樂 薇，蒙利秀，王 源，覃永薇

（武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430065）

蘆丁是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在植物中，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、清除自由基、降血糖、促進(jìn)血管舒張等多種藥理作用，同時(shí)也可用作食品抗氧化劑和色素等，在藥物和食品中的應(yīng)用越來越廣泛[1-3]。槐米是豆科植物槐樹（Sophora japonicaL.）的干燥花蕾，有涼血止血、清肝瀉火等功效，是一種藥食同源的藥材[4]?；泵资翘崛√J丁的主要原料，槐米中蘆丁含量的高低成為決定槐米品質(zhì)的重要指標(biāo)[5-6]。由于蘆丁含量受品種、產(chǎn)地、栽培過程和槐米加工技術(shù)等多種因素影響[7-9]，因此開發(fā)一種簡便快捷、低廉、現(xiàn)場(chǎng)化的蘆丁檢測(cè)方法很有必要。

蘆丁含量的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[10-11]、熒光法[12-13]和電化學(xué)法[14-15]等。隨著新技術(shù)的發(fā)展，碳點(diǎn)因其具有出色的熒光特性、光穩(wěn)定性、制備原料來源廣泛、制備過程簡單多樣等優(yōu)點(diǎn)[16]，在熒光法高效快速測(cè)定蘆丁含量中的應(yīng)用已引起不少學(xué)者關(guān)注，如Li Huiyu等[17]使用多壁碳納米管作為載體，嗎啉乙磺酸為前體，通過固態(tài)熱裂解法合成了碳點(diǎn)，以此碳點(diǎn)的熒光響應(yīng)檢測(cè)了蘆丁片劑、人尿和人血清樣品中的蘆?。籗induja等[18]利用非必需氨基酸天冬酰胺合成碳點(diǎn)，計(jì)算了該碳點(diǎn)與蘆丁的猝滅常數(shù)和結(jié)合常數(shù)，并應(yīng)用于蘆丁片中蘆丁含量測(cè)定；丁志杰[19]和王靖原[20]等分別以生物質(zhì)銀杏葉、紅棗為碳源采用水熱法制備了能用于蘆丁熒光檢測(cè)的碳點(diǎn)；此外Xie Xiaoqian等[6]以反蛋白石光子晶體為骨架，以碳點(diǎn)為熒光響應(yīng)材料，制備了一種對(duì)蘆丁有特定識(shí)別能力的碳點(diǎn)包埋的分子印跡光子晶體水凝膠，并應(yīng)用于槐花中蘆丁含量的測(cè)定。

紙芯片具有成本低、便攜、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，與智能手機(jī)聯(lián)用的微流控紙芯片分析傳感方法被廣泛認(rèn)為是快速檢測(cè)發(fā)展的主流方向[21-22]。目前已有將碳點(diǎn)和紙芯片結(jié)合制備碳點(diǎn)紙芯片的報(bào)道，如Rossini等[23]采用蠟印并加熱熔化蠟的方法在濾紙上形成疏水屏障，熒光碳點(diǎn)溶液滴加在親水區(qū)，制備出檢測(cè)血清和尿液的葡萄糖碳點(diǎn)紙芯片；Liu Cui等[24]用碳點(diǎn)溶液做油墨，通過噴墨打印制備碳點(diǎn)紙芯片；Yen-Linh[25]和Du Xiaoyan[26]等則將剪切法獲得的圓形濾紙片直接滴加或浸泡于碳點(diǎn)溶液制備碳點(diǎn)紙芯片。上述蠟印法和噴墨法需要特殊的儀器，剪切法得到的紙芯片每片僅能測(cè)試一個(gè)樣品，且蠟印法和剪切法中碳點(diǎn)溶液直接滴加于紙基材料上，碳點(diǎn)與紙基材料的作用力不強(qiáng)，有可能有碳點(diǎn)不耐受樣品液的沖洗出現(xiàn)顯色不均的情況?；诖耍狙芯块_發(fā)一種殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯片，選擇對(duì)蘆丁有高選擇性的熒光碳點(diǎn)，利用殼聚糖的成膜性，于濾紙表面形成碳點(diǎn)殼聚糖薄膜，使碳點(diǎn)均勻的固定于紙芯片中，點(diǎn)樣后樣品斑點(diǎn)由于殼聚糖膜適宜的疏水作用可限制在一定區(qū)域內(nèi)均勻顯色，可同步實(shí)現(xiàn)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和多個(gè)樣品的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

