宋欣樵, 郭澤華, 劉偉文, 查根晗, 樊柳蔭, 曹成喜*, 張 強(qiáng)*

(1. 上海交通大學(xué)電子信息與電氣工程學(xué)院, 上海 200240; 2. 上海交通大學(xué)學(xué)生創(chuàng)新中心, 上海 200240)

基于移動反應(yīng)界面(moving reaction boundary, MRB)[1,2]的電泳滴定(electrophoresis titration, ET)[3,4]可以實現(xiàn)將檢測物質(zhì)的濃度信號轉(zhuǎn)化為距離信號,以檢測不同的生化標(biāo)志物,如有機(jī)小分子[5-7]、核酸[8]、蛋白質(zhì)[9-11]等。經(jīng)典的MRB技術(shù)利用酸堿指示劑或有色化合物將電泳過程中的反應(yīng)界面以有色界面的形式呈現(xiàn),實現(xiàn)對低濃度目標(biāo)物含量的可視檢測,但其依賴于穩(wěn)定的高壓電源及大型且昂貴的檢測設(shè)備[12-16],難以應(yīng)用于現(xiàn)場即時檢測(point of care testing, POCT)。

為了解決上述問題,需要進(jìn)一步推進(jìn)ET裝置的小型化與便攜化。Wang等[9-11]開發(fā)了基于ET芯片的電泳滴定方法,首次將可視化的電泳滴定應(yīng)用于蛋白檢測。Li等[6]實現(xiàn)了三聚氰胺的ET檢測方法,用于檢測乳制品中摻雜的三聚氰胺。Khan等[5]提出了基于ET芯片的尿酸(uric acid, UA)檢測方法,通過尿酸酶催化反應(yīng)實現(xiàn)了UA的可視化檢測。Wang等[17]基于先前的工作提出了雙內(nèi)標(biāo)-電泳滴定(double inner standard plot model of electrophoresis titration, DISP-ET)檢測模型,可以實現(xiàn)乳品總蛋白含量的現(xiàn)場定性檢測。這些方法實現(xiàn)了ET檢測的小型化,可以快速實現(xiàn)定性分析,但是后續(xù)定量分析仍需光學(xué)檢測設(shè)備以及計算機(jī)軟件,難以實現(xiàn)即時、精確的定量檢測。

針對上述問題,本工作開發(fā)了一種基于智能手機(jī)的移動反應(yīng)界面電泳距離傳感檢測系統(tǒng),實現(xiàn)了ET方法的便攜式即時定量分析。該系統(tǒng)由ET裝置和智能手機(jī)組成,兩者通過藍(lán)牙通信,并在手機(jī)端設(shè)計了相應(yīng)的安卓軟件。此軟件可以控制ET裝置的電泳運(yùn)行,期間通過手機(jī)攝像頭獲取電泳結(jié)果,最終經(jīng)程序分析給出定量結(jié)果。本文以血清總蛋白和尿酸為研究目標(biāo)驗證該系統(tǒng)的性能,對人源血清白蛋白(human serum albumin, HSA)標(biāo)準(zhǔn)品和尿酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了檢測分析,并對從醫(yī)院獲得的真實血清樣本的總蛋白含量和尿酸含量進(jìn)行了檢測,驗證了所開發(fā)裝置的有效性和準(zhǔn)確性,證明本文提出的檢測系統(tǒng)是一種具有綜合性檢測潛力的通用平臺,在臨床分析和現(xiàn)場檢測中有著潛在的應(yīng)用價值。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高速離心機(jī)(貝克曼Allegra X-12,美國)用于從全血中分離血清樣本。電子天平(梅特勒托利多ML204/02,精度為0.1 mg,瑞士)用于樣品稱量。超純水系統(tǒng)(SG Water公司,德國)用于生產(chǎn)去離子水。智能手機(jī)(華為Mate9,中國)用于控制檢測過程及分析檢測結(jié)果。

