何建菊，劉欣欣，史紅玲，冉璐妮，王 賢，張英君，唐存多,,3,

（1.南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南 南陽 473061；2.賒店老酒股份有限公司博士后創(chuàng)新實踐基地，河南 南陽 473300；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

煙酰胺單核苷酸（nicotinamide mononucleotide，NMN）是一種天然存在的活性核苷酸，有α、β兩種異構(gòu)體，其中β-NMN是輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的活性形式[1]。NMN是細胞氧化還原NAD+的關(guān)鍵中間體[2]。NAD+在人體中發(fā)揮著至關(guān)重要的生物作用，主要包括參與生物氧化還原反應(yīng)、維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)及參與信號傳導(dǎo)過程[3]。有研究表明人體中NAD+含量會隨著年齡的增長而慢慢減少[4-6]，NMN在體內(nèi)需要轉(zhuǎn)化成NAD+才有生理功能[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)生物體內(nèi)NMN水平，對心臟和腦缺血、阿爾茨海默病、飲食和年齡引起的2型糖尿病和肥胖等有較好的治療和修復(fù)作用[6-8]。近幾年，NMN被譽為“不老神藥”[9]，有實驗表明，在小鼠模型中口服NMN會導(dǎo)致NAD+的回升，能抗衰老、延長壽命[10-11]。此外，通過煙酰胺核苷激酶（nicotinamide riboside kinase，NRK）途徑增加NAD+含量能恢復(fù)抗病毒聚ADP核糖聚合酶功能，對SARS-CoV-2產(chǎn)生先天免疫[12]。

NAD+主要有3 種代謝合成路徑：Preiss-Handler途徑、從頭合成途徑和補救合成途徑[13]。補救合成途徑是以煙酰胺核糖（nicotinamide ribose，NR）為底物，在NRK的作用下磷酸化生成NMN。NMN合成最早使用的是化學(xué)合成法，由于使用的各種化學(xué)試劑對環(huán)境造成污染、產(chǎn)物分離困難，且存在手性異構(gòu)體等問題，制約了NMN的大規(guī)模生產(chǎn)[2]。隨著生物催化、酶工程技術(shù)的發(fā)展，NMN的生物合成成為熱點。生物合成包括天然發(fā)酵法和酶促合成法，天然發(fā)酵法因為底物和產(chǎn)物都很容易被菌體自身消耗，產(chǎn)物很難大量積累，生產(chǎn)效率低下，不適于工業(yè)化生產(chǎn)[2]。酶促合成法是一種較為綠色環(huán)保的制備方法[14]，因為其沒有有機溶劑的殘留，也不存在手性問題等優(yōu)點。

目前，生產(chǎn)NMN的生物催化法有兩種，第1種是煙酰胺底物路線，第2種是NR底物路線[11]。煙酰胺底物路線是指以煙酰胺、ATP和核糖為底物，通過煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶制得NMN的方法[15-16]。第2種方法是以NR和ATP為底物，只需NRK的催化即可生成NMN，這是一個單酶反應(yīng)體系。反應(yīng)速率快，底物轉(zhuǎn)化率高，是目前比較熱門的合成路線[17-19]。雖然NR價格昂貴，但是考慮到NMN的重要性，以及NMN在醫(yī)療和生物技術(shù)行業(yè)的廣泛應(yīng)用，在可接受的成本范圍內(nèi)高效制造NMN仍然具有重要的意義[20]。同時，開發(fā)高活性的NRK，降低酶的使用成本也是降低NMN生物合成成本的有效途徑。

本研究從釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中克隆出NRK基因片段，再借助pET28a質(zhì)粒在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中實現(xiàn)高水平的可溶性表達，并對其酶學(xué)特性進行分析。本研究有望為NRK進一步分子改造、表達宿主的優(yōu)選及應(yīng)用奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

NR、β-煙酰胺核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品 麥克林化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；三磷酸腺苷溶液、磷酸二氫鈉、氯化鎂、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）生工生物工程（上海）股份有限公司；rTaqDNA聚合酶、PrimeSTAR?HS DNA聚合酶、PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DL 2000 DNA Marker、DNA連接試劑盒Ver.2.1 寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒與培養(yǎng)基

