吳晴陽(yáng)，周子維,3，楊 云，胡清財(cái)，黃慧清，林佳琪，吳宗杰，賴(lài)鐘雄，孫 云,

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002；3.寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352000）

綠葉揮發(fā)物是一類(lèi)氣態(tài)小分子物質(zhì)，主要由揮發(fā)性脂肪酸衍生物中的C6醇類(lèi)、醛類(lèi)、酸類(lèi)等構(gòu)成[1]，在植物受到如病原體侵害[2]、昆蟲(chóng)取食[3-4]、機(jī)械損傷[5]等脅迫時(shí)產(chǎn)生。

植物次生代謝眾多途徑中，脂肪酸代謝途徑參與了綠葉揮發(fā)物的相關(guān)轉(zhuǎn)變，其中，亞油酸可作為前體物質(zhì)，經(jīng)過(guò)脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX）和氫過(guò)氧化物酶（hydroperoxidelyase，HPL）催化下生成氫過(guò)氧化物（hydroperoxide，HPOD），再經(jīng)氧化酶作用生成C6醛，最終經(jīng)由乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）的作用生成相關(guān)醇類(lèi)[6]。類(lèi)似地，α-亞麻酸同樣也可經(jīng)LOX作用生成氫過(guò)氧亞麻酸（hydroperoxy octadecatrienoic acid，HPOT），再經(jīng)HPL作用生成(Z)-3-己烯醛后，可經(jīng)過(guò)(3Z):(2E)-己烯醛異構(gòu)酶（(3Z):(2E)-hexenal isomerase，HI）作用，將(Z)-3-己烯醛轉(zhuǎn)化為(E)-2-己烯醛[7]（圖1）。(Z)-3-己烯醛作為重要的綠葉揮發(fā)物之一，與(E)-2-己烯醛互為異構(gòu)體[8]，同樣在植物防御具有重要作用。近年來(lái)對(duì)(Z)-3-己烯醛的研究與應(yīng)用已經(jīng)深入植物抗性[9-10]、蟲(chóng)害防御[11]、環(huán)境生態(tài)[12]等領(lǐng)域，HI的異構(gòu)功能也得到進(jìn)一步研究。

圖1 α-亞麻酸代謝轉(zhuǎn)化及參與調(diào)控的基因Fig.1 Transformation of α-linolenic acid and its regulator genes

HI屬于Cupin蛋白家族的一員，此蛋白家族具有廣泛生物活性，值得注意的是其參與細(xì)菌中碳水化合物異構(gòu)酶和表異構(gòu)酶活性的修飾功能[20]。而碳水化合物與脂肪酸代謝物的關(guān)系極為密切，碳水化合物可為脂肪酸的合成[21]、氧化[22]提供原料。因此，推測(cè)HI在脂肪酸代謝途徑上也存在異構(gòu)功能。其次，在如辣椒[23]、黃瓜[24]、葡萄[13]等作物中，(Z)-3-己烯醛同樣發(fā)揮著構(gòu)成果實(shí)特征香氣、充當(dāng)信號(hào)因子、防御害蟲(chóng)等作用，并且參與(Z)-3-己烯醛與(E)-2-己烯醛異構(gòu)的相關(guān)HI基因也被鑒定出來(lái)。更重要的是，Chen Cong等[14]也將茶葉中對(duì)(Z)-3-己烯醛與(E)-2-己烯醛之間轉(zhuǎn)化具有調(diào)控作用的異構(gòu)酶CsHI鑒定出來(lái)，這對(duì)探究茶葉香氣物質(zhì)轉(zhuǎn)化具有重要意義。然而，具體針對(duì)烏龍茶加工過(guò)程中相關(guān)CsHI基因與茶葉香氣轉(zhuǎn)化的研究卻有待進(jìn)一步探尋。

茶樹(shù)鮮葉響應(yīng)非生物脅迫時(shí)會(huì)散發(fā)綠葉揮發(fā)物[25]，前人研究也證實(shí)，在烏龍茶加工過(guò)程中，茶樹(shù)鮮葉經(jīng)過(guò)萎凋、做青、殺青等加工工序，香氣動(dòng)態(tài)變化主要呈現(xiàn)為青草氣的逐漸逸失以及清香、花果香的形成與積累[26]。參與此香氣轉(zhuǎn)變過(guò)程的(Z)-3-己烯醛具有青草氣，而(E)-2-己烯醛具有清香、果香[27-28]，明確參與調(diào)控這兩種化合物之間轉(zhuǎn)化的基因及其表達(dá)水平亦可為解釋烏龍茶加工過(guò)程中香氣轉(zhuǎn)變的原因提供參考。