槐米 廣齊生物科技有限公司；D-天冬酰胺（純度98%）、殼聚糖（脫乙酰度≥95%）上海麥克林生化科技有限公司；蘆丁、槲皮素、山柰酚（純度≥99%）天津一方科技有限公司；異鼠李素、綠原酸（純度≥99%）金測(cè)分析（天津）有限公司；甲醇（色譜純）天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

JYO2S型紫外分析儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；721型分光光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；F97Pro熒光分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；小米12智能手機(jī) 北京小米科技有限責(zé)任公司；定性濾紙（中速）杭州通用電氣生物有限公司；LC-201A高效液相色譜儀 美國英特矽爾公司。

1.3 方法

1.3.1 碳點(diǎn)溶液的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[18]，稍作修改。稱取天冬酰胺0.5 g，加熱至200 ℃保溫10 min，冷卻后得到棕色固體粉末，加適量水溶解后10000 r/min離心，取上清液用0.22 μm濾膜過濾，干燥后用0.1 mol/L NaOH溶液溶解配制成一定濃度的碳點(diǎn)溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 碳點(diǎn)-蘆丁二元熒光光譜及碳點(diǎn)-殼聚糖-蘆丁三元熒光光譜

準(zhǔn)確移取5 mg/mL的碳點(diǎn)溶液0.2 mL，一定濃度的殼聚糖溶液（1% HAc溶液為溶劑）0.1 mL和一定濃度的蘆丁溶液（50%乙醇溶液為溶劑）1.0 mL，加水稀釋至10 mL，10 min后于激發(fā)波長365 nm處掃描各體系的熒光發(fā)射光譜。

1.3.3 殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯片的制備

量取16 mL一定質(zhì)量濃度的殼聚糖溶液（1% HAc溶液為溶劑）和4 mL不同質(zhì)量濃度的碳點(diǎn)溶液，磁力攪拌30 min，得含一定濃度的殼聚糖和碳點(diǎn)的鑄膜液。將裁剪好的濾紙條浸入鑄膜液1 min，取出，均勻地刮去濾紙條兩面多余的鑄膜液，平鋪于已洗凈并干燥的玻璃板上，晾干即得殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯片。

1.3.4 殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯片法的可行性分析

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：準(zhǔn)確稱取20 mg蘆丁，加30%乙醇溶液溶解并定容50 mL，得0.4 mg/mL蘆丁溶液。準(zhǔn)確移取0.4 mg/mL蘆丁溶液0、0.5、1 mL，加30%乙醇溶液補(bǔ)充體積至1 mL，再加水定容至10 mL，得到0、20、40 μg/mL蘆丁溶液。

按1.3.3節(jié)制備殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯，其中殼聚糖質(zhì)量濃度25 mg/mL、碳點(diǎn)質(zhì)量濃度10 mg/mL。另將濾紙浸入2 mg/mL碳點(diǎn)溶液中后取出，晾干，即得不含殼聚糖的碳點(diǎn)紙芯片。在不含殼聚糖的碳點(diǎn)紙芯片和殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯片上各點(diǎn)樣0、20、40 μg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液4 μL，30 min后在波長365 nm處紫外燈照射下觀察顯色斑點(diǎn)情況。