攜帶原核表達質(zhì)粒的BL21（DE3）/pET28a、釀酒酵母菌株由本課題組保藏[21]。LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基用于大腸桿菌的培養(yǎng)，酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基用于釀酒酵母的培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

核酸電泳儀 北京市六一儀器廠；蛋白電泳儀美國Bio-Rad公司；EC 2006型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng) 大連依利特分析儀器有限公司；Hypersil C18柱 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 重組大腸桿菌的構(gòu)建

以Saccharomyces cerevisiae和Nicotinamide nucleoside kinase為關(guān)鍵詞搜索，在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中找到釀酒酵母NRK1（ScNRK1），對應(yīng)的基因組序列（GenBank：AY611479.1）。為了去除模板核苷酸序列中的內(nèi)含子，選擇進行合成NRKcDNA的第1鏈，根據(jù)已報道的NRK1序列設(shè)計特異性引物NRK1-F：GGAATTCCATATGATGACTTCG AAAAAAGTGATA（含NdeI酶切位點）和NRK1-R：CCGCTCGAGCTAATCCTTACAAAGCTTTAG（含XhoI酶切位點），并委托蘇州弘訊生物技術(shù)有限公司進行合成。

以釀酒酵母的總RNA為模板，用PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit進行cDNA第1鏈的合成，再利用NRK1-F和NRK1-R引物PCR擴增NRK的編碼基因，利用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI對目的基因及pET28a質(zhì)粒分別進行雙酶切，然后連接轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，經(jīng)抗性篩選和測序鑒定獲得BL21（DE3）/pET28a-ScNRK1重組菌。將上述重組菌連續(xù)在無抗LB培養(yǎng)基上傳代10 次，然后接種至含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察它的生長情況，通過卡那霉素抗性篩選考察重組菌攜帶質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性[22]。

1.3.2 重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達及純化

將BL21（DE3）/pET28a-ScNRK1重組大腸桿菌單菌落接種至5 mL含100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)14 h，以2%接種量轉(zhuǎn)接至100 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600nm約為1.0，加入1 mol/L IPTG溶液至終濃度為0.1 mmol/L，16 ℃、200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h；將100 mL菌液于8000 r/min、4 ℃離心5 min，收集菌體，用20 mmol/L Tris-HCl菌體重懸后進行超聲破碎，破碎后收集上清液，上清液通過平衡好的鎳瓊脂糖柱上進行純化，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析[22-23]。

1.3.3 酶活力分析

NRK活力分析：以NR為底物，NMN生成量為標(biāo)準(zhǔn)計算酶活力。根據(jù)已報道的酶活力測定方法[23-24]略作修改。酶活力測定的反應(yīng)體系為1 m L，包含20 mmol/L pH 7.6 Tris-HCl緩沖液、10 mmol/L MgCl2、2 mmol/L ATP、10 mmol/L NR，加入稀釋適當(dāng)倍數(shù)的100 μL酶液，40 ℃反應(yīng)20 min，沸水中煮5 min終止反應(yīng)，0.22 μm濾膜過濾反應(yīng)液，用HPLC測定酶活力。HPLC條件：色譜柱為Thermo Hypersil C18柱，檢測波長260 nm，柱溫30 ℃，流動相為磷酸二氫鈉緩沖液-甲醇（95∶5，V/V），流速1 mL/min，進樣體積10 μL。在測定條件下每分鐘生成1 μmol NMN所需的酶量定義為1 個酶活力單位（IU）。

1.3.4 NMN的定量分析

將NMN準(zhǔn)品用超純水分別配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的溶液，然后分別取10 μL進行HPLC分析，獲得各濃度NMN的峰面積后，進行線性擬合獲得回歸方程及相關(guān)系數(shù)，色譜條件和上述測酶活力方法相同，后面待檢樣品產(chǎn)物按照同樣條件進行HPLC分析，根據(jù)測得的峰面積可以由回歸方程計算出相應(yīng)的樣品濃度。