烏龍茶是我國(guó)特有的茶類(lèi)，以其獨(dú)特的香氣與滋味品質(zhì)聞名于世。本研究以烏龍茶鮮葉、萎凋葉、搖青葉、等時(shí)間攤放葉為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)比樣品中(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛的變化趨勢(shì)，利用Cupin篩選調(diào)控(Z)-3-己烯醛、(E)-2-己烯醛轉(zhuǎn)化關(guān)系之間的基因，計(jì)算基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出CsHI基因的相對(duì)表達(dá)水平，分析烏龍茶加工過(guò)程中(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛的轉(zhuǎn)化機(jī)制，旨在為探明烏龍茶香氣物質(zhì)的變化規(guī)律提供參考，從而為烏龍茶品質(zhì)形成機(jī)理提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃旦品種春季1芽3葉無(wú)病蟲(chóng)害，采摘于福建農(nóng)林大學(xué)茶學(xué)教學(xué)科研實(shí)踐基地茶樹(shù)資源圃。

RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒天根生化科技（北京）有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix ExTaqTM大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6CYQT-60型搖青機(jī)、LGJ-25C型真空冷凍干燥機(jī)北京四環(huán)生物制藥有限公司；7890B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國(guó)安捷倫公司；MPS多功能自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng) 德國(guó)格斯特爾公司；Pegasus HT飛行時(shí)間質(zhì)譜 美國(guó)力可公司；Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；K5500超微量分光光度計(jì) 北京凱奧公司；LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)羅氏公司；萃取針PDMS/DVB9（23 Ga，Plain，65 μm）美國(guó)Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)處理及分組

樣品于2018年10月1日下午3—5時(shí)采集，采摘標(biāo)準(zhǔn)為1芽3葉，要求老嫩程度均一、無(wú)病蟲(chóng)害的黃旦鮮葉（H1），鮮葉采摘后進(jìn)行30 min萎凋，獲得萎凋葉（H2）。萎凋后的做青加工先后有3 次，搖青機(jī)速度控制在25 r/min，搖青時(shí)間控制在5 min，每次搖青后進(jìn)行60 min的晾青。分別在3 次搖青階段前后采集500 g樣品，標(biāo)注為H3～H7，作為實(shí)驗(yàn)組（EG）。在采集實(shí)驗(yàn)組搖青過(guò)程樣品的同時(shí)，分別取同一時(shí)間段的未經(jīng)做青工序的萎凋葉樣品各500 g，標(biāo)注為CK3～CK7，作為對(duì)照組（CK）。以上每個(gè)取樣設(shè)3 個(gè)重復(fù)。所有樣品用錫箔紙包好后，快速放入液氮后取出，于-70 ℃冷藏（圖2）。

1.3.2 香氣檢測(cè)

茶樣經(jīng)真空冷凍干燥處理72 h后，采用研缽充分研磨至粉末狀，稱(chēng)取2.0 g茶葉粉末于20 mL頂空瓶，密封后利用頂空固相微萃取法提取揮發(fā)性物質(zhì)，并用氣相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。固相微萃取條件：萃取針PDMS/DVB9設(shè)定孵育溫度為80 ℃，孵育時(shí)間為31 min，萃取時(shí)間為60 min，解吸時(shí)間為3.5 min。色譜條件：色譜柱Rxi-5silMS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），進(jìn)樣口溫度設(shè)定為250 ℃，傳輸線溫度設(shè)定為275 ℃，以氦氣為載氣，流速為1 mL/min。程序升溫過(guò)程分別是50 ℃保持5 min，再以3 ℃/min速率升至210 ℃后保持3 min，此后再以15 ℃/min速率升至23 ℃；不分流進(jìn)樣品。質(zhì)譜條件：溶劑延遲時(shí)間設(shè)定為300 s，掃描范圍控制在30～500 u，采集速率為10 Spec/s；檢測(cè)器電壓為1530 V，電子電離能量為70 eV，離子源溫度為250 ℃。

為鑒定出(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛組分，利用儀器自帶軟件對(duì)測(cè)得揮發(fā)性代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，并與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)局化學(xué)（The National Institute of Standards and Technology，NIST）數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜進(jìn)行比較，查對(duì)有關(guān)質(zhì)譜資料，分析基峰、質(zhì)核比和相對(duì)峰度等方面，結(jié)合保留時(shí)間和質(zhì)譜分別對(duì)各峰加以確認(rèn)，從而鑒定出目標(biāo)產(chǎn)物。最后以峰面積＞1%的色譜峰作為有效觀測(cè)值，憑借峰面積歸一化法確定(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛組分在各樣品中的百分含量。