1.3.5 單因素試驗(yàn)優(yōu)化

為提高碳點(diǎn)紙芯片測(cè)定蘆丁的靈敏度，以配制蘆丁溶液的溶劑（即蘆丁質(zhì)量濃度為0 μg/mL）為空白，考察蘆丁點(diǎn)樣后顯色斑點(diǎn)的紅（R）、綠（G）、藍(lán)（B）值的差值（ΔR、ΔB、ΔG），以其為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3.5.1 殼聚糖濃度的優(yōu)化

按1.3.3節(jié)制備殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯片，殼聚糖終質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20 mg/mL，碳點(diǎn)的終質(zhì)量濃度為5 mg/mL。在紙芯片上加入4 μL 20 μg/mL蘆丁溶液（配制方法同1.3.4節(jié)），顯色30 min后拍攝365 nm波長處的熒光圖片。

1.3.5.2 碳點(diǎn)質(zhì)量濃度的優(yōu)化

按1.3.3節(jié)制備殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯片，殼聚糖終質(zhì)量濃度為20 mg/mL，碳點(diǎn)終質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL。在紙芯片上各加入4 μL 10、20 μg/mL蘆丁溶液（配制方法同1.3.4節(jié)），顯色30 min后拍攝365 nm波長處的熒光圖片，并分析顯色斑點(diǎn)的ΔR、ΔG、ΔB值。

1.3.5.3 溶劑優(yōu)化

按1.3.3節(jié)制備殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯片，殼聚糖終質(zhì)量濃度為20 mg/mL，碳點(diǎn)終質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。在紙芯片上各加入4 μL 10、20 μg/mL蘆丁溶液，蘆丁的溶劑分別為0%、30%、50%、70%乙醇溶液，顯色30 min后拍攝365 nm波長處的熒光圖片，并分析顯色斑點(diǎn)的ΔR、ΔG、ΔB值。

1.3.5.4 點(diǎn)樣體積優(yōu)化

按1.3.3節(jié)制備殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯片，殼聚糖終質(zhì)量濃度為20 mg/mL，碳點(diǎn)終質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。在紙芯片上滴加不同體積（2、3、4、5、6、7 μL）20 μg/mL蘆丁溶液（溶劑為50%乙醇溶液），顯色30 min后拍攝365 nm波長處的熒光圖片，并分析顯色斑點(diǎn)的ΔR、ΔG、ΔB值。

1.3.5.5 顯色時(shí)間優(yōu)化

按1.3.3節(jié)制備殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯片，殼聚糖終質(zhì)量濃度為20 mg/mL，碳點(diǎn)終質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。在紙芯片上滴加4 μL 20 μg/mL蘆丁溶液（溶劑為50%乙醇），在不同顯色時(shí)間（10、15、20、25、30、40、60 min）下拍攝365 nm波長處的熒光圖片，并分析顯色斑點(diǎn)的ΔR、ΔG、ΔB值。

1.3.6 殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯片測(cè)定槐米中蘆丁的含量

1.3.6.1 蘆丁待測(cè)液制備

采取超聲波法[27]制備蘆丁待測(cè)液，略有修改?；被ǚ鬯楹鬁?zhǔn)確稱取0.1 g，加60%乙醇溶液10 mL，提取溫度45 ℃，超聲時(shí)間60 min，提取后，自然冷卻至室溫，過濾后取上清液0.5 mL，加50%乙醇溶液定容至25 mL。

1.3.6.2 蘆丁含量測(cè)定

在殼聚糖基紙芯片上，依次滴加4 μL 0、4、10、20、40、60、80、100 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（50%乙醇溶液為溶劑）和供試液，20 min后，將待測(cè)紙芯片水平置于紫外分析儀的暗箱中，于365 nm波長處將智能手機(jī)鏡頭置于紫外分析儀的相機(jī)拍照口，每次拍攝均采用2 倍焦距拍照模式。用Adobe Photoshop CS5.1軟件處理得到整個(gè)顯色區(qū)域的R、G、B平均值，然后再將計(jì)算得到的對(duì)應(yīng)差值，代入最優(yōu)濃度的擬合方程中，得到供試液中蘆丁質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算槐米樣品中蘆丁含量：

