關 琦，顏賢仔，余莉莉，王翠萍，曾 佩，張 歡，王純榮

（江西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，江西 南昌 330045）

氨基酸是一種在自然界中普遍存在的具有羧基（—COOH）和氨基（—NH2）的有機酸，是組成蛋白質(zhì)的基本單位，是生命代謝的物質(zhì)基礎[1-2]，是維持人體正常生理活性的物質(zhì)，在人體內(nèi)氨基酸可以幫助調(diào)節(jié)自身的免疫力。其中，組氨酸（histidine，His）作為一種半必需氨基酸，對于嬰幼兒及動物的成長尤其重要；可作為生化試劑和藥劑，還可作為治療心臟病、貧血和風濕性關節(jié)炎等的藥物[3]；His可以通過組胺作用參與神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)；His可以擴張血管、降低血壓，在臨床上可用于心絞痛、心功能不全等疾病的治療。因此，對His的快速檢測具有重要意義。

目前，氨基酸的檢測方法主要是分光光度法[4-5]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6]、高效液相色譜法[7-8]、毛細管電泳法[9-10]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-13]和氨基酸自動分析儀[14-16]等；這些檢測方法存在需要大量繁瑣的樣品前處理和分析時間較長等問題。因此，迫切需要建立一種靈敏、快速和穩(wěn)定的氨基酸檢測方法。

表面增強拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）是一種可以提供分子振動的專屬性指紋信息并進行多重識別的高靈敏度的振動光譜技術，可以實現(xiàn)快速、無損和原位檢測，現(xiàn)已被廣泛應用到化學、物理學、生命科學和材料科學等領域中[17-18]；其中SERS性能優(yōu)異、穩(wěn)定性好和靈敏度高的基底可以對所測樣品起到很好的信號增強效果[19-20]。此外，通過衍生化反應有可能進一步提高拉曼光譜增強效果，F(xiàn)an Min等[21]采用偶氮偶聯(lián)反應結合SERS對正常人和結腸癌患者血清中的色氨酸含量進行檢測和比較，檢出限低于國家標準。有研究表明，在強酸條件下，胺類物質(zhì)（—NH2）可通過偶氮偶聯(lián)反應被氧化為重氮鹽，并與酚類、苯胺和一些雜環(huán)化合物在堿性或中性溶液中發(fā)生偶聯(lián)，生成偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）；此化學反應可以生成擁有大拉曼散射截面的生色團，這為增強拉曼檢測信號提供了可能[22-23]；Yu Shihua等[24]應用偶氮偶聯(lián)反應結合SERS對沙丁胺醇進行檢測，檢出限為2.39 pg/mL。Li Li等[25]將偶氮偶聯(lián)反應結合SERS對嬰兒奶嘴中的N-甲基苯胺進行檢測，檢出限為0.5 mg/L。

本實驗通過將偶氮偶聯(lián)反應和SERS結合的方法對His進行檢測。以氫氟酸刻蝕法制成的銀枝晶為SERS活性基底，并挑選3 種不同的重氮組分分別與His進行偶氮偶聯(lián)反應，探討重氮組分種類、固相萃取時間、Na2CO3質(zhì)量濃度和重氮組分濃度等對衍生化反應產(chǎn)物SERS信號的影響，探出His的檢出限，并根據(jù)His含量制作標準曲線進行線性擬合分析，又將此方法應用到實際樣品檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅富士蘋果 江西農(nóng)業(yè)大學超市。

硅片（單晶硅）深圳市瑞格銳思科技有限公司；硝酸銀（分析純）國藥集團化學試劑有限公司；2-氟-4-巰基苯胺（2-fluoro-4-mercaptoaniline，2-F-PATP）（分析純）上海韶遠試劑有限公司；NaNO2、Na2CO3、丙酮、40%氫氟酸、3-氨基芐胺（3-aminobenzylamine，3-ABL）、3-苯胺磺酸（3-anilinosulfonic acid，3-ACID）、His（均為分析純） 上海阿拉丁生化科技有限公司；實驗中用水均為去離子水。

1.2 儀器與設備

DXR2激光顯微共焦拉曼光譜儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；SU8010場發(fā)掃描電鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 銀枝晶基底的制備