1.3.3 茶樹(shù)全基因組來(lái)源

由TPIA（http://tpia.teaplant.org/）下載茶樹(shù)中國(guó)種（Camellia sinensiscv.sinensis）舒茶早染色體級(jí)別基因組的蛋白注釋序列（CSSChrLev20200506PEP）。從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pfam.xfam.org/）獲得Cupin結(jié)構(gòu)域的隱馬可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）的多重序列比對(duì)的文件（Stockholm file），并生成PF00190的種子文件。運(yùn)用hmmer-3.0windows（http://eddylab.org/software/hmmer3/3.0/）軟件包中“hmmbuild”程序自建HI的hmm文件，并以建立好的hmm文件，運(yùn)用軟件包中“hmmsearch”程序獲得44 條候選CsHI基因。烏龍茶生產(chǎn)過(guò)程樣茶葉全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)委托華大基因BGISEQ-500平臺(tái)完成。

1.3.4 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

對(duì)篩選獲得的CsHI基因家族成員的核酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進(jìn)行對(duì)比，獲得其他植物物種的同源序列，使用MEGA7.0以鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)保存為NWK文檔，利用iTOL網(wǎng)站（http://itol.embl.de/）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行可視化處理。

1.3.5 總RNA的提取與cDNA的合成參照

依據(jù)RNAprep Pure Plant Kit說(shuō)明，以離心柱法抽提1.3.1節(jié)中鮮葉、萎凋葉及實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組茶樹(shù)葉片加工過(guò)程中的總RNA，利用超微量核酸分析儀檢測(cè)其濃度和純度，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將獲得的cDNA文庫(kù)置于-20 ℃條件下貯藏備用。

1.3.6 實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR）檢測(cè)

采用SYBR?Premix ExTaqTM試劑盒對(duì)黃旦葉片的CsHI基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。利用DNAman設(shè)計(jì)目的基因的特異性引物如表1所示。以CsGADPH為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系總共20.0 μL，包括SYBR Green Master Mix 10.0 μL，正、反向引物各0.8 μL，滅菌水7.4 μL，cDNA模板1.0 μL。擴(kuò)增程序設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt分別計(jì)算出相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 real-time PCR特異性引物Table 1 Specific primers used for real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad Prism 6.0和SPSS20對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及制圖，分別利用ANOVA并Tukey法和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，衡量實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛含量及CsHI相關(guān)基因表達(dá)水平的組內(nèi)差異和組間差異顯著性；利用Pearson相關(guān)系數(shù)評(píng)估(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛含量與CsHI基因表達(dá)水平的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏龍茶加工過(guò)程中(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛的鑒定及其動(dòng)態(tài)變化分析

利用頂空固相微萃取法結(jié)合氣相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)加工過(guò)程中的烏龍茶樣品進(jìn)行香氣物質(zhì)檢測(cè)，基于NIST數(shù)據(jù)譜庫(kù)鑒定(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛組分的離子峰，并依據(jù)此兩種物質(zhì)的變化趨勢(shì)繪制折線圖。如圖3所示，在烏龍茶加工過(guò)程中的做青階段，(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛大體呈現(xiàn)“此消彼長(zhǎng)”的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。值得注意的是，每次搖青工藝的進(jìn)行都促使(Z)-3-己烯醛呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并在第3次搖青（H7）處達(dá)到峰值。而每次搖青后經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的攤放處理，例如第1次搖青后至第2次搖青開(kāi)始前的攤放過(guò)程，即H3～H4階段，以及第2次搖青后至第3次搖青開(kāi)始前的攤放過(guò)程，即H5～H6階段，(Z)-3-己烯醛則呈現(xiàn)減少趨勢(shì)。在前期加工過(guò)程，(E)-2-己烯醛含量處于較小波動(dòng)狀態(tài)。值得注意的是，與(Z)-3-己烯醛變化趨勢(shì)相反，(E)-2-己烯醛在萎凋以及第1、2、3次搖青后的攤放過(guò)程，都呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，并在第3次搖青前（H6）達(dá)到峰值。在茶樹(shù)鮮葉離體至萎凋階段（H1～H2）以及在第1次搖青結(jié)束至第2次搖青開(kāi)始前的攤放階段（H3～H4），(E)-2-己烯醛較小幅度增加；而在加工中后期即第2次搖青結(jié)束至第3次搖青開(kāi)始前的攤放階段（H5～H6），(E)-2-己烯醛呈明顯增加趨勢(shì)；在第3次搖青結(jié)束后（H7），(E)-2-己烯醛又迅速下降。對(duì)比(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛在鮮葉（H1）和各加工過(guò)程節(jié)點(diǎn)中的組內(nèi)差異性，發(fā)現(xiàn)(E)-2-己烯醛僅在H4和H6處存在極顯著差異（P＜0.01）；而(Z)-3-己烯醛則在H2～H6處存在極顯著差異（P＜0.01），在H7處存在顯著差異（P＜0.05）。