式中：V為槐米待測(cè)液體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為槐米樣品質(zhì)量/mg；C為槐米待測(cè)液中蘆丁質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.7 高效液相色譜法測(cè)定槐米中蘆丁的含量

1.3.7.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液及槐米待測(cè)液配制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取蘆丁對(duì)照品10 mg，加甲醇定容至100 mL，配制成0.1 mg/mL的蘆丁溶液。再分別取2、4、6、8 mL上述溶液，加甲醇稀釋至10mL，得0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL的蘆丁溶液。

槐米待測(cè)液：將槐米研碎，用100 目篩子過篩，稱取50 mg，加甲醇50 mL，超聲60 min，冷卻，用甲醇定容至100 mL，搖勻。經(jīng)0.45 μm濾膜過濾即得槐米待測(cè)液。

1.3.7.2 高效液相色譜條件[28]

Inertsil ODS-SP色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-1%冰醋酸（32∶68，V/V）；檢測(cè)波長257 nm；室溫；流速1 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表示為，采用Origin Pro 2015軟件進(jìn)行譜圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 可行性分析

2.1.1 碳點(diǎn)-蘆丁二元熒光光譜及碳點(diǎn)-殼聚糖-蘆丁三元熒光光譜

紙芯片點(diǎn)樣后在365 nm紫外燈照射下觀察熒光顯色斑點(diǎn)，考察存在或不存在殼聚糖時(shí)，蘆丁對(duì)碳點(diǎn)的熒光猝滅情況。由圖1A可知，蘆丁對(duì)碳點(diǎn)有明顯的熒光猝滅現(xiàn)象，質(zhì)量濃度遠(yuǎn)高于蘆丁的殼聚糖也表現(xiàn)出較弱的猝滅作用，蘆丁和殼聚糖的加入均不改變碳點(diǎn)的發(fā)射峰位置。當(dāng)向碳點(diǎn)-蘆丁體系加入殼聚糖時(shí)，發(fā)現(xiàn)碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度繼續(xù)下降，而進(jìn)一步增加殼聚糖濃度時(shí)，碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度下降程度減弱。當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度不小于0.1 mg/mL時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度不再隨殼聚糖質(zhì)量濃度的變化而變化，且和無殼聚糖體系的熒光強(qiáng)度相差不大，說明在較高殼聚糖質(zhì)量濃度下，碳點(diǎn)-蘆丁體系的熒光強(qiáng)度幾乎不受殼聚糖質(zhì)量濃度影響。推測(cè)殼聚糖上的氨基和羥基可能與碳點(diǎn)表面的羥基、氨基發(fā)生作用，但殼聚糖空間構(gòu)型龐大、其自身的氨基和羥基會(huì)形成分子內(nèi)及分子間氫鍵作用，造成其與碳點(diǎn)發(fā)生作用的位點(diǎn)數(shù)量少，從而對(duì)碳點(diǎn)有猝滅作用但不明顯；進(jìn)一步增加殼聚糖質(zhì)量濃度時(shí)，由于殼聚糖的自聚合作用，其表面自由的氨基和羥基進(jìn)一步減少、空間構(gòu)型更大，與碳點(diǎn)發(fā)生作用的位點(diǎn)極少，因而對(duì)碳點(diǎn)-蘆丁體系的影響可忽略。

圖1 各體系下的熒光光譜（A、B、C）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（D）Fig.1 Fluorescence spectra (A,B,C) and standard curves (D) of each system