1.3.5 重組酶的溫度特性

參照1.3.3節(jié)方法，分別在25～55 ℃（以5 ℃為間隔）下測定該重組酶的催化活性以獲得該重組酶的最適反應(yīng)溫度。將重組酶分別在25～55 ℃（以5 ℃為間隔）下保溫1 h，然后在最適反應(yīng)溫度下測定各自的殘留酶活力，以冰浴保存1 h后酶活力為100%，以此考察各重組酶的溫度穩(wěn)定性[25]。

1.3.6 重組酶的pH值特性

參照1.3.3節(jié)方法，在最適反應(yīng)溫度下，分別在pH 3.4～7.0（以0.6為間隔）下測定重組酶的催化活性以獲得重組酶的最適反應(yīng)pH值。將重組酶分別在pH 3.4～7.0（以0.6為間隔）緩沖液中冰浴1 h，然后在各自最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH值下測定各自的殘留酶活力，以未經(jīng)處理值為100%，以此考察各重組酶的pH值穩(wěn)定性[25]。

1.3.7 重組酶的最適Mg2+濃度

已有文獻報道，NRK催化活性受Mg2+濃度的影響[26]。為考察Mg2+濃度對重組酶酶活力的影響，參照1.3.3節(jié)方法，在最適反應(yīng)溫度下，分別在MgCl2終濃度為0.1～0.4 mol/L（以0.05 mol/L為間隔）下測定重組酶的催化活性，以獲得最適Mg2+濃度，以最適Mg2+濃度下酶活力為100%，以此檢測重組酶的最適Mg2+濃度。

1.3.8 重組酶的動力學(xué)參數(shù)

重組NRK動力學(xué)參數(shù)的測定根據(jù)已報道方法稍加修改，以確定NR底物的特異性[27]，反應(yīng)系統(tǒng)中ATP濃度為1 mmol/L。在最佳反應(yīng)條件下，在0.1～0.35 mmol/L不同NR濃度下測定重組酶的催化活性。每次測定重復(fù)3 次。同樣地，固定NR濃度為1 mmol/L，將ATP濃度設(shè)置為0.04～0.2 mmol/L，以測定重組酶的催化活性，每次測定執(zhí)行3 次，依次考察對ATP的動力學(xué)參數(shù)。使用Michaelis-Menten方程計算未表現(xiàn)出底物抑制酶的表觀動力學(xué)數(shù)據(jù)，或者當(dāng)觀察到底物抑制時使用以下方程：V=Vmax/（1+Km/S+S/Ki）[28]，所有計算均使用Origin 9.0軟件。

1.3.9 NMN的生物合成

NMN反應(yīng)進程：配制1 mL體系，包含50 mmol/L pH 5.8 Tris-HCl緩沖液、17.5 mmol/L MgCl2、3 mmol/L ATP、6 mmol/L NR，加入稀釋適當(dāng)倍數(shù)的100 μL酶液，在反應(yīng)10、20、30、40、50、60 min時取樣，終止反應(yīng)，用0.22 μm濾膜過濾，進行HPLC分析，獲得各反應(yīng)時間下的NMN峰面積，計算NMN隨反應(yīng)時間變化的得率。

1.3.10 常用網(wǎng)站及軟件

NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫和BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）：蛋白質(zhì)、基因序列及蛋白質(zhì)3-D結(jié)構(gòu)的搜索；DNAMAN：用于基因序列及限制性酶切位點分析和測序結(jié)果分析；ProtParam（https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）網(wǎng)站：預(yù)測蛋白質(zhì)的理論理化性質(zhì)；TMHMM-2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.phpTMHMM-2.0）：用于預(yù)測蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

圖片均用Adobe Photoshop CS 8.0軟件進行色階、對比度調(diào)節(jié)及標(biāo)注等處理。簡單的數(shù)據(jù)處理及分析均借助Origin 9進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組大腸桿菌的構(gòu)建

