尹含靚，劉 洋,2,*，譚益升，孫軍華,，蔣立文,2,*，杜 秋

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；3.鹽津鋪?zhàn)邮称饭煞萦邢薰荆?長沙 410000）

泡椒鳳爪是川渝特色風(fēng)味小吃，是將濕態(tài)發(fā)酵工藝與肉制品加工技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)品[1]。鳳爪是雞肉加工的副產(chǎn)品[2]，經(jīng)過解凍、切分、漂洗、煮制、鹵水泡制、調(diào)味、真空包裝和輻照殺菌后制得泡椒鳳爪，其口感酸鮮爽脆，含有豐富的蛋白質(zhì)，脂肪含量低，是一種深受消費(fèi)者喜歡的休閑制品。但由于泡椒鳳爪營養(yǎng)豐富，有利于微生物生長繁殖，使其在貯藏及銷售過程中容易出現(xiàn)溶爛、脹包等品質(zhì)劣變的現(xiàn)象[3]。

為保持泡椒鳳爪的脆度，產(chǎn)品不能高溫或巴氏殺菌處理，以免膠原蛋白析出影響產(chǎn)品脆度和外觀。傳統(tǒng)泡椒鳳爪加工中通常使用過氧化氫對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理殺菌，但自2015年國家規(guī)定不能使用過氧化氫作為加工助劑（食藥監(jiān)辦食監(jiān)一函〔2015〕609號(hào)）后，輻照殺菌和添加復(fù)合防腐保鮮劑便成為了泡椒鳳爪保質(zhì)的主要方法[4-5]。然而，由于輻照劑量的限制和不同防腐劑的抑菌范圍有限，導(dǎo)致部分腐敗微生物依然可以存活，使泡椒鳳爪產(chǎn)品出現(xiàn)溶爛及漲袋等腐敗現(xiàn)象。楊琴[6]發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致泡椒鳳爪漲袋的主要產(chǎn)氣微生物為解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）。馬含笑[7]從發(fā)軟的泡椒鳳爪中分離得到1 株小鱒魚大洋芽孢桿菌（Oceanobacillus oncorhynchi）。國內(nèi)外已有許多研究對(duì)肉制品中特定腐敗菌的致腐能力進(jìn)行探究，Liu Xiaochang等[8]通過測定腐敗菌作用于鳙魚產(chǎn)生的腐敗代謝產(chǎn)物，研究了腐敗希瓦氏菌、溫和氣單胞菌、波西米亞不動(dòng)桿菌和薩拉曼卡假單胞菌的致腐能力。王筱夢(mèng)等[9]通過腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子發(fā)現(xiàn)Bacillussp.M1對(duì)熟制羊肉的致腐能力最強(qiáng)。然而泡椒鳳爪中特定腐敗菌致腐能力的相關(guān)研究還鮮見報(bào)道。

本研究通過高通量測序及傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)溶爛泡椒鳳爪中的微生物進(jìn)行菌相分析及分離鑒定，將優(yōu)勢腐敗菌接種于泡椒鳳爪中判斷其致腐能力，旨在為后期防控泡椒鳳爪的腐敗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泡椒鳳爪樣品來自湖南某食品公司，為不同生產(chǎn)批次的溶爛樣品（YC0411、YC0507、YC0610、YC0623、YC0729、YC0811、YC0917、YC0921）及新鮮（ZC0921）樣品，所有樣品均按生產(chǎn)時(shí)間編號(hào)。

