劉 宇, 邢家溧, 沈 堅, 畢曉麗, 毛玲燕, 徐曉蓉, 張書芬, 婁永江*, 吳 希, 穆應花

(1. 寧波大學食品與藥學學院, 浙江 寧波 315211; 2. 寧波市產(chǎn)品食品質(zhì)量檢驗研究院(寧波市纖維檢驗所), 浙江 寧波 315048)

糖(sugar)主要由C、H、O 3種元素組成,是多羥基醛或多羥基酮及其縮聚物和某些衍生物的總稱,被廣泛應用于食品甜味劑來提升甜度和風味。目前,市場上常見的甜味劑為蔗糖、葡萄糖和人工甜味劑等[1]。然而過量攝入甜味劑會引發(fā)多種健康問題,例如2型糖尿病、肥胖癥和心血管疾病[2,3]。而且人工甜味劑的安全性目前存在一定爭議[4]。因此,為了減少糖和人工甜味劑的消耗,稀有糖得到越來越多的關注。

稀有糖被定義為自然界中少量存在的單糖及其衍生物[5]。大量研究報道了稀有糖的有益功能[6-8],例如不引起齲齒、減輕體重、控制血糖等。近年來,赤蘚糖醇和甘露糖醇在全球范圍內(nèi)代糖銷售市場火熱[9],阿洛酮糖和塔格糖作為新型糖類成為最有前途的蔗糖替代品[10],異麥芽酮糖和海藻糖是廣泛研究的稀有二糖[11],國外相關機構已將這6種稀有糖視為功能性甜味劑,允許加入食品中。然而,以下原因造成了稀有糖的食品安全問題:(1)食品添加劑聯(lián)合專家委員會(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives)、美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration)、歐盟(European Union)和澳新食品標準局(Food Standards Australia New Zealand)都未指定這6種稀有糖每日可接受攝入量(acceptable daily intake, ADI)[12,13]。(2)需要大量添加或復合添加稀有糖才能達到一定的甜度[14-16],這可能會引發(fā)過量食用稀有糖導致胃腸道反應(如腹瀉、飽脹)并擾亂血糖水平[17]。部分食品廠商用廉價或無營養(yǎng)價值的非糖類物質(zhì)(玉米淀粉、麥芽糊精等)或含有雜質(zhì)的低質(zhì)量工業(yè)糖來摻假添加,夸大宣傳其功效來誤導消費者購買[18]。(3)這6種稀有糖同時檢測的方法尚未成熟。因此,為了安全合理地使用稀有糖,亟須開發(fā)一種高效、靈敏,且可以同時檢測分析食品中6種稀有糖的檢測方法。

常見的糖類分析檢測方法有氣相色譜法(GC)[19]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[20]、毛細管電泳法(CE)[21]、高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD)[22]和高效液相色譜(HPLC)聯(lián)用不同檢測器的方法,如質(zhì)譜(MS)[23]、紫外檢測器(UV)[24]、示差折光檢測器(RI)[25]、蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)[26]。GC和GC-MS需要衍生化,步驟復雜、耗時。CE可以快速分析塔格糖[27],然而沒有關于其他稀有糖的檢測報道。HPAEC-PAD使用氫氧化物水溶液作為流動相會引起穩(wěn)定性問題。此外,基于HPLC分離系統(tǒng),MS儀器昂貴,前處理涉及復雜的衍生化過程。由于糖類無發(fā)色團,UV分析受到限制。相比之下,RI和ELSD已被廣泛應用于分析食品中的糖,無需衍生化即可進行快速分析[26,28]。然而,RI檢測器不兼容梯度洗脫,靈敏度易受溫度影響。ELSD不存在上述這些情況,要求流動相必須有良好的揮發(fā)性。目前,尚無采用HPLC-ELSD對6種稀有糖進行同時檢測的相關報道。

因此,在這項研究中,開發(fā)了一種新穎的HPLC-ELSD方法,經(jīng)過方法優(yōu)化可以在25 min內(nèi)快速同時準確定性定量分離固態(tài)食品中6種稀有糖,也為我國食品中制定稀有糖檢測方法標準和限量標準提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀和蒸發(fā)光散射檢測器(美國Agilent公司); ME-204電子分析天平(精度為0.000 1 g,上海梅特勒-托利多儀器有限公司); X1R高速離心機(美國Thermo公司); Vortex 3自動漩渦混合器、IKA-Vortex 2多功能渦旋混合器(德國IKA公司);一次性無菌注射器(上海金塔醫(yī)用器材有限公司); Milli-Q Academic超純水儀(電阻率為18.2 MΩ·cm,美國Millipore公司); KS-300EI超聲波清洗儀(寧波科生超聲設備有限公司); GFAM00140移液槍(法國GILSON公司); 0.22 μm濾膜(美國Waters公司)。