圖3 烏龍茶加工過(guò)程中(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛峰面積豐度變化Fig.3 Changes in peak area of (Z)-3-hexenal and (E)-2-hexenalt during oolong tea processing

總體來(lái)看，(Z)-3-己烯醛在做青期間變化幅度較(E)-2-己烯醛明顯，并且兩種物質(zhì)之間的增減變化呈現(xiàn)一定程度的相反趨勢(shì)和互補(bǔ)趨勢(shì)。

2.2 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的HI合成基因的篩選

通過(guò)Me_V軟件作圖后對(duì)比篩選出的44 個(gè)轉(zhuǎn)錄本的每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的片段（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，F(xiàn)PKM）熱圖，結(jié)果如圖4所示。依據(jù)熱圖的聚類(lèi)，可將44 條基因劃分為3 個(gè)大類(lèi)。第1大類(lèi)具體包含CL711.Contig9_All、Unigene15913_All等14 條基因在內(nèi)的較低表達(dá)的基因，此大類(lèi)的基因在鮮葉乃至加工過(guò)程中表現(xiàn)出低表達(dá)狀態(tài)。第2大類(lèi)包含CL5954.Contig6_All、CL7529.Contig2_All在內(nèi)的18 條基因，此大類(lèi)包含的基因表達(dá)水平較高；值得注意的是，此類(lèi)基因在不同處理過(guò)程中普遍有較高表達(dá)，并且如Unigene19480_All等基因在經(jīng)過(guò)搖青處理（H7）后表達(dá)量較鮮葉（H1）和萎凋（H2）處理上調(diào)，在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的攤放（CK7）后也有較高的表達(dá)；基因Unigene33696_All則在鮮葉（H1）和萎凋（H2）處理中含有較高表達(dá)量，但經(jīng)過(guò)搖青（H7）處理和長(zhǎng)時(shí)間攤放（CK7）后表達(dá)量下降。第3大類(lèi)包含Unigene43037_All、Unigene1394_All在內(nèi)的12 條基因，此大類(lèi)基因多處于中表達(dá)水平，個(gè)別基因在經(jīng)過(guò)搖青處理后表達(dá)量上調(diào)，如CL1621.Contig3_All、Unigene23067_All等，亦有基因如Unigene43037_All、Unigene1394_All等呈現(xiàn)表達(dá)量下降。

圖4 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)CsHI在烏龍茶加工過(guò)程中FPKM值Fig.4 FPKM value of CsHI during manufacturing process of oolong tea based on transcriptomic data

考慮FPKM大于10的轉(zhuǎn)錄本，并且結(jié)合對(duì)比差異倍數(shù)，篩選出CL7529.Contig2_All、Unigene19480_All、Unigene1576_All和Unigene33696_All 4 條候選基因進(jìn)行后續(xù)研究將其分別命名為CsHI1、CsHI2、CsHI3和CsHI4。

2.3 烏龍茶加工過(guò)程中CsHI基因的表達(dá)水平和驗(yàn)證

CsHI基因已被證實(shí)具有異構(gòu)作用，其在烏龍茶加工過(guò)程中的表達(dá)水平還有待驗(yàn)證。因此，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，根據(jù)real-time PCR結(jié)果中4 條候選基因表達(dá)量水平衡量在加工各個(gè)階段CsHI基因的表達(dá)量，結(jié)果如圖5所示。在實(shí)驗(yàn)組中，CsHI1在萎凋（H2）處有最高表達(dá)量（19.36），但隨著做青工藝的進(jìn)行，表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在做青后期略微上升。在對(duì)照組中，表達(dá)量呈現(xiàn)波動(dòng)上升的趨勢(shì)，在H6處達(dá)到最大值（1.97），并且是對(duì)照CK6（1.16）的1.7 倍。結(jié)合差異性分析顯示，H3～H7實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間存在極顯著差異（P＜0.01），同時(shí)也存在極顯著組間差異（P＜0.01）。