硫代巴比妥酸、三氯乙酸、無水乙醇、氯化鈉、硼酸、氧化鎂、鹽酸（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉 天津市化學(xué)試劑研究所有限公司；1,1,3,3-四乙氧基丙烷 上海麥克林生化科技有限公司；平板計(jì)數(shù)肉湯（plate count broth，PCB）青島海博生物技術(shù)有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；核酸定量分析試劑盒（Qubit dsDNA HS Assay Kit）美國英杰生命技術(shù)有限公司；AxyPre聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）清潔試劑盒 美國愛思進(jìn)公司；RStool DNA試劑盒 美國Omega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ReadMax 1900全波長掃描酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技公司；K9840型自動(dòng)凱式定氮儀 海能未來技術(shù)集團(tuán)股份有限公司；LDZX-50 KBS型立式高壓蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；S W-C J-1 F D 型無菌操作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-250BIII型恒溫培養(yǎng)箱天津泰斯特儀器有限公司；Centrifuge 5424型常溫離心機(jī)德國Eppendorf公司；Microfuge R 22R Centrifuge冷凍離心機(jī) 上海鵬儀電子科技有限公司；A200型PCR儀 杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司；Tanon EPS300型電泳儀、Tanon-2500型凝膠成像儀 上海天能公司。

1.3 方法

1.3.1 高通量測序

DNA提?。翰捎肊.Z.N.A.Soil DNA Kit試劑盒提取泡椒鳳爪樣品中細(xì)菌總DNA。并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，同時(shí)采用紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行定量。

PCR 擴(kuò)增：利用16 SrDNA V3～V4 區(qū)引物341F～805R進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系總體積為25 μL，其中包含25 ng模板DNA，2×Taqmaster Mix 12.5 μL，上下游引物各2.5 μL，ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。PCR擴(kuò)增條件為：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，32 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物10 μL用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，將檢測合格樣品送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司進(jìn)行高通量測序。

數(shù)據(jù)處理：對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)首先根據(jù)樣品的條形碼（barcode）信息對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分，再根據(jù)雙端序列的重疊（overlap）關(guān)系，將序列拼接成長的tags，并將序列上建庫引入的barcode和引物序列去除。使用Vsearch（V2.3.4）軟件過濾掉質(zhì)量值低的序列以及嵌合體序列[10]，再將具有97%以上相似性的序列分配給相同的可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）。每個(gè)OTU選擇代表性序列，然后使用核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目（ribosomal database project，RDP）分類器將數(shù)據(jù)歸類到每個(gè)代表性序列[11]。利用MAFFT（V7.310）軟件對(duì)不同類群優(yōu)勢種群的差異進(jìn)行多序列比對(duì)，研究不同OTU間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。以Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Observed OTUs為指標(biāo)，用QIIME（1.8.0版）計(jì)算所有樣品的各項(xiàng)指標(biāo)并進(jìn)行聚類，再通過α及β多樣性分析單個(gè)樣本中物種的多樣性以及樣本間菌群結(jié)構(gòu)之間的差異[12-13]，根據(jù)每個(gè)OTU代表序列與RDP數(shù)據(jù)庫和Unite數(shù)據(jù)庫的比對(duì)，得到各個(gè)樣本所有OTU的物種注釋，對(duì)OTU進(jìn)行物種分類統(tǒng)計(jì)后獲得門水平和屬水平上的物種豐度。

1.3.2 優(yōu)勢腐敗菌分離鑒定

取泡椒鳳爪樣品25 g于225 mL生理鹽水中，充分振蕩搖勻，并進(jìn)行梯度稀釋。取合適稀釋梯度的菌懸液100 μL涂布至PCA培養(yǎng)基上，放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，挑選平板中的不同形態(tài)典型菌落，在平板上劃線2～3 次，直至得到純化的單個(gè)菌落。挑取單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀察。并對(duì)菌種進(jìn)行DNA提取，使用細(xì)菌通用引物（27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行擴(kuò)增測序，將所得序列在NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)。

1.3.3 優(yōu)勢腐敗菌酶活性測定

按1%的接種量將種子液接種到液體培養(yǎng)基中，37 ℃、140 r/min培養(yǎng)48 h后，4 ℃、8000 r/min離心10 min后取上清液，即為粗酶液。

蛋白酶活性：參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中的福林-酚法進(jìn)行測定。

脂肪酶活性：參照GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》進(jìn)行測定。

1.3.4 優(yōu)勢腐敗菌致腐能力測定

1.3.4.1 菌懸液制備與接種

供試腐敗菌菌株接種于PCB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h，用無菌生理鹽水將其濃度調(diào)至107CFU/mL。