比較不同蘆丁質(zhì)量濃度下的碳點(diǎn)-蘆丁熒光發(fā)射光譜（圖1B）和碳點(diǎn)-殼聚糖-蘆丁熒光發(fā)射光譜（圖1C），兩體系的最大發(fā)射波長一致，曲線形狀相似。進(jìn)一步測(cè)定各體系在最大發(fā)射波長450 nm處的熒光強(qiáng)度，以蘆丁質(zhì)量濃度為0的體系為對(duì)照，計(jì)算熒光強(qiáng)度改變值ΔF，以ΔF為縱坐標(biāo)、蘆丁質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1D），發(fā)現(xiàn)殼聚糖存在時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性仍較好，僅斜率略微下降（即檢測(cè)靈敏度略下降）。綜上可知，殼聚糖（≥0.1 mg/mL）存在對(duì)蘆丁猝滅碳點(diǎn)熒光的影響較小，可將殼聚糖作為載體固定碳點(diǎn)進(jìn)行紙芯片的制備。

2.1.2 殼聚糖基紙芯片測(cè)定蘆丁含量的可行性

如圖2所示，發(fā)現(xiàn)當(dāng)殼聚糖與碳點(diǎn)混合制成鑄膜液并干燥后，在濾紙上形成了含有碳點(diǎn)的殼聚糖薄膜，碳點(diǎn)可均勻固定在殼聚糖薄膜中，能有效承受沖洗。相比碳點(diǎn)紙芯片，殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯片背景更明亮，斑點(diǎn)擴(kuò)散不明顯，呈現(xiàn)出很好的顯色均勻性，且斑點(diǎn)顏色隨著蘆丁質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)梯度變化。

圖2 蘆丁在碳點(diǎn)紙芯片（A）和殼聚糖基紙芯片（B）上的顯色情況Fig.2 Chromogenic reaction of rutin on CD paper chip (A) and nonimprinted paper chip (B)

2.2 檢測(cè)機(jī)理探討

天冬酰胺含有氨基和羧基，以它為單一原料經(jīng)熱裂解后可形成表面富含氨基和羧基的碳點(diǎn)[18]。當(dāng)加入蘆丁時(shí)，蘆丁上的羥基能與碳點(diǎn)的氨基和羧基產(chǎn)生氫鍵，由于蘆丁的紫外吸收光譜和碳點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜（λEx=365 nm）有重合（圖3），推測(cè)蘆丁與碳點(diǎn)發(fā)生了內(nèi)源性熒光猝滅。

圖3 蘆丁的紫外吸收光譜（a）和碳點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜（b）Fig.3 UV absorption spectrum of rutin (a) and fluorescence emission spectrum of CDs (b)

在紙芯片法中，當(dāng)將殼聚糖和碳點(diǎn)混合后，基于殼聚糖自身的氫鍵作用和其大分子的空間位阻作用，高質(zhì)量濃度的殼聚糖可在碳點(diǎn)分子周圍產(chǎn)生分子間的堆砌，成膜后即使碳點(diǎn)被固定于殼聚糖膜的縫隙間，碳點(diǎn)表面的氨基和羧基僅有少量與殼聚糖發(fā)生作用，其他大量的氨基和羧基仍裸露于碳點(diǎn)表面，可與蘆丁發(fā)生熒光猝滅。

2.3 殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯片的制備優(yōu)化

2.3.1 殼聚糖質(zhì)量濃度的影響

殼聚糖可改變紙芯片的親水程度，考察鑄膜液中殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)蘆丁顯色的影響（圖4），發(fā)現(xiàn)隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的增加，斑點(diǎn)擴(kuò)散程度減緩。殼聚糖質(zhì)量濃度在5、10 mg/mL時(shí)顯色斑點(diǎn)擴(kuò)散明顯，質(zhì)量濃度15 mg/mL時(shí)斑點(diǎn)有部分?jǐn)U散且顯色圖形不規(guī)則，在20 mg/mL時(shí)斑點(diǎn)小且顯色均勻。這是因?yàn)闅ぞ厶堑唾|(zhì)量濃度時(shí)黏度低，能進(jìn)入濾紙間隙無法成膜，高質(zhì)量濃度時(shí)黏度高，部分殼聚糖未能進(jìn)入濾紙間隙[29]，可在濾紙表面成膜，殼聚糖分子中豐富的羥基和氨基使殼聚糖分子內(nèi)和分子間的氫鍵作用較強(qiáng)，分子間堆砌緊密，使膜具有一定的疏水性，從而表現(xiàn)出紙芯片的親水性變?nèi)?，由于樣品溶劑為?水體系，親水性強(qiáng)，因此樣品溶液點(diǎn)樣后顯色斑點(diǎn)限定在一定的區(qū)域。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇殼聚糖質(zhì)量濃度為20 mg/mL。