氯化鉀和氫氧化鈉購自凌峰化學(xué)試劑有限公司;丙烯酰胺(acrylamide)、HSA、UA、尿酸氧化酶(urate oxidase)和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)購自上海麥克林生化科技有限公司;雙丙烯酰胺(bis-acrylamide)購自國藥化學(xué)試劑有限公司;酚酞(phenolphthalein)和過硫酸銨(ammonium persulfate, APS)購自上海化學(xué)試劑有限公司;四甲基乙二胺(tetramethyl ethylenediamine, TEMED)購自生工生物工程有限公司;隱色孔雀石綠(leucomalachite green, LMG)購自上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司;瓊脂糖(agarose, AG)購自上海貝晶生物技術(shù)有限公司。所有化學(xué)試劑均為分析純。

實際血樣取自上海市第六人民醫(yī)院(臨港院區(qū)),本研究已通過上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院臨床研究倫理委員會審批,批準(zhǔn)號:KS2011。

1.2 溶液制備與實驗操作

血液樣本前處理 使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集靜脈血5 mL,將血液在離心機(jī)中以4 000 r/min的速度離心5 min后,提取上層清液,然后將上清液加入超濾濃縮離心管以5 000 r/min的速度離心20 min,樣本體積濃縮到原體積1/3左右,吸取并棄去濾液,向超濾管中加入與濾液等體積的超純水,保存在-20 ℃冰箱中備用。

總蛋白檢測 聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel, PAG)母液:19.4 g的丙烯酰胺和0.6 g雙丙烯酰胺溶于水,定容至100 mL;陽極液:100 mmol/L KCl;陰極液:100 mmol/L NaOH; HSA母液:100 g/L的HSA溶液,儲存在4 ℃的冰箱備用。固定液制備:PAG母液與不同濃度的HSA溶液(將HSA母液稀釋成30、45、60、75、90 g/L的HSA溶液)混合,加入KCl和酚酞,使得溶液內(nèi)KCl濃度為0.1 mmol/L,酚酞質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%,依次加入APS和TEMED促凝。將固定液填充到ET芯片的3條通道中形成凝膠。凝膠固化后分別加入陽極液和陰極液,根據(jù)預(yù)先設(shè)置的電泳時間進(jìn)行電泳,過程中隨時通過軟件調(diào)用手機(jī)攝像頭獲取有色電泳界面并經(jīng)程序計算得出檢測值。

尿酸檢測 瓊脂糖凝膠母液:將0.1 g的瓊脂糖、0.5 mL的2 mol/L的KCl和0.1 mL的0.1 mol/L的乙酸鈉混合,加水定容至10 mL;陽極液:含有不同濃度(100、150、250、400和1 000 μmol/L) UA、 0.5 mg/mL尿酸酶、1 mmol/L LMG和10 μg/mL HRP的水溶液;陰極液:含有100 mmol/L KCl和100 μmol/L乙酸鈉的水溶液。將瓊脂糖加熱溶解后注入ET芯片3條通道中形成凝膠,凝膠固化后分別加入陽極液和陰極液,根據(jù)預(yù)先設(shè)置的電泳時間進(jìn)行電泳,過程中隨時通過軟件調(diào)用手機(jī)攝像頭獲取有色電泳界面并經(jīng)程序計算得出檢測值。

臨床樣本測定方法 醫(yī)院所使用的人源血清白蛋白和尿酸檢測方法為雙縮脲法和酶偶聯(lián)法,具體方法見參考文獻(xiàn)[18,19]。

圖 1 ET檢測系統(tǒng)示意圖Fig. 1 Schematic diagram of electrophoresis titration (ET) detection system a. model diagram of portable ET device with three channels. 1. three-channel ET chip; 2. touch screen; 3. charging interface; 4. device switch. b. smartphone and software interface. The user uses software to control the electrophoresis process through Bluetooth. Call the smartphone camera through the software, take the electrophoresis results, and show the quantitative results after program analysis and calculation. c. structure diagram of portable ET device. The device consists of power supply (rechargeable lithium battery), microcontroller (stm32), touch screen (liquid crystal display, LCD), Bluetooth (B-0004 wireless transmission), and three-channel ET chip (independently developed in the laboratory).