參考文獻[26-27]的方法。取0.5 cm×0.5 cm大小的硅片用去離子水、丙酮超聲清洗15 min后，將晾干后的硅片在10%氫氟酸溶液中浸泡30 min進行酸刻蝕；將刻蝕后的硅片放入2 mol/L硝酸銀和40%氫氟酸（1∶50，V/V）的混合溶液中，浸泡10 min，銀離子被還原成銀，在硅片表面形成一層均勻的銀納米，用去離子水淋洗后，60 ℃烘干，備用。

1.3.2 溶液配制

1×10-5mol/L His溶液：稱取所需His固體的質(zhì)量，加入少量去離子水和鹽酸溶解His，再置于100 mL容量瓶用去離子水定容；4×10-3mol/L 3-ABL/3-ACID/2-F-PATP溶液：稱取所需3-ABL/3-ACID/2-F-PATP的質(zhì)量，用0.12 mol/L鹽酸溶液配制，記為試劑A；質(zhì)量濃度5 g/100 mL NaNO2溶液：稱取所需NaNO2固體的質(zhì)量，加入去離子水溶解并置于100 mL容量瓶中定容，記為試劑B；質(zhì)量濃度10 g/100 mL Na2CO3溶液：稱取所需Na2CO3固體的質(zhì)量，加入去離子水溶解并置于100 mL容量瓶中定容，記為試劑C。以上試劑其他濃度均用去離子水逐級稀釋，并均放置在4 ℃保存。蘋果切塊榨汁過濾后備用。

1.3.3 偶氮偶聯(lián)反應及拉曼光譜信號采集與數(shù)據(jù)處理

偶氮偶聯(lián)反應過程是在冰水浴的磁力攪拌條件下進行，試劑A、B、C、His的體積比為1∶1∶1∶2，按照順序加入試劑后，在磁力攪拌下反應5 min，然后將銀枝晶基底放入反應所得的衍生產(chǎn)物溶液中浸泡，進行固相萃取[28]，取出晾干后進行拉曼檢測。拉曼光譜儀采集參數(shù)：激光波長785 nm，激光能量5 mW，分辨率5 cm-1，單次采集曝光時間為2 s，光譜掃描范圍為500～2000 cm-1。光譜數(shù)據(jù)采用TQ 9.7軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 SERS基底的結構特征

銀枝晶基底是由氫氟酸刻蝕法制備，采用SU8010場發(fā)射掃描電子顯微鏡對銀枝晶的表面形貌進行表征。圖1顯示銀枝晶的形貌如樹枝狀，表面被密集覆蓋，有很多潛在的“熱點”[29-32]，在作為SERS活性基底方面有很大的應用潛力。

圖1 銀枝晶的SEM圖片F(xiàn)ig.1 SEM photos of silver dendrite

2.2 銀枝晶基底的穩(wěn)定性檢測

SERS基底性能的穩(wěn)定性對其應用具有顯著影響。圖2中檢測結果都是在2-F-PATP濃度為1×10-3mol/L、Na2CO3質(zhì)量濃度為6 g/100 mL和固相萃取5 min條件下完成；圖2A中15 個基底上均可檢測到His偶氮偶聯(lián)反應后的偶氮產(chǎn)物的2 個特征峰，拉曼光譜強度比較穩(wěn)定；由圖2B可以看到，His偶氮產(chǎn)物在同一基底上特征峰為1432 cm-1處的拉曼光譜強度變化，相對標準差為2.38%，平均強度變化小于10%。以上結果可以表明銀枝晶作為SERS基底用于檢測His有較好的穩(wěn)定性。

圖2 在15 個基底上測得His偶氮產(chǎn)物的SERS光譜圖（A）及同一基底15 個位置1432 cm-1處的拉曼光譜強度圖（B）Fig.2 SERS spectra of the histidine azo product measured on 15 substrates (A),Raman spectral intensity at 1432 cm-1 for 15 positions on the same substrate (B)

2.3 His常規(guī)拉曼光譜

如圖3所示，His固體拉曼光譜中1092 cm-1處特征峰為面內(nèi)C—H彎曲振動峰，1178 cm-1處特征峰為C—N伸縮振動峰，1272 cm-1處特征峰為面內(nèi)C—C彎曲振動峰，1321 cm-1處特征峰來自CH2搖擺[33]。圖3中，His溶液濃度為10-3mol/L，其拉曼光譜檢測時使用銀枝晶基底。研究顯示，His溶液基本檢測不到其特征峰拉曼光譜。因此，檢測His的拉曼光譜需要改進檢測方法。

