

2.3 無細胞制備限制性內(nèi)切酶的酶活分析

為了驗證無細胞表達的限制性內(nèi)切酶是否有切割DNA 的活性，我們建立了基于無細胞反應(yīng)的實時酶活檢測方法（見1.2.4實時酶活檢測）。以含有EcoRⅠ酶切位點的質(zhì)粒pSUMO?sfGFP_EcoRⅠ為底物（該質(zhì)粒中的SUMO 蛋白編碼區(qū)含有EcoRⅠ酶切位點，未突變），在無細胞體系中共表達sfGFP 和SUMO?EcoRⅠ。如圖3 所示，無細胞反應(yīng)進行約1h 后，陰性對照組中sfGFP 的產(chǎn)量持續(xù)上升，而實驗組由于SUMO?EcoRⅠ積累了一定量的活性蛋白，開始催化切割質(zhì)粒底物，導(dǎo)致表達模板被破壞，sfGFP 的產(chǎn)量上升非常緩慢；反應(yīng)進行6 h 后實驗組sfGFP 的產(chǎn)量趨于平穩(wěn)。這表明無細胞表達的SUMO?EcoRⅠ在30 ℃的無細胞體系中具有切割底物DNA 的活性，SUMO?EcoRⅠ蛋白合成后迅速切割質(zhì)粒底物（1 h 以內(nèi)），隨著SUMO?EcoRⅠ蛋白的積累，底物被徹底切割，sfGFP 的終產(chǎn)量顯著低于對照組。這一實時酶活檢測方法具有反應(yīng)體系?。?5 μL）、操作簡便（無需純化目的酶蛋白）、反應(yīng)條件靈活（如溫度適用23～37 ℃）、響應(yīng)靈敏（3 h 以內(nèi)）、通量高（96 孔板）等優(yōu)勢，將有助于促進限制性內(nèi)切酶的挖掘、改造、進化和活性篩選等方面的研究。

圖3 無細胞體系中限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶活的實時檢測Fig. 3 Real?time catalytic activity detection of restriction endonuclease EcoRⅠ in CFPS system

根據(jù)限制性內(nèi)切酶酶活定義，將無細胞制備的EcoRⅠ進行梯度稀釋為0.54×10-1mg/mL、0.54 ×10-2mg/mL、0.54×10-3mg/mL 和0.54×10-4mg/mL，以空質(zhì)粒pRSFDuet?1（1 μg）為底物，以商業(yè)化EcoRⅠ（ThermoFisher Scientific）為陽性對照進行酶切反應(yīng)。結(jié)果如圖4，無細胞制備的EcoRⅠ可以實現(xiàn)底物DNA 分子的識別和切割，隨著酶濃度的降低，切割活力有所減弱，當酶濃度大于等于0.54×10-2mg/mL 時可以將底物徹底切割消化，酶濃度降低至0.54×10-3mg/mL 時，有少量底物殘余。據(jù)此計算無細胞制備EcoRⅠ的酶活為3.7×105～3.7×106U/mg。

圖4 無細胞制備限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ的酶活測定NC-陰性對照；PC-陽性對照Fig. 4 Catalytic activity determination of cell?free produced restriction endonuclease EcoRⅠNC-negative control; PC-positive control