將泡椒鳳爪樣品分為6 組。4 個(gè)處理組：分別吸取0.5 mL腐敗菌菌液，接種至裝有10 g無菌樣品的真空塑封袋中，真空包裝，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中貯藏；對(duì)照組1：吸取0.5 mL無菌水，接種至裝有10 g無菌樣品的真空塑封袋中，真空包裝，放置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中貯藏；對(duì)照組2：吸取0.5 mL無菌水，接種至裝有10 g無菌樣品的真空塑封袋中，真空包裝，放置于-20 ℃冰箱中貯藏。在貯藏1 個(gè)月時(shí)，處理組樣品均出現(xiàn)溶爛腐敗現(xiàn)象，對(duì)其進(jìn)行理化指標(biāo)測定。

1.3.4.2 pH值測定

使用pH計(jì)（Testo 205）插入泡椒鳳爪中測定其pH值。

1.3.4.3 揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值測定

參照GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》進(jìn)行測定。

1.3.4.4 硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值測定

參照GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的測定》進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

理化指標(biāo)數(shù)據(jù)為3 次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，細(xì)菌群落數(shù)據(jù)分析均有4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以表示。通過SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）后進(jìn)行Duncan多重比較，P＜0.05時(shí)均值差異顯著。采用Origin 2021和Excel繪制數(shù)據(jù)圖。使用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序法分析優(yōu)勢腐敗菌

2.1.1α多樣性分析

α多樣性通常用來表示樣品微生物群落組成的豐富度和多樣性[14]。Observed OTUs和Chao1指數(shù)用來反映物種豐富度，而Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)主要反映物種多樣性[15]。由表1可知，所有樣品的覆蓋率均達(dá)到0.99以上，說明本次測序的結(jié)果能代表樣品中細(xì)菌群落組成的真實(shí)情況。新鮮樣品（ZC0921）的Observed OTUs和Chao1指數(shù)比大部分異常樣品高，說明溶爛樣品中的細(xì)菌群落種類相較正常樣品下降。同時(shí)，異常樣品中的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)較低，可能是優(yōu)勢腐敗菌抑制了其他微生物的增殖。江楊陽等[16]在小龍蝦腐敗實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，貯藏時(shí)間延長，微生物種類降低，與本研究結(jié)果相似。

表1 泡椒鳳爪樣品細(xì)菌α多樣性比較Table 1 Comparison of bacterial α diversity of chicken feet with pickled peppers

2.1.2 細(xì)菌群落組成分析

如圖1a 所示，溶爛泡椒鳳爪樣品（YC0411、YC0507、YC0610、YC0623、YC0729、YC0811、YC0917、YC0921）中的優(yōu)勢腐敗菌門為厚壁菌門（Firmicutes），而正常樣品（ZC0921）中的優(yōu)勢菌門為藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）。YC0921中的厚壁菌門相對(duì)豐度在所有異常樣品中最低（50.08%），其次為YC0917（85.10%），而2020年8月11日前的樣品（YC0411～YC0811）厚壁菌門相對(duì)豐度均大于95%，說明隨著貯藏時(shí)間延長，優(yōu)勢腐敗菌門逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位。

圖1 泡椒鳳爪樣品細(xì)菌在門（a）及屬水平（b）群落組成Fig.1 Bacterial community composition at the phylum (a) and genus (b)levels in chicken feet with pickled peppers

泡椒鳳爪樣品中細(xì)菌群落在屬水平上的組成情況如圖1b 所示。正常樣品ZC 0921 中的優(yōu)勢菌屬為Oxyphotobacteria_unclassified（71.27%），Oxyphotobacteria屬于藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria），其廣泛分布于湖泊、土壤等生態(tài)環(huán)境中[17]，因此Oxyphotobacteria_unclassified可能來源于環(huán)境中。而異常樣品中的優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus），YC0921中不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、鏈球菌屬（Streptococcus）等也具有較高的相對(duì)豐度。隨著貯藏時(shí)間延長（生產(chǎn)時(shí)間越早），芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度增加（從34.68%增加至99.90%），而其他細(xì)菌屬的相對(duì)豐度均下降，說明芽孢桿菌屬為導(dǎo)致樣品溶爛的主要腐敗微生物，其抑制了其他微生物生長，使樣品中的微生物種類呈降低趨勢[16]。芽孢桿菌屬被確定為多種肉制品中的腐敗菌，如鮑魚[18-19]和鹽水鵝[20]。泡椒鳳爪產(chǎn)生溶爛現(xiàn)象可能是由于芽孢桿菌具有產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶活性[21]，導(dǎo)致泡椒鳳爪中蛋白質(zhì)和脂肪降解。

