岳 超, 趙超群, 毛思浩, 王展華, 施 貝, 徐欣豐, 梁晶晶*

(1. 浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院, 國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(功能食品質(zhì)量與安全領(lǐng)域), 浙江省市場(chǎng)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(保健食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室), 浙江 杭州 310052; 2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué), 浙江 杭州 310056)

氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥是一種新型的廣譜殺蟲(chóng)劑和除草劑,有高效、低殘留、持續(xù)期長(zhǎng)等特點(diǎn),在農(nóng)、林、牧業(yè)廣泛應(yīng)用[1,2],但此類(lèi)農(nóng)藥具有致突變、致畸、致癌等作用,且在使用過(guò)程中存在超范圍、超限量使用的可能[3,4],該類(lèi)農(nóng)藥殘留存在的食品安全風(fēng)險(xiǎn)值得注意。氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的測(cè)定研究多集中在植物源食品中[5-10],動(dòng)物源性食品涉及較少。涉及動(dòng)物源性食品的國(guó)標(biāo)[11-14]中,氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的測(cè)定方法多為液相色譜-質(zhì)譜法,凈化方法為固相萃取柱凈化,凈化柱有氨基柱、C18柱、中性氧化鋁柱、凝膠柱等,凈化步驟中包括固相萃取柱活化、洗脫、濃縮、復(fù)溶等步驟,操作復(fù)雜,耗時(shí)長(zhǎng)。且此類(lèi)農(nóng)藥具有種類(lèi)多、極性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性差等特點(diǎn),操作過(guò)程中人為因素引起的誤差大,增加了其準(zhǔn)確定量的難度。QuEChERs和固相萃取法(SPE)近年在農(nóng)殘檢測(cè)中應(yīng)用廣泛[6,7,9,10],其操作靈活、簡(jiǎn)便、快速,但去除脂肪等物質(zhì)能力較弱,凈化效果不理想。

乳制品是居民膳食中的重要部分,近年來(lái)乳制品的質(zhì)量安全引起廣泛關(guān)注。乳品的污染來(lái)源較多,奶牛的飼料、飲用水、生長(zhǎng)環(huán)境,生乳的存儲(chǔ)、加工等環(huán)節(jié)均會(huì)存在農(nóng)藥污染風(fēng)險(xiǎn)。依據(jù)目前的研究報(bào)道可知,飼料[15,16]、土壤[16-18]、地表水[19,20]中均有氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥檢出,其中克百威、甲萘威等檢出率較高。在食物鏈與生物富集作用下,氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥暴露對(duì)人體健康存在風(fēng)險(xiǎn),尤其對(duì)乳品攝入量需求較高的嬰幼兒群體,影響更加深遠(yuǎn)。液體乳類(lèi)中的巴氏殺菌乳、酸乳等,由于加熱溫度低、時(shí)間短,農(nóng)藥受破壞程度低,其農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)更高。目前乳品的質(zhì)量安全研究多集中在獸藥殘留[21-25],農(nóng)藥殘留研究相對(duì)較少,且現(xiàn)有農(nóng)藥殘留分析的報(bào)道多集中在有機(jī)氯、有機(jī)磷、菊酯等[26-28],對(duì)于氨基甲酸酯這類(lèi)新型農(nóng)藥的研究較少,且現(xiàn)有研究主要集中于克百威、滅多威等少量化合物。乳及乳制品中化學(xué)成分復(fù)雜,特別是蛋白質(zhì)、脂肪、磷脂、糖類(lèi)等大分子化合物,在實(shí)際的檢測(cè)過(guò)程中影響此類(lèi)農(nóng)藥殘留物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