2.3.2 鑄膜液中碳點(diǎn)質(zhì)量濃度的影響

如圖5所示，隨著碳點(diǎn)質(zhì)量濃度的增加，ΔR值略有增加而后趨于穩(wěn)定，ΔG值和ΔB值呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在碳點(diǎn)質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)出現(xiàn)最大值。這是因?yàn)樘键c(diǎn)質(zhì)量濃度較大時(shí)，背景熒光強(qiáng)度大，造成蘆丁點(diǎn)樣后熒光強(qiáng)度變化不明顯，而添加量較小時(shí)，背景熒光強(qiáng)度減弱，且與蘆丁作用的碳點(diǎn)位點(diǎn)變少而造成變化不明顯。故預(yù)聚液中碳點(diǎn)的最優(yōu)質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。

2.4 紙芯片顯色條件的優(yōu)化

如圖6A所示，發(fā)現(xiàn)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，由于乙醇的蒸發(fā)作用顯色斑點(diǎn)干燥時(shí)間明顯變短，同時(shí)溶液的極性減弱、疏水性增強(qiáng)，也造成顯色斑點(diǎn)的面積增大、ΔR、ΔG、ΔB下降，亦即靈敏度減小。綜合考慮干燥時(shí)間和靈敏度，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

如圖6B所示，發(fā)現(xiàn)隨著點(diǎn)樣體積的增加，顯色斑點(diǎn)面積略有增加，但干燥所需時(shí)間增加明顯。點(diǎn)樣體積過小或過大也造成平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差變大，重復(fù)性下降。綜合考慮干燥時(shí)間、靈敏度及重復(fù)性，選擇點(diǎn)樣體積為4 μL。

斑點(diǎn)在點(diǎn)樣10 min內(nèi)由于溶劑的蒸發(fā)作用逐步干燥，可見光下其斑點(diǎn)面積無變化，干燥后立即在365 nm紫外燈下觀察并分析ΔR、ΔG、ΔB值。由圖6C可知，ΔR、ΔG、ΔB值在顯色時(shí)間15 min以內(nèi)時(shí)出現(xiàn)波動(dòng)，20 min達(dá)到穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)顯色時(shí)間90、120 min時(shí)ΔR、ΔG、ΔB值仍較穩(wěn)定，可以推斷該體系熒光能夠較長時(shí)間穩(wěn)定存在，長時(shí)間放置結(jié)果變化較小。選擇顯色時(shí)間為20 min。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在最佳的紙芯片制備條件和顯色條件下，滴加不同質(zhì)量濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行拍照（圖7），并讀取顯色斑點(diǎn)的ΔR、ΔG、ΔB值，代入不同的數(shù)學(xué)模型中進(jìn)行線性擬合，通過決定系數(shù)R2的判斷，本實(shí)驗(yàn)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為ΔG=-0.869C+27.274（R2=0.9944）。繼續(xù)呈梯度增加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)當(dāng)蘆丁質(zhì)量濃度為4～120 μg/mL時(shí)，熒光斑點(diǎn)的ΔG值與蘆丁質(zhì)量濃度依舊呈線性關(guān)系。對(duì)空白溶液進(jìn)行11 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，按照檢出限=空白測(cè)定值標(biāo)準(zhǔn)差3 倍/標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，得到檢出限為2.8 μg/mL。

圖7 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光顯色圖片F(xiàn)ig.7 Fluorescent color photos of rutin standard solution