目的基因PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖如圖1A所示，在約750 bp處出現(xiàn)了明顯的特異性條帶，PCR產(chǎn)物的片段長度與預(yù)期的理論長度基本一致。潛在重組質(zhì)粒雙酶切的電泳檢測如圖1B所示，鑒定后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序鑒定，獲得ScNRK1的基因序列，并推測出其氨基酸序列。

圖1 ScNRK1基因的PCR擴增（A）及pET28a-ScNRK1的雙酶切驗證（B）Fig.1 PCR amplification of ScNRK1 (A) and double-enzyme digestion of pET28a-ScNRK1 (B)

2.2 ScNRK1的序列分析

將上述推測出的ScNRK1氨基酸序列在ProtParam上進行理論理化性質(zhì)的預(yù)測，結(jié)果表明ScNRK1的理論等電點為6.23，理論分子質(zhì)量為27689.58 Da，不穩(wěn)定指數(shù)II為25.59，是一個較穩(wěn)定的蛋白，其在大腸桿菌和酵母體內(nèi)的半衰期分別能達到10 h和20 h以上。利用TMHMM-2.0服務(wù)器預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的結(jié)果顯示，ScNRK1的240 個氨基酸殘基均為膜外殘基，表明ScNRK1理論上較容易實現(xiàn)胞外分泌型表達。

2.3 重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達及鑒定

圖2結(jié)果顯示，BL21（DE3）/pET28a-ScNRK1上清液在約27 kDa處有明顯的特異性條帶，與ScNRK1的理論分子質(zhì)量27689.58 Da基本一致，表明已成功實現(xiàn)了ScNRK1在大腸桿菌中的可溶性表達。經(jīng)親和純化后產(chǎn)物在約27 kDa處出現(xiàn)了單一特異性條帶，表明經(jīng)過親和層析，獲得了電泳純的重組ScNRK1，可以用于后續(xù)酶學(xué)特性的分析。酶活力測定結(jié)果表明，BL21（DE3）/pET28a-ScNRK1發(fā)酵液中NRK活力達14.75 U/mL，純化后重組ScNRK1的比活力為2252.59 U/mg（表1），其表達水平和比活均顯著高于已報道的水平[7]，具有較好的應(yīng)用前景。

表1 不同來源NRK的比活力及動力學(xué)參數(shù)的比較Table 1 Comparison of specific activity and kinetic parameters of nicotinamide nucleoside kinases from different sources

圖2 重組大腸菌表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expression products in recombinant E.coli

2.4 NMN標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析

將分析純的NMN在ThermoHypersil C18柱上進行HPLC分析，在該分析條件下，NMN的保留時間約為2.79 min（圖3A），底物標(biāo)準(zhǔn)品也進行HPLC分析，保留時間為4.02 min（圖3B）。將NMN濃度（x/（mmol/L））對相應(yīng)峰面積（y）進行線擬合，獲得NMN標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=173.87x+101.32，R2=0.9935，結(jié)果表明在該HPLC分析條件及濃度范圍下，NMN濃度與峰面積呈良好線性相關(guān)，因此，利用此法可以對NMN進行精確定量。

圖3 NMN（A）、NR（B）標(biāo)準(zhǔn)品分析Fig.3 HPLC chromatograms of NMN (A) and NR (B) standards

2.5 溫度對重組ScNRK1活力的影響

從圖4可以看出，在20～30 ℃溫度范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)速率隨溫度的升高而增大。當(dāng)溫度超過30 ℃時，反應(yīng)速率降低，重組ScNRK1的最佳反應(yīng)溫度為30 ℃，這和之前文獻報道的最適溫度相同[30]。由圖5可知，當(dāng)孵育的溫度超過40 ℃時，其殘余酶活力顯著下降，僅為50%左右，這在一定程度上也會限制它在NMN生物合成中的應(yīng)用，在以后研究中可通過蛋白質(zhì)工程和固定化技術(shù)對ScNRK1的熱穩(wěn)定性進行改造，以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求[20]。

