郭莉,魏秀麗,王繼芳,吳志敏,蘇婷婷,任榮香,王承華,田麗麗

(新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院 血液內(nèi)科,河南 新鄉(xiāng) 453000)

真性紅細(xì)胞增多癥是一種造血干細(xì)胞克隆性疾病,屬于骨髓增殖性腫瘤范疇,以紅細(xì)胞異常增殖、血容量增高和血液黏滯為主要特征[1]。據(jù)統(tǒng)計,真性紅細(xì)胞增多癥發(fā)病率為(0.4～1.6)/10萬人,且近年來呈不斷升高趨勢,該病起病隱匿、發(fā)展緩慢,極易并發(fā)心肌梗死、心力衰竭等心血管并發(fā)癥,嚴(yán)重威脅患者生命安全[2]。因此,加強(qiáng)對真性紅細(xì)胞增多癥分子水平的研究,尋找可靠的早期診斷分子標(biāo)志物,對預(yù)測其并發(fā)癥發(fā)生有重要意義。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是從蛋白整體水平探討正常與病理?xiàng)l件下蛋白譜表達(dá)差異,具有高通量、高靈敏度、高效率的特性[3]。近年來蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)得到了不斷的發(fā)展和完善,為從蛋白分子角度尋找各種疾病的早期特異性診斷標(biāo)志物與發(fā)病機(jī)制研究提供了新的思路和方法。多項(xiàng)研究顯示,蛋白質(zhì)組學(xué)在血栓形成[4]、急性髓系白血病[5]、遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥[6]等多種血液系統(tǒng)疾病中通過篩選出疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物,為臨床診斷和治療提供數(shù)據(jù)參考。但截至目前,仍然缺乏有效的、可預(yù)測的分子標(biāo)志物來診斷真性紅細(xì)胞增多癥。因此本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探究真性紅細(xì)胞增多癥患者差異表達(dá)的蛋白,為真性紅細(xì)胞增多癥的早期診斷和預(yù)后篩查提供分子病理依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2022年1—12月在新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院就診的40例真性紅細(xì)胞增多癥患者和40例健康志愿者,分別記作疾病組和健康組。疾病組男24例,女16例;年齡30～77(58.06±7.25)歲;病程1～15[8.5(4,10)]a;脾腫大24例,血栓栓塞病史8例;血紅蛋白(haemoglobin,Hb)173～209 (190.26±14.33)g·L-1;紅細(xì)胞比容55.17%～71.69%(64.33±5.24)%。健康組男20例,女20例;年齡33～75(56.53±6.92)歲。兩組患者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.202,P=0.653;t=1.572,P=0.118)。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 選取標(biāo)準(zhǔn)

(1)納入標(biāo)準(zhǔn):①疾病組符合真性紅細(xì)胞增多癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];②健康組均為健康體檢人群;③患者及志愿者年齡≥18歲;④患者及家屬知情同意,并簽署知情同意書。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①繼發(fā)性或相對性紅細(xì)胞增多癥;②伴有其他血液系統(tǒng)疾病;③合并免疫系統(tǒng)疾病;④既往血栓;⑤合并其他惡性腫瘤;⑥有精神疾病不能配合診療。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

ProteoMiner高豐度蛋白質(zhì)去除蛋白質(zhì)濃縮試劑盒(貨號163-3003,購自美國Bio-Rad公司);質(zhì)譜級胰蛋白酶(貨號BTN131029,購自北京百奧萊博科技有限公司);iRT內(nèi)標(biāo)肽試劑盒(貨號Ki-3002-1,購自瑞士Biognosys公司);TGL-20M型臺式高速冷凍離心機(jī)(購自上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司);LC-100型高效液相色譜儀(購自上海伍豐科學(xué)儀器有限公司);Agilent 7850 ICP-MS型質(zhì)譜儀(購自美國Agilent公司)。

1.4 研究方法

1.4.1高效液相色譜-質(zhì)譜分析技術(shù)鑒定篩選出差異表達(dá)蛋白

分別抽取兩組受試者清晨空腹EDTA-K2抗凝靜脈血各5 mL,室溫靜置30 min,4 ℃下以3 000g離心10 min,吸取上層血漿分裝凍存于-80 ℃冰箱待用。通過ProteoMiner蛋白質(zhì)濃縮試劑盒去除上清樣品中的高豐度蛋白獲得低豐度蛋白,用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝膠電泳進(jìn)行蛋白定量和分離,加入人胰蛋白酶裂解成肽段,將樣品加載到對稱C18柱吸附和脫鹽,采用高效液相色譜分析肽段,C18反相分析柱進(jìn)行分離,獲取差異蛋白肽段進(jìn)行后續(xù)的質(zhì)譜分析。使用高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)檢測,質(zhì)譜掃描后使用質(zhì)譜分析軟件Proteome Discoverer 2.5和Mascot 2.6進(jìn)行定量和定性數(shù)據(jù)分析,找出表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(差異倍數(shù)>1.2,P<0.05)的蛋白。