阿洛酮糖(allulose,純度>98%)、塔格糖(tagatose,純度>98%)、海藻糖(trehalose,純度>98%)、異麥芽酮糖(isomaltulose,純度>98%)、赤蘚糖醇(erythritol,純度>98%)、甘露糖醇(mannitol,純度>98%), HPLC級,均購自上海麥克林生化科技股份有限公司。

乙腈(HPLC級,純度>99.9%)購自上海安譜實驗科技股份有限公司;乙酸鋅(C4H6O4Zn·2H2O)、亞鐵氰化鉀(K4Fe(CN)6·3H2O)(均為分析純)購自上海默克化工技術有限公司。

實驗用固態(tài)食品:面包、口香糖、巧克力、餅干、糖果均購自網(wǎng)絡,藕粉購自寧波大型超市。

1.2 溶液配制

標準儲備液:分別準確稱取各種稀有糖標準品各0.1 g(精確至0.000 1 g)于10 mL容量瓶中,用超純水定容至刻度,配合超聲加速溶解,配制成各質(zhì)量濃度為10 mg/mL的標準儲備液;分別吸取阿洛酮糖、塔格糖、赤蘚糖醇200 μL,甘露糖醇300 μL,異麥芽酮糖、海藻糖600 μL于10 mL容量瓶中,用超純水定容至刻度,轉(zhuǎn)移至10 mL棕色進樣瓶中,得到含有不同濃度的混合標準儲備液,密封后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

標準工作液:用超純水將混合標準儲備液逐級稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0.03、0.06、0.08、0.10、0.12、0.15、0.20 mg/mL的6種稀有糖的混合標準工作液。

乙酸鋅溶液(0.219 g/mL):稱取乙酸鋅21.9 g,加冰醋酸3 mL,加水溶解并稀釋至100 mL。

亞鐵氰化鉀溶液(0.106 g/mL):稱取亞鐵氰化鉀10.6 g,加水溶解并稀釋至100 mL。

1.3 樣品前處理

稱取0.5 g樣品至50 mL螺口尖底離心管中,加入25 mL水(樣品處理用水為一級水),振蕩渦旋10 min,分別加入200 μL的乙酸鋅溶液和200 μL的亞鐵氰化鉀溶液,用水定容至刻度,充分搖勻,4 500 r/min離心10 min,移取上清液1 mL,過0.22 μm水相濾膜,待HPLC-ELSD分析。

1.4 分析條件

色譜條件:Zorbax Original NH2色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,美國Agilent公司);柱溫為35 ℃;流動相:乙腈-水(80∶20, v/v);進樣體積20 μL;流速梯度洗脫程序:0～15 min, 1.0 mL/min; 15～18 min, 1.0～2.0 mL/min; 18～25 min, 2.0 mL/min; 15～25 min, 2.0 mL/min。

ELSD條件:漂移管溫度為50 ℃,霧化器流速為1.0 mL/min(載氣為高純氮),載氣壓力為275.79 kPa,增益值為3。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25統(tǒng)計軟件進行相關性分析和數(shù)據(jù)處理,采用Origin 2022b和Microsoft Excel進行圖表繪制。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1提取劑類別的優(yōu)化

不同提取劑會影響稀有糖的提取效果。為了確定提取劑,本實驗比較了水、乙腈和不同體積分數(shù)(80%、60%、40%和20%)的乙腈水溶液對6種稀有糖提取效果的影響。結果表明,對比乙腈水溶液和乙腈,水對稀有糖的提取效果最顯著(圖1),6種稀有糖的回收率(94.6%～101.4%)明顯提升,這與Georgelis等[29]的研究結果一致,故選擇水作提取劑。

圖 1 不同提取劑對6種稀有糖回收率的影響(n=6)Fig. 1 Effect of different extractants on the recoveries of the six rare sugars (n=6)

2.1.2凈化劑用量的優(yōu)化

固態(tài)食品中有蛋白質(zhì)、明膠、脂肪等物質(zhì),未經(jīng)凈化劑處理直接進樣會影響稀有糖的檢測分析。因此本實驗參考GB 5009.8-2016《食品安全國家標準食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》[30]將乙酸鋅和亞鐵氰化鉀作為凈化劑。同時,考察了乙酸鋅和亞鐵氰化鉀各自的用量(100～300 μL,添加時兩者的用量為等量)對6種稀有糖回收率的影響。由圖2可以看出,乙酸鋅和亞鐵氰化鉀各為200 μL時,稀有糖的回收率相對較高(97.41%～101.4%),故乙酸鋅和亞鐵氰化鉀用量確定為200 μL。

圖 2 不同用量的凈化劑對6種稀有糖回收率的影響(n=6)Fig. 2 Effect of different amounts of purifying agents on the recoveries of the six rare sugars (n=6)