圖5 烏龍茶加工過(guò)程中相關(guān)4 條CsHI基因的相對(duì)表達(dá)水平Fig.5 Relative expression levels of four CsHI genes during oolong tea manufacturing

與CsHI1類(lèi)似，CsHI2在H2處也具有較高的表達(dá)量（52.62），但其表達(dá)量在H4處達(dá)到峰值（321.92），并在隨后處理中顯著下降。在對(duì)照組中，僅在CK6處測(cè)得較高的表達(dá)水平（13.27），是實(shí)驗(yàn)組H6（7.33）處表達(dá)量的1.8 倍。結(jié)合差異性分析顯示，除H3與CK3存在顯著差異（P＜0.05）外，H4～H7與相應(yīng)的對(duì)照組之間存在極顯著差異。

與前兩個(gè)基因的變化趨勢(shì)稍有不同，CsHI3呈現(xiàn)隨著加工的推進(jìn)而表達(dá)量波動(dòng)上升的總體趨勢(shì)，值得注意的是，在第1次搖青開(kāi)始的H3處以及第2次搖青開(kāi)始的H5處，CsHI3的表達(dá)量顯著下降（0.41，0.28），而在搖青結(jié)束后的H4和H6處，CsHI3的表達(dá)量卻顯著提升（1.97，2.83），并在H6處達(dá)到最高值，并且相對(duì)應(yīng)的CK6同樣擁有對(duì)照組中的最高表達(dá)量（1.34）。除H6與CK6之間存在顯著差異（P＜0.05）外，其余處理之間均存在極顯著差異（P＜0.01）；并且H6與其他處理均存在極顯著的組間差異（P＜0.01）。

對(duì)比前3 個(gè)基因的在實(shí)驗(yàn)組做青環(huán)節(jié)中的表達(dá)模式，CsHI4則在對(duì)照組中擁有更高的表達(dá)，值得注意的是，伴隨著茶樹(shù)鮮葉離體，并經(jīng)歷了一定時(shí)間的攤放，CsHI4的表達(dá)量逐漸上升并在CK4處達(dá)到最高值（3.10），隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。而實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量則在搖青后期H6處呈現(xiàn)較高水平（0.43）。H3與CK3、H5與CK5、H6與CK6、H7與CK7存在極顯著差異（P＜0.01），僅在H4與CK4處存在顯著差異（P＜0.05），并且H4與其他處理存在組間極顯著差異（P＜0.01）。

結(jié)合熱圖中4 條CsHI基因在不同處理中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)4 條基因的表達(dá)水平及變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平基本吻合，因此進(jìn)行下一步研究。

2.4 烏龍茶加工過(guò)程中(Z)-3-己烯醛與(E)-2-己烯醛和CsHI基因相對(duì)表達(dá)水平關(guān)聯(lián)性分析

利用Pearson相關(guān)系數(shù)評(píng)估烏龍茶加工過(guò)程中，所篩選的4 條茶樹(shù)CsHI基因的表達(dá)水平與(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛的相關(guān)性，結(jié)果如表2～5所示。將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的處理劃分進(jìn)行相關(guān)性分析，具體是劃分為實(shí)驗(yàn)組中H1～H3，即茶樹(shù)鮮葉到第1次搖青結(jié)束處理為一組，H4～H5即第2次搖青前及搖青結(jié)束的處理為一組，H6～H7即第3次搖青前及搖青結(jié)束的處理為一組；對(duì)照組中以CK3～CK5為一組，即第1次搖青結(jié)束至第2次搖青結(jié)束的等時(shí)攤放對(duì)照為一組，CK6～CK7即第3次搖青開(kāi)始及搖青結(jié)束的等時(shí)攤放對(duì)照為一組。

表2 烏龍茶加工過(guò)程中(Z)-3-己烯醛與(E)-2-己烯醛和CsHI1基因相對(duì)表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性分析Table 2 Correlation coefficients between (Z)-3-hexenal and(E)-2-hexenal contents and relative expression level of CsHI1

表3 烏龍茶加工過(guò)程中(Z)-3-己烯醛與(E)-2-己烯醛和CsHI2基因相對(duì)表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性分析Table 3 Correlation coefficients between (Z)-3-hexenal and(E)-2-hexenal contents and relative expression level of CsHI2

表4 烏龍茶加工過(guò)程中(Z)-3-己烯醛與(E)-2-己烯醛含量和CsHI3基因相對(duì)表達(dá)水平的相關(guān)性分析Table 4 Correlation coefficients between (Z)-3-hexenal and(E)-2-hexenal contents and relative expression level of CsHI3