圖4 重組ScNRK1的最適反應(yīng)溫度Fig.4 Optimal temperature of recombinant ScNRK1

圖5 重組ScNRK1的溫度穩(wěn)定性Fig.5 Temperature stability of recombinant ScNRK1

2.6 pH值對重組ScNRK1活力的影響

緩沖液pH值過高或過低可能會導(dǎo)致酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而降低其催化活性[31]。從圖6可以看出，重組ScNRK1是一種嗜酸性酶，其最適反應(yīng)pH值為5.8。當(dāng)pH值稍微偏離其最佳pH值時，其催化活性顯著降低。因此，在使用過程中必須嚴格控制反應(yīng)系統(tǒng)的pH值。從圖7可以看出，重組ScNRK1對pH值的耐受性較好，在測定條件下，它的殘余酶活力均大于90%。

圖6 重組ScNRK1的最適pH值Fig.6 Optimal pH of recombinant ScNRK1

圖7 重組ScNRK1的pH值穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of recombinant ScNRK1

2.7 重組ScNRK1的最適Mg2+濃度

從圖8可以看出，重組ScNRK1的最佳Mg2+濃度為350 mmol/L，過低的Mg2+濃度不能充分發(fā)揮酶的催化活性，過高的Mg2+濃度對酶的催化活性也有一定的抑制作用。

圖8 Mg2＋濃度對重組ScNRK1酶活力的影響Fig.8 Effect of Mg2+ concentration on the activity of recombinant ScNRK1

2.8 重組ScNRK1的動力學(xué)參數(shù)

重組ScNRK1對NR有很高的催化效率，其Kcat和Kcat/Km值分別為63.28 s-1和1.17 L/（mmol·s）。同樣，其對ATP也表現(xiàn)出較高的催化效率，其Kcat和Kcat/Km值分別為92.96 s-1和1.71 L/（mmol·s），表明重組ScNRK1在NMN的酶法合成中具有重要潛力，對降低合成過程中酶的使用成本具有重要的意義。

2.9 NMN的生物合成

如圖9所示，已有部分NR（4.01 min）轉(zhuǎn)化成煙酰胺核苷酸（2.79 min）。6 mmol/L的NR用上述方法得到反應(yīng)進程曲線，如圖10所示，表明離理論得率仍有一定的差距[19]，在后續(xù)研究中仍需對反應(yīng)條件進行系統(tǒng)的優(yōu)化。但這種一步酶法反應(yīng)節(jié)約了一定的反應(yīng)時間[9,17]。

圖9 NMN反應(yīng)液相色譜圖Fig.9 Liquid chromatogram of NMN reaction products

圖10 NMN的反應(yīng)進程Fig.10 Evolution of NMN yield during the reaction process

3 討論

NMN是公認NAD+生物合成中間體的一種核苷酸[11]，是食品、化妝品、保健品的研究熱點[9]。采用基因組挖礦技術(shù)，可以快速地將假定酶變?yōu)檎鎸嵜福瑸樯锎呋峁└嗟倪x擇[32]。

本研究從釀酒酵母中克隆出NRK基因片段，再借助pET28a質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中實現(xiàn)高水平的可溶性表達，酶活力測定結(jié)果表明，BL21（DE3）/pET28a-ScNRK1發(fā)酵液中NRK活力達14.75 U/mL，純化后重組ScNRK1比活力為2252.59 U/mg，其表達水平和比活力均顯著高于已報道的水平[7]。表明從釀酒酵母中挖掘的NRK有一定優(yōu)勢。溫度特性結(jié)果表明，釀酒酵母來源NRK的最適溫度為30 ℃，且穩(wěn)定性差，這與之前的報道相同[30]，這都限制了NMN的工業(yè)化生產(chǎn)。接下來將對NRK進一步分子改造、表達宿主的優(yōu)選。最后對底物NR進行催化生成NMN進行研究，雖然離理論得率仍有一定的差距[19]，但反應(yīng)節(jié)約了反應(yīng)時間，為更快生產(chǎn)NMN奠定了基礎(chǔ)。