圖3 His常規(guī)拉曼光譜Fig.3 Conventional Raman spectra of His

2.4 重氮組分的篩選

將同一濃度His分別與3 種重氮組分進行偶氮偶聯(lián)反應。選取其中出現(xiàn)偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）特征峰[34]在1380～1440 cm-1范圍內(nèi)，拉曼光譜指紋圖譜清晰，且SERS信號增強效果顯著的重氮組分。從圖4可以看出，空白銀枝晶基底的光譜圖接近平線，因此在利用銀枝晶基底對His偶氮產(chǎn)物進行檢測時沒有影響。在3 種重氮組分中，3-ABL與His偶氮偶聯(lián)反應后其產(chǎn)物在1001、1139、1227、1399 cm-1和1595 cm-1處出現(xiàn)拉曼光譜特征峰。其中，His偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）特征峰為1399 cm-1，不過該峰的拉曼光譜信號強度較低（圖4A）。當3-ACID用作重氮組分與His偶氮偶聯(lián)反應后在995、1190、1384 cm-1和1589 cm-1處出現(xiàn)拉曼光譜特征峰。其中，His偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）特征峰為1384 cm-1，其拉曼光譜信號強度不高，且特征峰不明顯（圖4B）。2-F-PATP用作重氮組分時，與His偶氮偶聯(lián)反應后在1064、1209、1246、1335、1387、1432 cm-1和1586 cm-1處出現(xiàn)拉曼光譜特征峰，可以在1387 cm-1和1432 cm-1發(fā)現(xiàn)His偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）特征峰，且特征峰處的拉曼光譜信號比較顯著（圖4C）。根據(jù)偶氮產(chǎn)物特征峰的拉曼光譜信號強弱以及拉曼指紋圖譜形狀，最終選取2-F-PATP進行后續(xù)研究。

圖4 3-ABL（A）、3-ACID（B）和2-F-PATP（C）與His偶氮產(chǎn)物SERS光譜Fig.4 SERS spectra of the azo products of 3-ABL (A),3-ACID (B) and 2-F-PATP (C) with His

2.5 固相萃取時間對偶氮產(chǎn)物SERS信號的影響

從圖5可以看出，固相萃取時間為5 min時，SERS信號最強，有比較顯著的效果，在萃取時間超過5 min后，SERS信號隨之減弱，得出固相萃取時間5 min為銀枝晶基底浸泡在His偶氮產(chǎn)物的溶液中萃取的適宜條件。

圖5 不同固相萃取時間的His偶氮產(chǎn)物SERS光譜Fig.5 SERS spectra of the histidine azo products with different solidphase extraction time

2.6 Na2CO3質(zhì)量濃度對偶氮產(chǎn)物SERS信號的影響

Na2CO3作用是調(diào)節(jié)重氮鹽溶液酸堿度，其含量對反應有一定影響。圖6顯示：在5 種不同Na2CO3質(zhì)量濃度下，都會產(chǎn)生偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）的特征峰。根據(jù)圖6選取特征峰（1387 cm-1和1432 cm-1）的拉曼光強度變化，發(fā)現(xiàn)當Na2CO3質(zhì)量濃度為6 g/100 mL時，SERS信號增強效果最好，因此選取此質(zhì)量濃度作進一步研究。

圖6 不同質(zhì)量濃度Na2CO3對His偶氮產(chǎn)物影響的SERS光譜Fig.6 SERS spectra of the effects of different concentrations of Na2CO3 on histidine azo products

2.7 2-F-PATP濃度對偶氮產(chǎn)物SERS信號的影響

圖7顯示：在2-F-PATP濃度為0.25×10-3、0.5×10-3mol/L和4×10-3mol/L時，均未發(fā)現(xiàn)明顯的偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）的特征峰信號；在2-F-PATP濃度為0.5×10-3、1×10-3mol/L下，都產(chǎn)生了偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）的特征峰信號。其中2-F-PATP濃度為1×10-3mol/L時SERS信號增強效果更顯著。

圖7 不同濃度2-F-PATP與His偶氮產(chǎn)物的SERS光譜Fig.7 SERS spectra of the histidine azo products adding 2-fluoro-4-mercaptoaniline with different concentrations