2.4 無細胞制備限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和BsaⅠ

為了進一步驗證我們構(gòu)建的限制性內(nèi)切酶無細胞制備方法是否適用于更多限制性內(nèi)切酶的表達，又選擇了BamHⅠ和BsaⅠ進行無細胞制備。經(jīng)無細胞體系表達后，結(jié)果顯示，BamHⅠ和BsaⅠ不需要N 端融合促可溶標簽SUMO，也不需要含有促可溶分子伴侶的無細胞提取物，僅帶有簡單的純化標簽6*His?tag，在E. coliBL21 Star（DE3）無細胞體系中即可表達出可溶的目的蛋白［圖5（a）和（d）］。分別以含有相應(yīng)酶切位點的質(zhì)粒pJL1?sfGFP_BamHⅠ和pJL1?sfGFP_BsaⅠ（酶切位點位于T7 啟動子之后）作為底物和線性模板LDT?BamHⅠ和LDT?BsaⅠ共表達，sfGFP 實時熒光檢測結(jié)果表明，無細胞表達的6*His-BamHⅠ和6*His-BsaⅠ在無細胞體系中均有底物切割活性［圖6（c）和（d）］。擴大無細胞體系至4 mL 大量表達，并經(jīng)過親和色譜和凝膠色譜兩步純化后，均獲得正確大小的目的蛋白BamHⅠ（25.4 kDa）0.25 mg/mL（體積為0.5 mL）、BsaⅠ（64.4 kDa）0.45 mg/mL（體積為1 mL）［圖5（b）、（c）、（e）和（f）］。以商業(yè)化酶BamHⅠ（ThermoFisher Scientific）和BsaⅠ（NEB）為陽性對照進行酶活測定，結(jié)果顯示無細胞制備的BamHⅠ和BsaⅠ均有切割底物的活性［圖6（e）和（f）］，酶活分別為BamHⅠ 8.3×102～4.1×103U/mg和BsaⅠ 4.4×105～4.4×106U/mg。其中BamHⅠ的表達量和酶活相對較低，這主要是由于BamHⅠ純化后的產(chǎn)量較低、終濃度較低，需要對BamHⅠ的無細胞表達體系和后續(xù)純化步驟做進一步的調(diào)整優(yōu)化，如改進模板序列組成、提高模板濃度以提高蛋白表達量，優(yōu)化純化方法中的緩沖液組分、凝膠色譜條件等以減少純化過程中的損失，最終提高無細胞制備終產(chǎn)物的產(chǎn)量，提高酶活。

圖5 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和BsaⅠ的無細胞制備（Western blot和SDS?PAGE檢測無細胞表達純化的限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和BsaⅠ）Fig. 5 Cell?free production of restriction endonucleases BamHⅠ and BsaⅠ(Western Blot and SDS?PAGE analyses of cell?free expressed and purified restriction endonucleases BamHⅠ and BsaⅠ)

圖6 無細胞制備限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和BsaⅠ的酶活分析Fig. 6 Catalytic activity assay of cell?free produced restriction endonucleases BamHⅠ and BsaⅠ

綜上，經(jīng)無細胞制備的限制性內(nèi)切酶純度較高（大于95%），產(chǎn)量可達0.03～0.13 mg/mL 無細胞反應(yīng)（32.5～130 mg/L 無細胞反應(yīng)），酶活可達4.1×103～4.4×106U/mg。相較于傳統(tǒng)技術(shù)制備的限制性內(nèi)切酶，如BsaⅠ（產(chǎn)量為0.6～10.2 mg/L 重組表達，酶活為2.5×105U/mg）［16］，SalⅠ（產(chǎn)量為10 mg/L重組表達，酶活為4×106U/mg）［17］，KpnⅠ（產(chǎn)量為1.28×105U/L 重組表達，酶活為1.28×105U/mg）［38］，NcoⅠ（產(chǎn)量為10 mg/L 重組表達，酶活為6×106U/mg）［39］，無細胞方法制備的限制性內(nèi)切酶酶活相當，且產(chǎn)量較高。

3 結(jié) 論

本研究基于無細胞蛋白表達技術(shù)開發(fā)建立了限制性內(nèi)切酶的無細胞制備系統(tǒng)，即利用大腸桿菌無細胞體系進行限制性內(nèi)切酶的體外快速合成、酶活檢測和純化制備。本研究首先對限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ進行了無細胞合成與制備，結(jié)果顯示，在沒有甲基化酶的輔助下，EcoRⅠ可以在無細胞體系中成功表達、純化，并具有酶切DNA活力；隨后將此方法應(yīng)用于另外兩種限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和BsaⅠ，也成功實現(xiàn)了這兩個酶的無細胞制備與活性測定。總的來說，這一限制性內(nèi)切酶的無細胞制備體系具有操作簡單、生產(chǎn)周期短（1～2 天/制備）、蛋白產(chǎn)量高（32.5～130 mg/L無細胞反應(yīng)）、制備效率高（1.3×105～5.7×108U/L無細胞反應(yīng)）等優(yōu)勢，這將對限制性內(nèi)切酶的發(fā)掘、研究、制備和商業(yè)化推廣等方面具有良好的應(yīng)用前景。