表5 烏龍茶加工過(guò)程中(Z)-3-己烯醛與(E)-2-己烯醛和CsHI4基因相對(duì)表達(dá)水平的相關(guān)性分析Table 5 Correlation coefficient between (Z)-3-hexenal and(E)-2-hexenal contents and relative expression level of CsHI4

在CsHI1基因表達(dá)量與(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛的關(guān)聯(lián)性分析中，實(shí)驗(yàn)組H1～H3處理中，CsHI1基因表達(dá)量與(Z)-3-己烯醛存在負(fù)相關(guān)，并與(E)-2-己烯醛顯著相關(guān)，可以推測(cè)此時(shí)的烏龍前期茶萎凋及搖青帶來(lái)的失水、機(jī)械脅迫促使CsHI1表達(dá)，(Z)-3-己烯醛下降，進(jìn)而形成(E)-2-己烯醛。然而，在H4～H5處理中，CsHI1與(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛之間分別存在極顯著相關(guān)，在H6～H7處理中，則存在負(fù)相關(guān)，推測(cè)此時(shí)烏龍茶加工已經(jīng)進(jìn)行至中后期，(Z)-3-己烯醛并未完全消散，(E)-2-己烯醛也在茶葉中擁有一定含量，結(jié)合CsHI1基因的表達(dá)水平，推測(cè)CsHI1對(duì)后期連續(xù)的機(jī)械脅迫響應(yīng)較弱。在對(duì)照組中，CsHI1基因只在CK6～CK7處理與(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛存在極顯著相關(guān)性，亦有助于支撐CsHI1基因?qū)^長(zhǎng)時(shí)間失水脅迫具有較好的響應(yīng)。

在CsHI2基因表達(dá)量與(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛的關(guān)聯(lián)性分析中同樣發(fā)現(xiàn)，此基因在H1～H3處理下與(Z)-3-己烯醛之間存在負(fù)相關(guān)，然而卻與(E)-2-己烯醛無(wú)顯著相關(guān)性，并在烏龍茶加工中后期H4～H5、H6～H7階段與(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛都存在極顯著相關(guān)性。聯(lián)系實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程，較為短暫的搖青過(guò)程促使大量具有青草氣、清香的物質(zhì)以揮發(fā)物形態(tài)快速逸失，而搖青后攤放也以較緩慢的過(guò)程生成烏龍茶的風(fēng)味物質(zhì)，其中也包括(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛。在對(duì)照組中，CsHI2基因同樣在CK6～CK7處理中與(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛存在極顯著相關(guān)性。因此推測(cè)CsHI2基因在經(jīng)過(guò)前期較長(zhǎng)時(shí)間萎凋后，由于第1次搖青的機(jī)械脅迫，誘導(dǎo)(Z)-3-己烯醛轉(zhuǎn)變?yōu)?E)-2-己烯醛；結(jié)合此基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在后續(xù)的加工過(guò)程中，此基因?qū)u青后的攤放處理具有較高的響應(yīng)，推測(cè)其同樣對(duì)搖青后的失水脅迫具有較好的響應(yīng)。

與CsHI2基因類(lèi)似，在CsHI3基因表達(dá)量與(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛的關(guān)聯(lián)性分析中，此基因在H1～H3處理下僅與(Z)-3-己烯醛存在負(fù)相關(guān)，然而并未得到其與(E)-2-己烯醛存在相關(guān)性，在H4～H5、H6～H7、CK6～CK7等處理下同樣存在極顯著的相關(guān)性。然而結(jié)合CsHI3基因在烏龍茶加工過(guò)程中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)隨著加工工藝的推進(jìn)，實(shí)驗(yàn)組中基因表達(dá)量呈現(xiàn)波動(dòng)上升的趨勢(shì)，具體在搖青后的攤放過(guò)程有上調(diào)的表達(dá)量，推測(cè)經(jīng)過(guò)搖青快速且加猛烈的機(jī)械脅迫后，緩慢失水更有助于此基因的表達(dá)，且機(jī)械脅迫對(duì)此基因的表達(dá)具有一定的抑制作用。