2.8 His含量定量分析

用濃度為1×10-3mol/L的2-F-PATP作為重氮組分與不同濃度（10-21～10-13mol/L）的His進行偶氮偶聯(lián)反應，反應中固相萃取時間5 min、Na2CO3質(zhì)量濃度6 g/100 mL。由圖8A可以看出，5 個濃度都可以檢測出偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）特征峰為1387 cm-1和1432 cm-1的SERS信號，并且隨著His濃度增加偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）特征峰的SERS信號也有明顯增加趨勢；圖8B和C分別是以His濃度結合特征峰1387 cm-1和1432 cm-1處拉曼光譜強度制作的標準曲線，可以看出特征峰1387 cm-1和1432 cm-1處拉曼光譜強度與His溶液濃度線性相關性良好。線性擬合方程分別為y=173266.3855+7893.8895x和y=178462.959+8115.819x，相關系數(shù)R2分別為0.97561和0.96884，均大于0.95，結果說明銀枝晶作為SERS基底靈敏度較高，將偶氮偶聯(lián)反應和SERS結合的方法較可靠，可以用來對微量氨基酸進行定量分析。

圖8 不同濃度His反應得到的偶氮產(chǎn)物SERS光譜（A）及1387 cm-1（B）和1432 cm-1（C）處特征峰的標準曲線Fig.8 SERS spectra of the azo product with different histidine concentrations (A),standard curve of the characteristic peak at 1387 cm-1 (B) and 1432 cm-1 (C)

2.9 實際樣品中的應用

使用偶氮偶聯(lián)反應對含有His殘基的不同濃度的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）、α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）和蘋果汁進行拉曼檢測。從圖9A～C可以看出，直接檢測蛋白并未檢測到偶氮產(chǎn)物的特征峰；但在1 mg/L和0.1 mg/L的BSA、HAS和α-LA與2-F-PATP偶氮偶聯(lián)反應后，都可以檢測出偶氮產(chǎn)物的特征峰并且SERS信號顯著。GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》中液體樣品的His檢出限為2.4 mg/L[35]。紅富士蘋果的蛋白質(zhì)含量約為3 g/kg[36]，制成的蘋果汁稀釋105倍后蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度約為0.015 mg/L，而果汁中His含量遠低于該國家標準規(guī)定的His檢測限。圖9D顯示，紅富士蘋果汁沒有明顯的拉曼光譜，而其稀釋105倍后與重氮組分2-F-PATP進行偶聯(lián)偶聯(lián)反應仍可以得到顯著的His偶氮產(chǎn)物SERS信號。以上研究表明本衍生化方法可以應用到含His的實際樣品的檢測并且靈敏度較高。

圖9 BSA（A）、HSA（B）和α-LA（C）兩種質(zhì)量濃度蛋白偶氮偶聯(lián)反應后SERS光譜及蘋果汁稀釋前后偶氮偶聯(lián)反應后的偶氮產(chǎn)物和直接在基底上檢測蘋果汁的SERS光譜（D）Fig.9 SERS spectra of azo products after azo-coupling reactions of two proteins with different concentrations of BSA (A),HSA (B) and α-LA (C);SERS spectra of azo products after azo-coupling reaction before and after dilution of apple juice and SERS spectra of apple juice directly on the substrate (D)

3 結論

建立了SERS與偶氮偶聯(lián)反應結合快速靈敏檢測His的方法。發(fā)現(xiàn)在2-F-PATP濃度為1×10-3mol/L、Na2CO3質(zhì)量濃度為6 g/100 mL，并且固相萃取5 min后即可檢測到His偶氮產(chǎn)物明顯的拉曼光譜指紋圖譜，且特征峰拉曼光譜強度較高。本方法檢測His的檢出限為10-21mol/L。根據(jù)特征峰（1397 cm-1和1432 cm-1）對His進行定量分析，His濃度與特征峰拉曼光譜強度呈現(xiàn)出良好的線性關系，R2分別為0.97561和0.96884，均大于0.95，具有良好的線性關系。使用本方法可對含有His殘基的BSA、HSA、α-LA和蘋果汁這些實際樣品進行檢測。該方法靈敏度較高、操作簡便、檢出限較低，在實際樣品檢測中具有良好的應用前景。