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1色譜條件的優(yōu)化

檢測糖類常用的檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器[31]和示差折光檢測器[32],但示差折光檢測器極易受溫度影響,且不適用于梯度洗脫。蒸發(fā)光散射檢測器受溫度影響小,基線穩(wěn)定,靈敏度高,可以結合梯度洗脫,因此在稀有糖檢測分析中選擇了蒸發(fā)光散射檢測器。

分別選擇不同比例(85∶15、80∶20和75∶25)的乙腈-水作為流動相,比較3個流動相比例對分離效果的影響。結果發(fā)現(xiàn),水的比例增加會縮短保留時間,但是基線噪聲比較大;乙腈的比例增加會增加保留時間。因此,本實驗選擇乙腈-水(80∶20, v/v)作為流動相。

取質(zhì)量濃度均為0.1 mg/mL的6種稀有糖混合標準溶液,在保持濃度、柱溫、進樣量等參數(shù)一致的條件下,比較Agilent Zorbax Original NH2(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和ChromCore HILIC-Amide(250 mm×4.6 mm, 5 μm)這2種色譜柱對6種稀有糖的分離效果。結果顯示,NH2柱分離效果優(yōu)于Amide柱,這是由于NH2柱與不同糖分子所形成氫鍵的結合力強弱不同,在分離時更具有優(yōu)勢[33],因此選擇NH2柱作為分析柱。同時優(yōu)化柱溫和流速梯度洗脫程序,確定柱溫為35 ℃;確定的洗脫程序見1.4節(jié)。

2.2.2ELSD的優(yōu)化

ELSD最關鍵的兩個參數(shù)是漂移管溫度和霧化器載氣流速[34]。霧化器載氣流速決定了霧化過程中形成的液滴大小,從而影響檢測器的信噪比(signal to noise ratio,S/N)[33]。漂移管溫度影響檢測器的響應,隨著溫度的升高,流動相蒸發(fā)趨于完全,響應會更好,但過高或過低的溫度會降低S/N[35]?？紤]到洗脫液揮發(fā)性、流速、霧化器載氣流速以及分析物揮發(fā)性等對稀有糖檢測結果的影響,合理設置漂移管溫度可以有效提高分析結果的靈敏度。霧化器載氣流速和漂移管溫度幾乎不影響稀有糖的保留時間。因此,在其他參數(shù)一致的條件下,先固定載氣流速為1.2 mL/min,對6組漂移管溫度(30、40、50、60、70和80 ℃)進行考察;篩選出最佳漂移管溫度后對4組載氣流速(1.0、1.2、1.4和1.6 mL/min)進行考察,結果如圖3顯示。

圖 3 不同漂移管溫度和載氣流速對6種稀有糖響應的影響(n=3)Fig. 3 Effect of different drift tube temperatures and carrier gas flow rates on the response of the six rare sugars (n=3)

優(yōu)化漂移管溫度時,赤蘚糖醇、異麥芽酮糖和海藻糖的響應變化明顯(P<0.05),對比其他5組,50 ℃時,赤蘚糖醇、異麥芽酮糖和海藻糖(496.82、452.70和446.66 mV)的響應明顯上升;其余3種稀有糖的響應變化不明顯的可能原因是它們的揮發(fā)性小,對溫度不敏感。優(yōu)化載氣流速時,阿洛酮糖、塔格糖、甘露糖醇和海藻糖的響應變化明顯(P<0.05),對比其他3組,在1.0 mL/min時4種稀有糖(280.35、313.51、425.44和446.01 mV)的響應明顯最好;赤蘚糖醇和異麥芽酮糖的響應不隨載氣流速變化的可能原因是1.0 mL/min的載氣流速已經(jīng)足夠使這兩種稀有糖產(chǎn)生的液滴大小達到最大,增加載氣流速不會對液滴大小產(chǎn)生顯著影響。赤蘚糖醇和甘露糖醇響應的變化也與丁洪流等[33]研究一致:適宜的漂移管溫度和載氣流速有利于提高赤蘚糖醇和甘露糖醇的響應。因此,最終確定漂移管溫度為50 ℃,霧化器載氣流速為1.0 mL/min。在最優(yōu)條件下得到的6種稀有糖色譜圖見圖4,顯示6種稀有糖在25 min內(nèi)能夠有效分離,分離度均大于1.5,可達到分析要求。

2.3 方法學驗證

2.3.1線性范圍、檢出限及定量限

以超純水為溶劑,配制質(zhì)量濃度范圍為0.06～0.6 mg/mL的6種稀有糖混合標準溶液直接進樣檢測。以稀有糖峰面積(Y)為縱坐標,質(zhì)量濃度為橫坐標(X, mg/mL),繪制校準曲線(表1)。結果顯示,6種稀有糖的線性關系良好,決定系數(shù)(R2)均>0.998 5,以S/N=3和S/N=10分別確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),分別為0.20～0.60 g/100 g和0.60～1.8 g/100 g。

表 1 6種稀有糖的線性范圍、回歸方程、決定系數(shù)、檢出限及定量限

圖 4 6種稀有糖混合標準溶液的色譜圖Fig. 4 Chromatogram of the six rare sugars in the mixed standard solution 1. erythritol; 2. allulose; 3. tagatose; 4. mannitol; 5. isomaltulose; 6. trehalose.