增強(qiáng)型基質(zhì)脂質(zhì)去除凈化材料(EMR-Lipid)是一種新型的高聚物吸附劑,此產(chǎn)品通過(guò)空間位阻和親水性的協(xié)同作用,對(duì)C5及以上碳鏈的化合物具有極強(qiáng)的選擇性,去除脂質(zhì)的同時(shí)不吸附目標(biāo)物[29,30],該技術(shù)在動(dòng)物源性食品的獸藥殘留、環(huán)境污染物等方面的檢測(cè)上已得到廣泛應(yīng)用[31-35]。Captiva EMR-Lipid通過(guò)型凈化柱是在EMR-Lipid基礎(chǔ)上升級(jí)成的固相萃取柱,可實(shí)現(xiàn)一步式通過(guò)凈化。與常規(guī)的SPE相比,此凈化柱可實(shí)現(xiàn)提取液直接上柱凈化,操作步驟簡(jiǎn)便、快捷,批量檢驗(yàn)的應(yīng)用前景大。因大部分農(nóng)藥為極性物質(zhì),去除基質(zhì)干擾物質(zhì)時(shí)易造成目標(biāo)物損失,依據(jù)EMR-Lipid材料的凈化特點(diǎn)和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),本研究通過(guò)優(yōu)化供試品提取凈化方式和液相色譜體系,建立了Captiva EMR-Lipid通過(guò)型凈化柱聯(lián)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定液體乳中10種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量的方法,以期為液體乳及乳制品的安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Shimadzu LC-30AD超高效液相色譜儀(日本島津公司)串聯(lián)AB-5500 QTRAP質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子(ESI)源(美國(guó)AB SCIEX公司); Milli-Q Gradient超純水儀(法國(guó)Millipore公司);高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司), XPE-205電子天平(瑞士Mettler公司), 0.22 μm有機(jī)濾膜(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司)。

涕滅威亞砜(aldicarb sulfoxide)、涕滅威砜(aldicarb sulfone)、滅多威(methomyl)、3-羥基克百威(3-hydroxy carbofuran)、涕滅威(aldicarb)、速滅威(metolcarb)、克百威(carbofuran)、甲萘威(carbaryl)、異丙威(isoprocarb)、仲丁威(fenobucarb)標(biāo)準(zhǔn)品均來(lái)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司,質(zhì)量濃度為100 mg/L。實(shí)驗(yàn)用水為超純水,甲醇(MS級(jí),德國(guó)默克公司),甲酸銨、甲酸(MS級(jí),Sigma公司),乙腈、丙酮、正己烷(AR級(jí),國(guó)藥集團(tuán))。Captiva EMR-Lipid柱(200 mg/6 mL, Agilent公司)。

17批試驗(yàn)樣品為市售預(yù)包裝液體乳。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別精密吸取上述10種標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50 mL于10 mL容量瓶中,加甲醇并稀釋至刻度線(xiàn),搖勻,取此稀釋液2.0 mL于10 mL容量瓶中,加甲醇并稀釋至刻度線(xiàn),搖勻,得到質(zhì)量濃度為1000 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以空白基質(zhì)溶液為溶劑,配制得到2～200 μg/L的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 供試品溶液的制備

稱(chēng)取液體乳樣品5 g于25 mL容量瓶中,加乙腈稀釋至刻度線(xiàn)并混合均勻,置于-18 ℃環(huán)境放置15 min,取出后將溶液以10 000 r/min離心5 min,取上清液恢復(fù)至室溫后直接加到Captiva EMR-Lipid柱上,收集后半段流出液適量,過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,待測(cè)。

1.4 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)色譜柱;柱溫35 ℃,流速0.3 mL/min,進(jìn)樣體積2 μL。流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為甲醇;梯度洗脫程序:0.01～1.5 min, 5%B～10%B; 1.5～5 min, 10%B～50%B; 5～8 min, 50%B～60%B; 8～10 min, 60%B～5%B; 10～12 min, 5%B。

1.5 質(zhì)譜條件

ESI源,離子源溫度500 ℃,離子化方式為正離子模式,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式,電噴霧電壓5500 V,霧化氣壓力1.72×105Pa,氣簾氣壓力2.04×105Pa,輔助器壓力1.72×105Pa,其余質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 10種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果和討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用直接進(jìn)樣方式分別取0.1 mg/L的10種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥單一標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源中,在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子全掃描,分別獲得目標(biāo)化合物的分子離子峰。以每種目標(biāo)化合物的準(zhǔn)分子離子峰為母離子,進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,得到碎片離子信息,然后再對(duì)得到的每種目標(biāo)化合物的二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)(如錐孔電壓、碰撞能量等)進(jìn)行優(yōu)化。最后在MRM模式下優(yōu)化離子源溫度、去溶劑氣溫度、流速等質(zhì)譜參數(shù),最終優(yōu)化參數(shù)見(jiàn)表1。