2.2 優(yōu)勢腐敗菌的分離鑒定

根據(jù)高通量測序結(jié)果，對(duì)溶爛泡椒鳳爪樣品的潛在腐敗菌進(jìn)行分離純化，共得到4 株典型菌株，其菌落形態(tài)及菌體形態(tài)如圖2所示。菌株623-4表面隆起，質(zhì)地黏稠；菌株811-2表面扁平有褶皺；菌株917-1表面干燥凸起，有褶皺，邊緣不規(guī)則；菌株921-4表面光滑，呈放射狀。4 株菌株革蘭氏染色均為陽性，呈桿狀，有芽孢。

圖2 分離菌株的菌落形態(tài)及其菌體形態(tài)（×100）Fig.2 Colony morphology and cell morphology of the isolated strains (× 100)

根據(jù)16S rDNA建立系統(tǒng)發(fā)育樹（表2），可知菌株623-4為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B.methylotrophicusL01），相似度達(dá)98%；菌株811-2為貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensisstrain 2586）,相似度達(dá)96%；菌株917-1為枯草芽孢桿菌（B.subtilisisolate BS-1），相似度達(dá)100%；菌株921-4為沙福芽孢桿菌（B.safensisstrain HNS004），相似度達(dá)98%。

表2 分離菌株的16S rDNA鑒定結(jié)果Table 2 Results of 16S rDNA identification of the isolates

2.3 優(yōu)勢腐敗菌的酶活特性

對(duì)優(yōu)勢腐敗菌株進(jìn)行蛋白酶及脂肪酶活測定。結(jié)果顯示，所有菌株均具有一定的蛋白酶及脂肪酶活性（圖3）。菌株921-4蛋白酶活性最強(qiáng)（51.19 U/mL），其次為623-4（28.81 U/mL）、917-1（7.36 U/mL）和811-2（5.20 U/mL）。而脂肪酶活性最強(qiáng)的菌株為623-4（3.75 U/mL），其次為811-2（2.92 U/mL），921-4（2.83 U/mL）和917-1（2.08 U/mL）。研究表明，芽孢桿菌通常具有較高的產(chǎn)蛋白酶能力[22]。曹紅等[23]從魷魚中篩選出1 株蛋白酶活性高達(dá)（257.67±2.44）U/mL的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌。沙福芽孢桿菌在優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白酶活可達(dá)69.26 U/mL[24]。此外，芽孢桿菌也是重要的產(chǎn)脂肪酶菌株[25]，徐偉芳等[26]從土壤中篩選出的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌在最適條件下脂肪酶活性達(dá)21.22 U/mL。本研究分離得到的4 株菌可能對(duì)泡椒鳳爪中的蛋白質(zhì)和脂肪均具有一定的降解作用。因此，將分離菌株接種于泡椒鳳爪中，進(jìn)一步驗(yàn)證其對(duì)泡椒鳳爪的致腐能力。

圖3 不同菌株的蛋白酶及脂肪酶活性比較Fig.3 Comparison of protease and lipase activity of the isolates

2.4 優(yōu)勢腐敗菌對(duì)泡椒鳳爪的致腐性驗(yàn)證

通常，微生物代謝會(huì)產(chǎn)酸或產(chǎn)堿性物質(zhì)，因此pH值是評(píng)價(jià)食品品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)[27]。由表3可知，接種不同腐敗菌株的泡椒鳳爪樣品組pH值均高于C組（37 ℃貯藏空白對(duì)照），說明4 株菌均具有一定的致腐能力，其分泌的酶類物質(zhì)可以降解泡椒鳳爪中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸、胺類等堿性物質(zhì)[28-29]。