1.3 基于智能手機(jī)的ET檢測系統(tǒng)

圖1a為便攜式ET裝置模型示意圖,裝置尺寸為10 cm×15 cm×2.5 cm,重300 g,可輕松手持,適用于現(xiàn)場檢測。智能手機(jī)及開發(fā)的軟件界面如圖1b所示,基于智能手機(jī)ET裝置的結(jié)構(gòu)圖如圖1c所示。用戶通過手機(jī)軟件發(fā)送控制信息,裝置中的藍(lán)牙模塊接收后控制電源模塊中的升壓模塊為ET芯片提供24 V電壓,以控制電泳的運(yùn)行,或通過液晶觸摸顯示屏控制電泳過程。裝置上提供電泳拍攝窗口,在電泳運(yùn)行過程中,通過手機(jī)軟件調(diào)用手機(jī)攝像頭,拍攝窗口內(nèi)電泳結(jié)果,并通過內(nèi)置算法給出電泳檢測物質(zhì)及定量檢測結(jié)果。手機(jī)軟件是基于安卓系統(tǒng)開發(fā)的一款應(yīng)用程序,主要包括藍(lán)牙連接模塊、數(shù)據(jù)分析模塊和數(shù)據(jù)展示模塊。藍(lán)牙連接模塊負(fù)責(zé)與裝置通信,控制裝置電泳的進(jìn)行。數(shù)據(jù)分析模塊負(fù)責(zé)處理電泳結(jié)果。最后電泳結(jié)果處理圖及定量檢測結(jié)果通過數(shù)據(jù)展示模塊展示在手機(jī)屏幕上。

1.4 濃度-距離傳感和定量計算方法

基于酸堿滴定的蛋白ET原理 根據(jù)MRB蛋白電泳滴定原理[9-11,17],在電場的作用下,蛋白ET的運(yùn)行時間t與MRB遷移距離D呈線性關(guān)系,運(yùn)行時間越長,界面遷移距離越長。在運(yùn)行時間相同時,界面遷移距離與蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度CHSA呈線性關(guān)系,蛋白質(zhì)濃度越高,界面遷移距離越短。在三通道芯片中的兩個通道內(nèi)固定已知濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,在剩下的一個通道內(nèi)固定未知濃度的待測蛋白樣本,在相同電壓下運(yùn)行相同時間,測量出3條通道中的界面遷移距離。為了減小現(xiàn)場復(fù)雜環(huán)境因素對標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的影響,提高檢測系統(tǒng)的即時性,本文通過兩個蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和界面遷移距離建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,再將待測蛋白樣本的界面遷移距離帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出待測蛋白樣本的濃度。

基于酶促反應(yīng)的尿酸ET原理 根據(jù)MRB酶促尿酸電泳滴定原理[5],在電場的作用下,尿酸ET的運(yùn)行時間t與MRB遷移距離D呈線性關(guān)系,運(yùn)行時間越長,界面遷移距離越長。與蛋白ET不同的是,在運(yùn)行時間相同時,界面遷移距離與尿酸濃度c值的對數(shù)呈線性關(guān)系,且尿酸濃度越高,界面遷移距離越長。因此,不同于蛋白電泳,檢測尿酸是通過兩個尿酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)和界面遷移距離建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,再將待測尿酸樣本的界面遷移距離帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出待測尿酸樣本濃度的對數(shù),換算后得出待測尿酸樣本的濃度。

手機(jī)識別與定量方法 使用手機(jī)攝像頭在自然光下采集ET圖像,拍攝時保證3條通道的反應(yīng)界面都處在電泳拍攝窗口內(nèi),并盡量將圖片邊框?qū)?zhǔn)裝置上的電泳拍攝窗口,使得有色通道在圖片中基本處于水平位置。ET運(yùn)行時間較短時,三通道的界面差異較小,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行檢測會造成較大的誤差,在反應(yīng)界面運(yùn)行到電泳拍攝窗口中可以保證界面遷移時間大于1～2 min,界面遷移距離大于2 mm,此時建立標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測誤差較小。采集到ET圖像后,在手機(jī)上對圖像進(jìn)行了一系列處理,具體操作流程見圖2。首先對圖像做灰度化和高斯濾波的預(yù)處理,得到平滑的灰度圖像。接下來使用Canny邊緣檢測算法獲取3條通道的邊緣位置。找到3條通道后,通過通道內(nèi)橫向梯度變化率找到反應(yīng)界面。識別通道內(nèi)指示劑的顏色,在本文使用的體系中,品紅色為酚酞在堿性環(huán)境下的顏色,藍(lán)綠色為MG+(由LMG生成)的顏色,分別對應(yīng)蛋白與尿酸的檢測。針對不同的檢測物質(zhì),通過已知的兩個標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其界面遷移距離建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(蛋白對應(yīng)線性曲線,尿酸對應(yīng)對數(shù)線性曲線),再通過待測樣本的邊界遷移距離計算出待測樣本濃度,顯示在手機(jī)屏幕上。