2.1.2液相色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙腈、甲酸銨水溶液、甲酸水溶液分別組合為流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)物色譜峰的分離度和響應(yīng)。結(jié)果顯示,有機(jī)相為甲醇和乙腈均可以實(shí)現(xiàn)10種目標(biāo)物的分離,但是乙腈為有機(jī)相時(shí),涕滅威亞砜色譜峰出現(xiàn)裂縫且拖尾嚴(yán)重。水相中加入甲酸銨和甲酸時(shí),10種目標(biāo)物色譜峰的峰形、響應(yīng)有明顯改善和提高,兩種流動(dòng)相均呈弱酸性,更有利于其得到H變成[M+H]+在正離子模式下檢測(cè),且對(duì)目標(biāo)物的離子化效率無(wú)差別。但甲酸水溶液配制更簡(jiǎn)單,且色譜柱平衡時(shí)間短,實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相。

實(shí)驗(yàn)分別考察了采用Waters Atlantis T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、Agilent Zorbax C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)對(duì)10種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的分離效果。結(jié)果顯示,Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱分離效果好,出峰時(shí)間適宜,因此選擇該柱,相應(yīng)的MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

圖 1 10種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥(50 μg/L)的MRM色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of the 10 carbamate pesticides (50 μg/L)

2.1.3提取溶劑的選擇

氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥為中等極性農(nóng)藥,依據(jù)溶劑的相似相溶原理選擇極性溶劑提取。樣品中脂肪和蛋白質(zhì)的去除是凈化的關(guān)鍵步驟。實(shí)驗(yàn)考察了乙腈、丙酮、正己烷、甲醇為提取溶劑時(shí)沉淀蛋白質(zhì)的效果,觀察相同條件下靜置后上清液的渾濁程度和通過(guò)微孔濾膜的難易程度,評(píng)價(jià)沉淀蛋白質(zhì)的效果。結(jié)果顯示,沉淀效果乙腈>丙酮>甲醇>正己烷,考慮提取液后續(xù)進(jìn)入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定,乙腈和甲醇溶劑更適用于檢測(cè)系統(tǒng)。相較于甲醇,乙腈沉降蛋白質(zhì)的效果更好,對(duì)不同極性目標(biāo)物的提取效果更好,且對(duì)有機(jī)酸、糖、維生素等物質(zhì)的溶解性低,萃取出的脂類(lèi)雜質(zhì)少[35,36]。實(shí)驗(yàn)同時(shí)比較了室溫和-20 ℃條件下放置15 min時(shí)沉淀蛋白質(zhì)的效果,可知低溫更有利于蛋白質(zhì)的沉淀。實(shí)驗(yàn)最終選擇乙腈為提取溶劑,低溫條件下沉淀蛋白質(zhì)。

移取待測(cè)樣品5 mL(為方便,條件考察時(shí)量取體積),分別添加5、10、15、20、25、30 mL乙腈,考察不同體積乙腈提取液的提取和凈化效果,以10種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率結(jié)果為評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果顯示乙腈添加量為5 mL和10 mL時(shí),蛋白質(zhì)沉淀效果差,影響凈化液流出速度和加標(biāo)回收率結(jié)果;加入15 mL及以上時(shí),提取凈化效果最優(yōu)。綜合凈化柱填料的適用性、方法檢出限要求、待測(cè)樣品的基質(zhì)效應(yīng)等因素考慮,實(shí)驗(yàn)選擇加入約20 mL乙腈(乙腈體積占比約80%),即5 g樣品用乙腈定容至25 mL。

2.1.4凈化柱的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了Captiva EMR-Lipid柱和氨基(NH2)柱(200 mg/6 mL, Waters公司)、ENVITM-18 SPE柱(200 mg/6 mL, Supelclean公司)的凈化效果,以10種目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率結(jié)果為考察指標(biāo),結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖 2 不同凈化柱對(duì)10種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥回收率的影響(n=6)Fig. 2 Effects of different purification columns on the recoveries of the 10 carbamate pesticides (n=6)

氨基柱:吸取上清液5 mL, 40 ℃下氮?dú)獯蹈?加入5 mL二氯甲烷-甲醇(99∶1, v/v)溶解。溶解液上柱,上樣液流出近干后,使用20 mL二氯甲烷-甲醇(99∶1, v/v)洗脫,全部洗脫液于40 ℃下氮?dú)獯蹈?加1 mL乙腈溶解,過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,待測(cè)。