與前3 條基因不同，在CsHI4基因表達(dá)量與(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛的關(guān)聯(lián)性分析中，實(shí)驗(yàn)組中此基因與(E)-2-己烯醛存在負(fù)相關(guān)，并且在H4～H5處理中與(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛存在極顯著負(fù)相關(guān)，在H6～H7處理中則與(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛存在極顯著正相關(guān)。在對(duì)照組中，CsHI4基因在CK3～CK5處與(E)-2-己烯醛負(fù)相關(guān)，在CK6～CK7與(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛有極顯著相關(guān)性。結(jié)合CsHI4基因在不同處理中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在前期烏龍茶加工過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)組搖青帶來(lái)的脅迫對(duì)此基因的表達(dá)具有抑制作用；相反，在對(duì)照組中，與萎凋、攤放等工藝有關(guān)的失水脅迫則促使CsHI4基因表達(dá)量上調(diào)。這或許可以解釋不同處理下，CsHI4基因和(E)-2-己烯醛存在較大比例的負(fù)相關(guān)的關(guān)系，原因是前期加工帶來(lái)的機(jī)械損傷未能有效促使(Z)-3-己烯醛向(E)-2-己烯醛轉(zhuǎn)化，反而是長(zhǎng)時(shí)間的攤放失水明顯誘導(dǎo)CsHI4基因的表達(dá)。

2.5 4 條CsHI基因的生物信息學(xué)分析

為了解CsHI基因家族成員和其他物種相關(guān)基因之間親緣關(guān)系和進(jìn)化距離，在NCBI上對(duì)獲得的4 個(gè)茶樹(shù)HI基因的核酸序列進(jìn)行在BLAST，并利用MEGA7.0結(jié)合在線工具iTOL（http://itol.embl.de/upload.cgi）構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組中篩選獲得的包括Unigene33696_All、Unigene19480_All、Unigene1576_All、CL7529.Coting2_All在內(nèi)的核酸序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，如圖6所示。結(jié)果表明，存在胡蘿卜、向日葵、百日菊、桑、川桑、葡萄、番木瓜、一串紅、麻風(fēng)樹(shù)、咖啡、二粒小麥、水稻12 個(gè)物種的17 個(gè)與茶樹(shù)CsHI基因核酸序列相似的核酸序列，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)劃分為4 個(gè)大類(lèi)，標(biāo)記為a～d。其中，a大類(lèi)成員包括Unigene33696_All，茶樹(shù)中與生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白、類(lèi)萌發(fā)素蛋白相關(guān)的兩條基因與其密切相關(guān)，同樣具有較近親緣關(guān)系的基因也包括胡蘿卜、向日葵、百日菊、白桑、川桑等物種在內(nèi)的生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白、類(lèi)萌發(fā)素蛋白等相關(guān)基因。b大類(lèi)成員包含Unigene19480_All，除與茶樹(shù)中球蛋白貯藏蛋白相關(guān)的基因具有較高同源性之外，此基因與葡萄中相關(guān)功能的蛋白也具有較近的親緣關(guān)系。c大類(lèi)成員包含Unigene1576_All，與Unigene33696_All類(lèi)似，具有與番木瓜、一串紅、麻風(fēng)樹(shù)、茶樹(shù)等物種中的類(lèi)萌發(fā)素蛋白相關(guān)的基因具有較近親緣關(guān)系。CL7529.Coting2_All歸屬于d大類(lèi)，其與咖啡、一串紅、二粒小麥、水稻中類(lèi)萌發(fā)素蛋白相關(guān)的基因具較高相似度，同樣也具有與茶樹(shù)類(lèi)萌發(fā)素蛋白相關(guān)的基因聚在同一分支。結(jié)合進(jìn)化樹(shù)HI基因家族成員普遍與類(lèi)萌發(fā)素蛋白相關(guān)的基因具有較近的同源性，推測(cè)HI基因可能具有相關(guān)的生物學(xué)功能。

圖6 基于CsHI基因核酸序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree based on nucleotide sequence homology of CsHI

3 討論與結(jié)論

3.1 HI在動(dòng)植物中的屬性

(Z)-3-己烯醛與(E)-2-己烯醛都是重要的綠葉揮發(fā)物[29]。在HI的作用下，(Z)-3-己烯醛可異構(gòu)為(E)-2-己烯醛。在以黃瓜果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料的研究中，HI也具備將轉(zhuǎn)化為(Z,Z)-3,6-壬二烯醛轉(zhuǎn)化為(E,Z)-2,6-壬二烯醛的功能，這兩種物質(zhì)同時(shí)也是黃瓜果實(shí)的揮發(fā)性風(fēng)味成分[17]。在鱗翅目昆蟲(chóng)口腔分泌物中也鑒定出HI，為研究植物-昆蟲(chóng)關(guān)系生存關(guān)系提供借鑒[30]。