圖 2 ET結(jié)果識別和定量方法流程圖Fig. 2 Flow chart of ET result recognition and quantification method

2 結(jié)果與討論

2.1 HSA及尿酸的測定

血清總蛋白中HSA的占比最高,主要起維持滲透壓、pH緩沖、載體和營養(yǎng)作用,其檢測對惡性腫瘤、營養(yǎng)及吸收障礙、肝硬化、腎病綜合征等多種疾病的臨床診斷具有重要意義[20-22]。本文采用HSA對系統(tǒng)的性能進(jìn)行初步驗證。圖3a、b顯示了ET中MRB遷移距離與HSA含量的實驗結(jié)果。如圖3a所示,HSA含量越高,在給定運(yùn)行時間內(nèi)MRB運(yùn)動距離越短。在選定的5種濃度中,界面遷移距離和運(yùn)行時間的擬合優(yōu)度(以決定系數(shù)(R2)表示)為0.998 3～0.999 4。根據(jù)圖3a中120 s的界面遷移距離,建立了如圖3b所示的界面遷移距離與HSA含量之間的關(guān)系。可以看出,界面遷移距離與HSA含量之間具有良好的線性關(guān)系(R2=0.995 9)。

UA是嘌呤代謝排泄到血液和尿液中的主要終產(chǎn)物,血液中尿酸的測定對痛風(fēng)、腎衰竭、慢性腎病、高尿酸血癥等多種疾病的臨床診斷具有重要意義[22,23]。圖3c、d顯示了ET中MRB遷移距離與UA含量的實驗結(jié)果。如圖3c所示,UA含量越高,在給定運(yùn)行時間內(nèi)MRB遷移距離越長。在選定的5種濃度中,界面遷移距離和運(yùn)行時間的擬合優(yōu)度R2為0.997 0～0.999 1。根據(jù)圖3c中240 s的界面遷移距離,建立了如圖3d所示的界面遷移距離與UA含量之間的關(guān)系?？梢钥闯?界面遷移距離與UA含量之間具有良好的對數(shù)線性關(guān)系(R2=0.993 5)。

圖 3 采用HSA和UA對于檢測系統(tǒng)進(jìn)行性能測試的結(jié)果圖(n=3)Fig. 3 Results of performance testing of the detection system using HSA and UA (n=3) a. relationship between moving reaction boundary (MRB) motion distance and running time for HSA under five content levels (10-30 g/L); b. calibration curves of MRB motion distance and protein content for HSA; c. relationship between MRB motion distance and running time for UA under five content levels (100-1000 μmol/L); d. calibration curves of MRB motion distance and UA content.

表1展示了ET檢測HSA與UA的線性范圍、檢出限及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),其中檢出限是根據(jù)手機(jī)軟件對界面遷移距離的最小識別尺度與同期空白對照所得出的最小標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度確定,RSD為圖3中HSA和UA樣本5個含量水平的RSD最大值。從表1中可以看出,HSA的線性范圍為0.5～35.0 g/L,而正常人血清總蛋白含量為60～80 g/L,血清經(jīng)稀釋后,ET具有測量血清總蛋白含量的能力。UA的線性范圍為100～4 000 μmol/L,正常人血尿酸含量為208～428 μmol/L,包含在ET檢測范圍內(nèi)。同時,ET方法具有較低的檢出限(0.05 g/L和50 μmol/L)以及較好的重復(fù)性(RSD為2.87%和3.21%)。