1.4.2差異表達(dá)蛋白的生物信息學(xué)分析

利用Blast2GO軟件對差異表達(dá)蛋白集合進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)(http://www.geneontology.org/)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)(https://www.kegg.jp/)通路富集分析。以P<0.05為閾值,得到有統(tǒng)計學(xué)意義的注釋,進(jìn)而得到差異表達(dá)蛋白在GO類別上的分布信息及其參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

1.4.3差異表達(dá)蛋白的蛋白互作分析

將差異表達(dá)蛋白導(dǎo)入STRING_v11.5在線數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)分析其相互作用的關(guān)系,并將分析得到的結(jié)果導(dǎo)入在線作圖軟件Cytoscape_v3.9.1(https://manual.cytoscape.org/en/3.9.1/)繪制蛋白相互作用分析圖。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)蛋白篩選結(jié)果

所有受試者血漿中共鑒定到871種蛋白,將兩組受試者血漿中蛋白表達(dá)的比值作為兩組間蛋白的差異表達(dá)量,取log2使數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)推算P值,健康組和疾病組受試者血漿中共篩選出34種差異表達(dá)蛋白(差異倍數(shù)>1.2,P<0.05)。與健康組相比較,疾病組患者血漿中有13種蛋白表達(dá)上調(diào),21種蛋白表達(dá)下調(diào),見圖1。其中表達(dá)上調(diào)的前10種蛋白為Hb、血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A,SAA)、Janus激酶(Janus kinase,JAK)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(low density lipoprotein receptor-related protein 1,LRP-1)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子(signaltrans ducerandactivatoroftranscription,STAT)、肌營養(yǎng)不良蛋白關(guān)聯(lián)糖蛋白1(dystrophin-associated glycoprotein 1,DAG1)、6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶(6-phosphogluconolactonase,PGLS)、胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor 1,IGF-1)、免疫球蛋白λ常數(shù)2(immunoglobulin lambda constant 2,IGLC2);表達(dá)下調(diào)的前10種蛋白為促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)、凝血因子Ⅸ(recombinant coagulation factor Ⅸ,F9)、纖維膠凝蛋白3(ficolin 3,FCN3)、核糖體蛋白S27a(ribosomal protein S27a,RPS27A)、胰島素樣生長因子酸不穩(wěn)定亞基(insulin-like growth factor acid-labile subunit,IGFALS)、蘋果酸脫氫酶1(malate dehydrogenase 1,MDH1)、肌球蛋白輕鏈6(myosin light polypeptide 6,MYL6)、正五聚蛋白3(pentraxin 3,PTX3)、免疫球蛋白M重鏈(immunoglobulin M heavy chain,IGHM)、氨肽酶N(aminopeptidase N,ANPEP)。

圖1 健康組和疾病組患者差異表達(dá)蛋白火山圖

2.2 差異表達(dá)蛋白的GO富集分析

兩組差異表達(dá)蛋白的GO功能富集分析結(jié)果顯示,其參與的生物過程(biological process,BP)主要包括中性粒細(xì)胞激活、免疫反應(yīng)、蛋白級聯(lián)激活、氧化應(yīng)激等;細(xì)胞成分(cellular component,CC)主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),其中包括初級溶酶體顆粒、細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、分泌顆粒管腔等;分子功能(molecular function,MF)主要有抗原結(jié)合、肽結(jié)合、糖胺聚糖結(jié)合、過氧化物酶活性等。見圖2。

圖2 差異表達(dá)蛋白的GO功能富集分析

2.3 差異表達(dá)蛋白的KEGG富集分析

KEGG通路富集分析顯示,兩組患者差異表達(dá)蛋白主要參與造血細(xì)胞譜系、JAK/STAT信號通路、細(xì)胞黏附分子、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、膽固醇代謝、谷胱甘肽代謝等生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。見圖3。

圖3 差異表達(dá)蛋白的KEGG通路富集分析

2.4 差異表達(dá)蛋白的互作分析

STRING在線數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示,34種差異表達(dá)蛋白中有23種蛋白與其他蛋白之間無相互作用關(guān)系,其余11種蛋白分別在4種功能網(wǎng)絡(luò)中存在相互作用關(guān)系。其中RPS27A、Hb和JAK蛋白與其他蛋白的相關(guān)度較高。見圖4。

圖4 差異表達(dá)蛋白相互作用分析圖

3 討論

真性紅細(xì)胞增多癥的病因和發(fā)病機(jī)制都不十分明確,目前認(rèn)為可能是基因突變導(dǎo)致紅細(xì)胞異常增殖。引起基因突變的因素包括化學(xué)毒物刺激、電離輻射等[8]。近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,靶向治療的出現(xiàn)為真性紅細(xì)胞增多癥的治療提供了新的方向[9]。因此,探究真性紅細(xì)胞增多癥的蛋白質(zhì)組學(xué)對了解其發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)有重要意義。