2.3.2加標回收率與精密度

在進行加標回收試驗前,對空白固態(tài)食品進行分析,確保不含任何干擾成分。同時,通過比較混合標準溶液、空白基質(zhì)溶液和空白基質(zhì)加標溶液的色譜圖(見圖5),評估方法是否受到樣品基質(zhì)的干擾。

圖 5 混合標準溶液、空白基質(zhì)溶液和空白基質(zhì)加標溶液的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of mixed standard, blank matrix and spiked blank matrix solutions 1. erythritol; 2. allulose; 3. tagatose; 4. mannitol; 5. isomaltulose; 6. trehalose.

以空白餅干樣品為基質(zhì),按1.3節(jié)處理,分別添加低、中、高3個不同水平的混合標準溶液進行測定。每個水平重復測定6次,計算平均回收率和相對標準偏差(RSD)來評估方法的準確性和精密度。結果如表2所示,6種稀有糖的平均加標回收率為92.6%～103.2%, RSD為0.7%～4.4%,表明該方法性能良好,能夠滿足實際樣品檢測要求。

表 2 6種稀有糖的加標回收率和精密度(n=6)

2.3.3干擾試驗

為了防止固態(tài)食品自身可能含有的糖和人工甜味劑干擾實驗結果,從而出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。因此,實驗對配制的包含6種稀有糖、5種常見糖(葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖)和3種人工甜味劑(三氯蔗糖、阿斯巴甜、甜蜜素)的混合溶液進行分析。如圖6所示,其中4種常見糖可與本文分析的6種稀有糖基線分離,其余1種常見糖及3種人工甜味劑未出峰,說明常見的5種糖和人工甜味劑對本方法均無任何干擾。

圖 6 干擾試驗色譜圖Fig. 6 Chromatogram for interference experiments 1. erythritol; 2. allulose; 3. tagatose; 4. mannitol; 5. isomaltulose; 6. trehalose; Fru: fructose; Glu: glucose; Suc: sucrose; Lac: lactose.

2.4 與其他方法的比較

本研究與近年使用HPLC-ELSD測定同種稀有糖的方法進行了簡單對比(表3)。結果顯示,本研究對比其他文獻涉及的稀有糖種類新穎,數(shù)量較多,在前處理方面對比劉文全[37]檢測飲料中的阿洛酮糖和Koh等[31]檢測固態(tài)食品中的赤蘚糖醇和甘露糖醇,操作簡單、省時。同時與其他文獻相比,阿洛酮糖、赤蘚糖醇和甘露糖醇具有較低的檢出限。

表 3 與其他文獻方法的比較

2.5 實際樣品的檢測

應用本實驗建立的方法對購買的面包、巧克力、口香糖、餅干、糖果、藕粉6類標簽中標注含稀有糖的固態(tài)食品樣品進行檢測,每份樣品平行測定3次。典型固態(tài)食品的色譜圖見圖7。

圖 7 典型固態(tài)食品的色譜圖Fig. 7 Chromatograms of typical solid foods

結果顯示,巧克力、餅干和糖果含有10.9～29.5 g/100 g(RSD為0.1%～1.2%)的稀有糖,含糖量為10.9%～29.5%;面包、口香糖和藕粉含有1.2～9.4 g/100 g(RSD為0.3%～1.7%)的稀有糖,含糖量為1.2%～9.4%。其中甘露糖醇在口香糖的含量與Koh等[31]研究的含量在同一量級。檢出的稀有糖符合樣品標簽中標注的稀有糖。證明了該方法可以用來同時分析固態(tài)食品中的稀有糖。

3 結論

本研究成功建立了一種能夠在25 min內(nèi)完全分離6種稀有糖的HPLC-ELSD方法。通過對實際樣品的檢測分析,發(fā)現(xiàn)固態(tài)食品標簽中聲明的稀有糖與實際成分基本一致。然而,部分固態(tài)食品中的稀有糖含量超過10%,食用后可能導致胃腸道反應。因此,我們建議在商品標簽中明確標示稀有糖的含量及可能出現(xiàn)的健康問題,從而向消費者提供準確的信息去選擇合適的商品。該方法為固態(tài)食品中稀有糖的準確分析提供了可靠的手段,也為糖類食品的質(zhì)量控制和安全評價提供了科學依據(jù)。