2.6 方法的選擇性

為評(píng)價(jià)方法的選擇性，在蘆丁質(zhì)量濃度為20 μg/mL下，測(cè)定了常見離子、葡萄糖、蛋白質(zhì)、氨基酸和酚酸類及槐米中存在的黃酮類化合物對(duì)蘆丁熒光顯色斑點(diǎn)的影響。以標(biāo)準(zhǔn)曲線縱坐標(biāo)ΔG值的變化量為考察目標(biāo)，結(jié)果如表1所示。

表1 共存物質(zhì)的顯色斑點(diǎn)ΔG值Table 1 ΔG value of colored spots of coexisting substances

以ΔG值的變化量在5%以內(nèi)為指標(biāo)，可見常見離子（Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、F-、SO42-）、蛋白質(zhì)（牛血清白蛋白）、氨基酸（酪氨酸、甘氨酸）、糖（蔗糖、葡萄糖）等大量存在時(shí)對(duì)測(cè)定無影響；與蘆丁能產(chǎn)生配位作用的金屬離子Zn2+、與蘆丁結(jié)構(gòu)相似的酚酸類物質(zhì)（綠原酸）在該測(cè)定體系中也能允許較大量存在；黃酮類物質(zhì)（槲皮素、異鼠李素、山柰酚），其濃度為蘆丁濃度數(shù)倍以內(nèi)時(shí)，對(duì)測(cè)定的影響可忽略，由于槐米蘆丁含量很高，槲皮素、異鼠李素、山柰酚等的含量遠(yuǎn)低于蘆丁濃度[30]，上述共存物質(zhì)的影響可忽略。因此該紙芯片測(cè)定體系有較強(qiáng)的選擇性，能適用于槐米等復(fù)雜體系中蘆丁含量的測(cè)定。

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

按1.3.6節(jié)，對(duì)3 批次的槐米樣品平行測(cè)定3 次，計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果如表2所示，測(cè)出槐米中蘆丁的相對(duì)含量平均值為23.85%、22.83%、20.30%，RSD分別為6.1%、5.6%、6.7%，其測(cè)定結(jié)果與高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果相近。對(duì)其中一批次樣品進(jìn)行的加標(biāo)回收分析如表3所示，可知碳點(diǎn)紙芯片法的樣品回收率在91.27%～107.5%之間，RSD為6.7%。

表2 碳點(diǎn)紙芯片法和高效液相色譜法測(cè)定槐米中蘆丁含量Table 2 Results of detection of rutin in flower buds of S.japonica by CD paper chip and HPLC

表3 碳點(diǎn)紙芯片法測(cè)定蘆丁的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Spiked recoveries of CD paper chip

3 結(jié)論

制備了一種殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯片并將其成功用于槐米中蘆丁含量的測(cè)定，蘆丁質(zhì)量濃度在4～120 μg/mL時(shí)與其熒光顯色斑點(diǎn)的ΔG值呈良好的線性關(guān)系，R2=0.9944，測(cè)定結(jié)果與高效液相色譜法相近。由于碳點(diǎn)的熒光穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)制備好的碳點(diǎn)紙芯片在干燥條件下保存3 個(gè)月后仍可獲得良好的測(cè)定結(jié)果。紙芯片制備無繁瑣步驟，僅需將碳點(diǎn)與殼聚糖混合，于濾紙上鑄膜即可得到，紙芯片大小可根據(jù)待分析樣品個(gè)數(shù)自由裁剪，成本低廉，可快速批量制備；樣品液點(diǎn)樣后在紫外燈下即可檢測(cè)，可直接通過標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液顯色斑點(diǎn)的顏色深淺進(jìn)行半定量分析，也可以采用photoshop軟件或手機(jī)顏色識(shí)別器應(yīng)用軟件讀取斑點(diǎn)顏色G值進(jìn)行定量分析。該法簡便快捷，能滿足復(fù)雜體系中蘆丁含量的現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定，后續(xù)可進(jìn)一步開發(fā)對(duì)蘆丁有高選擇性、自然光下即可顯色的傳感器。