本研究中兩組受試者血漿中共篩選出34種差異表達(dá)蛋白。與健康組相比較,疾病組患者血漿中有13種蛋白表達(dá)上調(diào),21種蛋白表達(dá)下調(diào)。其中Hb、SAA、JAK為表達(dá)上調(diào)較高的蛋白,EPO、F9、FCN3為表達(dá)下調(diào)較高的蛋白。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是一種對復(fù)雜樣品中全部蛋白進(jìn)行大規(guī)模修飾定性和定量分析的技術(shù),可綜合分析蛋白的生物學(xué)特性,明確蛋白的功能及其相互作用關(guān)系,并確定蛋白在細(xì)胞中的定位以及翻譯后修飾水平[10]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以系統(tǒng)挖掘疾病的致病機(jī)制,目前已經(jīng)在多種疾病的研究中得到廣泛應(yīng)用。Hb是紅細(xì)胞的主要組成成分,Hb表達(dá)升高提示血液中紅細(xì)胞增多,是真性紅細(xì)胞增多癥的重要病理學(xué)表現(xiàn)[11]。SAA水平的升高提示機(jī)體發(fā)生了急性炎癥損傷,可能參與了炎癥損害時的血栓形成[12]。JAK屬于非受體蛋白酪氨酸激酶家族,其異?；罨蓪?dǎo)致血細(xì)胞增殖失控[13]。EPO是調(diào)控紅系細(xì)胞增殖分化的最主要的細(xì)胞因子,在促進(jìn)血管生成和減少梗死中發(fā)揮重要作用[14]。Meier-Abt等[15]指出,真性紅細(xì)胞增多癥患者紅細(xì)胞計數(shù)增加,引起血液黏滯,F9等凝血因子被消耗,最終導(dǎo)致血栓發(fā)生。FCN3主要分布于血漿中,可通過激活凝集素途徑參與凝血、緩激肽釋放、內(nèi)皮細(xì)胞和血小板活化等過程[16]。Sekiguchi等[17]研究證實(shí)Hb可作為診斷真性紅細(xì)胞增多癥的血漿生物標(biāo)志物,譚怡等[18]研究也證實(shí)了真性紅細(xì)胞增多癥患者血漿中EPO水平明顯降低,EPO可作為真性紅細(xì)胞增多癥病因的預(yù)測標(biāo)志物。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。

本研究中兩組差異表達(dá)蛋白的GO功能富集分析結(jié)果顯示,其主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),通過干預(yù)抗原結(jié)合、肽結(jié)合、糖胺聚糖結(jié)合等MF,參與中性粒細(xì)胞激活、免疫反應(yīng)、蛋白級聯(lián)激活、氧化應(yīng)激等BP,提示上述BP、CC和MF及其富集的蛋白分子在真性紅細(xì)胞增多癥的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。KEGG通路富集分析顯示,兩組患者差異表達(dá)蛋白主要參與的有造血細(xì)胞譜系、JAK/STAT信號通路、細(xì)胞黏附分子等代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,提示差異表達(dá)蛋白可能是通過上述代謝途徑和通路參與調(diào)控真性紅細(xì)胞增多癥的病理進(jìn)程的。真性紅細(xì)胞增多癥是一種典型的骨髓增殖性腫瘤,以紅細(xì)胞增多為主要病理表現(xiàn),同時伴有白細(xì)胞和血小板升高,差異表達(dá)蛋白可能是通過影響造血細(xì)胞譜系的生物學(xué)過程參與真性紅細(xì)胞增多癥的發(fā)生發(fā)展。既往研究顯示,真性紅細(xì)胞增多癥患者多存在JAK2基因V617F突變,該突變可使JAK2蛋白異?；罨?進(jìn)而促進(jìn)JAK2下游STAT磷酸化,造成JAK/STAT信號通路持續(xù)活化,最終導(dǎo)致紅細(xì)胞增殖失控,加劇病情進(jìn)展[19]。血栓是真性紅細(xì)胞增多癥最常見并發(fā)癥,高紅細(xì)胞比容導(dǎo)致血液黏度增加,細(xì)胞黏附分子在該過程中發(fā)揮重要作用[20]。STRING在線數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示,RPS27A、Hb和JAK蛋白與其他蛋白的相關(guān)度較高,提示這3種蛋白可能是診斷真性紅細(xì)胞增多癥的潛在蛋白標(biāo)志物。雖然單一的蛋白差異表達(dá)不可能是真性紅細(xì)胞增多癥的特定指標(biāo),但不同蛋白的綜合差異表達(dá)可能為真性紅細(xì)胞增多癥的診斷和監(jiān)測提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

真性紅細(xì)胞增多癥患者差異表達(dá)蛋白主要富集于造血細(xì)胞譜系、JAK/STAT信號通路、細(xì)胞黏附分子等代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與真性紅細(xì)胞增多癥的發(fā)生發(fā)展,RPS27A、Hb和JAK蛋白可能是診斷真性紅細(xì)胞增多癥的潛在蛋白標(biāo)志物。本研究對真性紅細(xì)胞增多癥患者進(jìn)行了初步的蛋白質(zhì)組學(xué)分析,為進(jìn)一步探索其診斷標(biāo)志物提供了方向。