在有關(guān)HI的研究中發(fā)現(xiàn)，HI具有Cupin蛋白結(jié)構(gòu)域。Cupin來(lái)源于拉丁語(yǔ)“Cupa”，意思是指至少由6 個(gè)β-折疊片形成的桶狀結(jié)構(gòu)[31]。具有2 個(gè)Cupin結(jié)構(gòu)域的蛋白最早于高等植物種子貯藏蛋白中發(fā)現(xiàn)[32]。在本研究構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)中發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)中球蛋白貯藏蛋白基因與HI聚集在同一分支，此蛋白具有保守的Cupin結(jié)構(gòu)域，是Cupin蛋白超家族的一員。同樣，在進(jìn)化樹(shù)中顯現(xiàn)出的許多與HI較近親緣關(guān)系的其他物種中的類(lèi)萌發(fā)素蛋白，同樣含有β-折疊桶狀結(jié)構(gòu)域，二者均屬于Cupin蛋白家族。由于大多數(shù)Cupin蛋白家族成員都具有致敏性，且致敏蛋白涵蓋來(lái)自堅(jiān)果[33-34]、花生[35]、大豆[36]、芝麻[37]等物種，因此不僅在植物的抗性研究方面，在食品、醫(yī)藥的研究中Cupin蛋白的研究也十分受人關(guān)注。

3.2 烏龍茶加工過(guò)程中(Z)-3-己烯醛與(E)-2-己烯醛的轉(zhuǎn)化和關(guān)鍵基因的表達(dá)

早期有關(guān)茶樹(shù)(Z)-3-己烯醛及其衍生物的研究，多聚焦在(Z)-3-己烯醛和(Z)-3-己烯醇。研究發(fā)現(xiàn)，在綠茶的春茶中，(Z)-3-己烯醇是代表香氣成分之一[38]，并且(Z)-3-己烯醇是構(gòu)成綠茶栗香與清香的賦香物質(zhì)[39]；烏龍茶的做青工藝也有助于(Z)-3-己烯醇形成與積累，相關(guān)CsADH基因也對(duì)做青過(guò)程的機(jī)械損傷與失水雙重脅迫具有良好響應(yīng)[23]。

在有關(guān)茶樹(shù)HI基因的研究中，Chen Cong等[19]利用茶樹(shù)葉片在進(jìn)行不同時(shí)間萎凋的同時(shí)，設(shè)置機(jī)械損傷及失水、低溫等脅迫，經(jīng)鑒定CsHI基因表達(dá)水平在低溫萎凋（10 ℃）前4 h內(nèi)呈上升趨勢(shì)，后又下降；在機(jī)械損傷與失水脅迫處理中，經(jīng)歷8 h萎凋后達(dá)到表達(dá)量最大值。該研究結(jié)果說(shuō)明CsHI對(duì)非生物脅迫有較好響應(yīng)，同時(shí)也說(shuō)明了脅迫處理后經(jīng)過(guò)緩慢的、長(zhǎng)時(shí)間的萎凋，有助于CsHI表達(dá)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本研究以加工過(guò)程中的烏龍茶為實(shí)驗(yàn)樣品，檢測(cè)不同加工環(huán)節(jié)(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛的含量，篩選調(diào)控(Z)-3-己烯醛向(E)-2-己烯醛轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因及其表達(dá)水平鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，(Z)-3-己烯醛向(E)-2-己烯醛轉(zhuǎn)化主要發(fā)生在烏龍茶搖青后的攤放階段，葉片反復(fù)經(jīng)過(guò)搖青機(jī)械力的損傷，細(xì)胞破碎率增加，促使CsHI基因響應(yīng)表達(dá)；搖青后的靜置攤放，給予(Z)-3-己烯醛逐漸向(E)-2-己烯醛轉(zhuǎn)化的充足時(shí)間。這或許可以解釋?zhuān)趯?shí)際生產(chǎn)中，將呈現(xiàn)萎軟狀態(tài)的葉片進(jìn)行做青，促使茶葉“走水還陽(yáng)”，即由于主脈中水分向葉片輸送，使葉片恢復(fù)一定的挺直狀態(tài)，在此期間，反復(fù)的做青促使茶葉香氣逐漸由青草氣向清香、花果香轉(zhuǎn)變，從而影響烏龍茶品質(zhì)形成。而(Z)-3-己烯醛與(E)-2-己烯醛分別是構(gòu)成茶葉青草氣、清香或花果香的重要物質(zhì)。因此，該結(jié)果將為篩選烏龍茶特征香氣物質(zhì)與機(jī)理研究提供參考，也將為烏龍茶的加工技術(shù)提升與品質(zhì)調(diào)控提供借鑒。