ENVITM-18 SPE柱:吸取上清液5 mL, 40 ℃下氮?dú)獯蹈?加入5 mL甲醇溶解。溶解液加在事先活化的ENVITMTM-18 SPE柱上,樣液流出近干后,加20 mL甲醇溶液洗脫,全部洗脫液于40 ℃下氮?dú)獯蹈?加1 mL乙腈溶解,過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,待測(cè)。

Captiva EMR-Lipid柱:上清液直接上柱,收集后半段流出液適量,過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,待測(cè)。

結(jié)果顯示:經(jīng)過(guò)Captiva EMR-Lipid柱凈化后,目標(biāo)物的回收率結(jié)果均>70%;氨基柱凈化后涕滅威及其代謝物的回收率低,考慮可能原因是氨基柱對(duì)極性較強(qiáng)的氨基甲酸酯類(lèi)物質(zhì)的吸附力強(qiáng),無(wú)法完全洗脫,導(dǎo)致目標(biāo)化合物在凈化過(guò)程中流失;對(duì)于極性較弱的異丙威、仲丁威物質(zhì),氨基柱(101%)和ENVITM-18 SPE柱(94.5%)的加標(biāo)回收率結(jié)果均優(yōu)于Captiva EMR-Lipid柱(86.5%),但Captiva EMR-Lipid柱操作簡(jiǎn)便,其回收率結(jié)果的SD范圍小。綜上,Captiva EMR-Lipid柱凈化效果可以達(dá)到國(guó)標(biāo)方法的凈化要求,且更適用于極性較強(qiáng)的涕滅威類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè),操作過(guò)程簡(jiǎn)便,結(jié)果重復(fù)性好。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

用初始比例流動(dòng)相溶液配制20 μg/L的10種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液,用空白基質(zhì)溶液配制20 μg/L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以?xún)烧邔?duì)應(yīng)氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的峰面積比值乘以100%作為基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)估值[37-39]。結(jié)果顯示,不同氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)為35.7%～67.5%,存在中等和強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。因此,實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),以降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)化合物定量的影響。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線(xiàn)性范圍、檢出限和定量限

將1.2節(jié)配制的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣測(cè)定,以10種目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。采用空白基質(zhì)加標(biāo)并逐級(jí)稀釋的方式進(jìn)行檢出限(LOD)和定量限(LOQ)的測(cè)定。以信噪比(S/N)≥3確定10種農(nóng)藥的檢出限,以S/N≥10確定10種農(nóng)藥的定量限。10種農(nóng)藥的線(xiàn)性范圍、校準(zhǔn)曲線(xiàn)方程、相關(guān)系數(shù)、LOD和LOQ結(jié)果見(jiàn)表2。相關(guān)系數(shù)均在0.999以上。

與使用質(zhì)譜方法檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相比較,本研究建立方法的檢出限和定量限結(jié)果均滿(mǎn)足現(xiàn)有國(guó)標(biāo)要求。GB 23200.90-2016中10種目標(biāo)物的定量限均為0.01 mg/kg, GB 31658.10-2021中10種目標(biāo)物的檢出限為0.5 μg/kg,定量限為1.0 μg/kg。

表2 10種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的線(xiàn)性關(guān)系、檢出限及定量限

2.3.2加標(biāo)回收率和精密度

采用不含待測(cè)物的空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn),加標(biāo)水平設(shè)置為3個(gè),每個(gè)添加水平做6次平行,考察該方法的準(zhǔn)確度和精密度,結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明,本方法中10種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的回收率為68.7%～93.3%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.8%～8.0%。表明該方法滿(mǎn)足分析要求,可用于10種氨基甲酸類(lèi)農(nóng)藥殘留量的準(zhǔn)確定性和定量。

表3 10種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的加標(biāo)回收率和RSD(n=6)

2.4 樣品的測(cè)定

采用本研究建立的方法,對(duì)17批市售液體乳進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示均未檢出10種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)優(yōu)化提取方法和流動(dòng)相體系,建立了應(yīng)用Captiva EMR-Lipid直接通過(guò)式凈化方法聯(lián)合UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定液體乳中10種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的定性定量方法。該法快速高效、準(zhǔn)確度好,靈敏度高,重復(fù)性好,可滿(mǎn)足日常大批量檢測(cè)的需求,適用于液體乳中10種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的快速測(cè)定。同時(shí)為動(dòng)物源食品中氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的測(cè)定提供新思路。