表3 接種不同腐敗菌的泡椒鳳爪理化指標(biāo)Table 3 Physicochemical properties of chicken feet with pickled peppers inoculated with each of the spoilage bacteria

TVB-N值升高主要是由于微生物和內(nèi)源酶作用于蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨、胺類等揮發(fā)性含氮物質(zhì)[27]。4 個(gè)處理組的TVB-N值均高于同樣貯藏溫度下的對(duì)照C組（表3），表明4 株芽孢桿菌均對(duì)泡椒鳳爪具有一定的致腐能力。鄭瑞生等[18]研究發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）可以分解鮑魚中的蛋白質(zhì)而導(dǎo)致貯藏18 d TVB-N值達(dá)到362.32 mg/100 g。接種623-4菌株的泡椒鳳爪TVB-N值最高（25.10 mg/100 g），接種811-2菌株的樣品TVB-N值最低（12.08 mg/100 g）。盡管921-4菌株產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng)，但接種921-4菌株的樣品TVB-N值并不高（18.57 mg/100 g），這可能是由于921-4菌株在鳳爪中生長能力較弱導(dǎo)致的。張若煜[30]和Wang Guangyu[31]等研究亦發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)蛋白酶活性的假單胞菌在肉中生長能力較低，使TVB-N值較低，與本研究結(jié)果相似。此外，C組（6.50 mg/100 g）的TVB-N值比N組（-20 ℃貯藏空白對(duì)照）（3.13 mg/100 g）高，可能是泡椒鳳爪中的內(nèi)源酶降解蛋白質(zhì)導(dǎo)致，說明低溫可以抑制蛋白質(zhì)的降解。

油脂中的多不飽和脂肪酸氧化分解會(huì)產(chǎn)生醛、酮等物質(zhì)，其衍生物丙二醛（malondialdehyde，MDA）通常被用來表示脂質(zhì)氧化程度[32]。TBARS值越大，說明MDA含量越高，脂質(zhì)氧化程度也越高[33]。由表3可知，811-2組（0.83 mg/kg）和623-4組（0.82 mg/kg）的TBARS 值最高，而917-1 組（0.41 mg/kg）的TBARS 值比C 組（0.45 mg/kg）略低，表明菌株917-1對(duì)泡椒鳳爪脂質(zhì)氧化的影響較小，與體外脂肪酶活性實(shí)驗(yàn)（圖3）結(jié)果一致。有研究表明，肉制品的品質(zhì)在TBARS值大于0.6 mg/kg時(shí)會(huì)發(fā)生變化[34]，產(chǎn)生不愉悅的氧化風(fēng)味[35]，因此菌株623-4、811-2和921-4對(duì)泡椒鳳爪的品質(zhì)均有一定的影響，可能導(dǎo)致產(chǎn)品脂肪降解并產(chǎn)生異味。C組（0.45 mg/kg）的TBARS值比N組（0.33 mg/kg）高，這可能是由于低溫抑制了脂肪氧化[36]。

3 結(jié)論

本研究通過高通量測序技術(shù)與傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)溶爛泡椒鳳爪樣品進(jìn)行菌相分析及腐敗菌分離，發(fā)現(xiàn)溶爛泡椒鳳爪中的優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬，優(yōu)勢菌株為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌623-4、貝萊斯芽孢桿菌811-2、枯草芽孢桿菌917-1、沙福芽孢桿菌921-4。菌株921-4蛋白酶活性最強(qiáng)（51.19 U/mL），而菌株623-4脂肪酶活性最強(qiáng)（3.75 U/mL）。此外，將4 株菌分別接種于泡椒鳳爪中，測定樣品的pH值、TVB-N值和TBARS值判斷其致腐能力。結(jié)果表明，分離得到的4 株菌均具有一定的致腐能力，其中菌株811-2對(duì)泡椒鳳爪的pH值（5.48）和TBARS值（0.83 mg/kg）影響最大，菌株623-4對(duì)泡椒鳳爪TVB-N值（25.10 mg/kg）影響最大。