表 1 HSA與UA的線性范圍、LOD及RSD

2.2 實際樣本分析

為了驗證ET檢測系統(tǒng)對實際血清樣本總蛋白(TP)含量和UA含量檢測的有效性,首先選取志愿者血樣,該血樣血清總蛋白含量由醫(yī)院測得為68.4 g/L,UA含量為391 μmol/L (1號樣本)。進(jìn)行梯度稀釋后得到血清TP質(zhì)量濃度為9.8、17.1、22.8、27.4和34.2 g/L的樣本,用于血清總蛋白的測量。另取該血樣進(jìn)行梯度稀釋后得到UA濃度為97.8、156.4、260.7和391.0 μmol/L的樣本,加標(biāo)得到濃度為991.0 μmol/L的樣本,用于UA的測量。圖4a和4c中,界面遷移距離和運(yùn)行時間的擬合優(yōu)度與標(biāo)準(zhǔn)品檢測類似,R2為0.994 2～0.998 9,表明檢測系統(tǒng)在血清總蛋白和血尿酸的檢測上具有良好的檢測性能。圖4b和4d分別為運(yùn)行時間為120 s和240 s時的標(biāo)準(zhǔn)曲線,與HSA和UA標(biāo)準(zhǔn)品的檢測相比,其相同時間內(nèi)界面遷移距離明顯縮短,推測原因為血清中的其他物質(zhì)對ET有一定的阻滯作用。

圖 4 采用實際血樣中總蛋白和尿酸對于檢測系統(tǒng)進(jìn)行性能測試的結(jié)果圖(n=3)Fig. 4 Results of performance testing of the detection system using TP and uric acid in a real serum sample (n=3) a. relationship between MRB motion distance and running time for serum TP under five content levels (9.77-34.2 g/L); b. calibration curve of MRB motion distance and TP content in serum; c. relationship between MRB motion distance and running time for UA under five content levels (97.75-991 μmol/L); d. calibration curve of MRB motion distance and UA content in serum.

本文選取了5位志愿者的血清樣本進(jìn)行ET檢測,檢測總蛋白時將血清稀釋3倍,檢測尿酸時無需稀釋。智能手機(jī)得出的檢測結(jié)果如圖5a和5b所示,可以看到,界面中給出了檢測所用的指示劑、待測物質(zhì)以及檢測結(jié)果。將該檢測結(jié)果與醫(yī)院所提供的檢測結(jié)果比對(見表2和表3),可以看出,ET方法的血清總蛋白檢測結(jié)果與醫(yī)院數(shù)據(jù)的相對偏差≤6.03%,ET方法的RSD為1.40%～3.72%;尿酸檢測的相對偏差≤6.21%,RSD為2.63%～5.84%。結(jié)果證明該方法具有較好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性,可應(yīng)用于實際血清樣本的即時定量檢測。

表 2 臨床血清樣本總蛋白檢測結(jié)果

表 3 臨床血清樣本尿酸檢測結(jié)果

圖 5 (a)血清總蛋白和(b)尿酸實際檢測結(jié)果圖Fig. 5 Actual detection results of (a) serum total protein and (b) uric acid U: upper standard; L: lower standard; S: sample.

3 結(jié)論

本文發(fā)展了一種基于智能手機(jī)的便攜式ET系統(tǒng),并將其用于血清總蛋白和血尿酸的檢測。通過自主研發(fā)的手機(jī)軟件不僅可以無線控制ET裝置的電泳運(yùn)行,還可以即時拍攝并定量計算出電泳結(jié)果,進(jìn)一步提高了ET系統(tǒng)的便攜性。為驗證系統(tǒng)的性能,使用HSA和UA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測試,并進(jìn)行了血清總蛋白和UA這兩種不同的血生化指標(biāo)的檢測。實驗結(jié)果表明,該系統(tǒng)具有線性好、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好等優(yōu)點,尤其是具有即時性和便攜性,能夠完成現(xiàn)場定量檢測任務(wù),是一種具有綜合性檢測潛力的通用平臺,具有臨床應(yīng)用價值與現(xiàn)場檢測潛力。