楊 平，徐彩紅，徐 昕，王麗娟，朱 旺，李佳美，孟憲軍，許 青,

（1.沈陽師范大學(xué)學(xué)前與初等教育學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；3.沈陽師范大學(xué)實驗技術(shù)中心，遼寧 沈陽 110034；4.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

微凝膠是尺寸在微米級及以下，由天然生物大分子構(gòu)成的多孔三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有高比表面積、多孔、易變形等優(yōu)點，在食品乳化、功能性物質(zhì)荷載與遞送等方面具有廣泛應(yīng)用前景，是近年來食品科學(xué)研究的熱點[1]。

蛋白質(zhì)作為兩親性分子，具有高度的聚集性和良好的膠凝性[2-3]，在一定的酸和熱誘導(dǎo)下，可以自組裝成多種形貌的凝膠結(jié)構(gòu)，如牛奶中的酪蛋白和乳清蛋白、蛋清蛋白、膠原蛋白等均可自組裝成微凝膠[4]。大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）作為天然大分子材料，來源廣泛、價格低廉，疏水性氨基酸含量較高，極性和帶電殘基比例大，是制備食品微凝膠的理想原料。

自組裝是基礎(chǔ)粒子由無序到有序轉(zhuǎn)變的過程，是一種制備具有吸引特性新粒子的新技術(shù)[5]。蛋白質(zhì)的自組裝是分子內(nèi)和分子間吸引力/排斥力的平衡所控制，自主裝作用力的大小不僅與蛋白質(zhì)自身組成、結(jié)構(gòu)有關(guān)，還與其所存在環(huán)境密切相關(guān)[6]。酸性偏移時蛋白質(zhì)處于變性與未變性之間的熔球態(tài)，其氨基酸殘基具有較高的凈電荷[7]，電荷間的排斥力促使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，微環(huán)境的變化使其經(jīng)歷去折疊、亞基解離以及再聚集過程，重新自組裝成微米顆粒[8]，Jiang Jiang等[9]研究發(fā)現(xiàn)酸性偏移可以改變大豆蛋白結(jié)構(gòu)，提高其乳化性；李次力等[10]發(fā)現(xiàn)酸性偏移使大豆親脂蛋白發(fā)生自組裝；熱誘導(dǎo)能提供的額外分子間斥力，改變蛋白質(zhì)暴露出的官能團(tuán)，提高蛋白質(zhì)顆粒的表面疏水性，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[11]和功能[12]，乳清蛋白經(jīng)過高溫可形成穩(wěn)定性高、耐熱性好的球形網(wǎng)狀微凝膠[13]，王健等[14]發(fā)現(xiàn)酸性偏移能增加SPI在加熱過程中的柔性，使其結(jié)構(gòu)更加舒展。蛋白質(zhì)變性程度不同，會導(dǎo)致其表面氨基酸組成、電荷分布的差異，進(jìn)而形成不同的微凝膠結(jié)構(gòu)，不同蛋白質(zhì)改性方法相結(jié)合，可以更加精準(zhǔn)的定向調(diào)控蛋白質(zhì)變性程度。因此，本研究通過酸性偏移結(jié)合熱誘導(dǎo)對蛋白質(zhì)進(jìn)行膠凝化改性，探究熱誘導(dǎo)溫度對微凝膠結(jié)構(gòu)及其特性的影響，精準(zhǔn)調(diào)控蛋白質(zhì)的自組裝，為合理開發(fā)植物蛋白微凝膠提供理論支持和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粕（純度94.2%）山東禹王實業(yè)有限公司；硫磺素T（thioflavin-T，ThT）、8-苯氨基萘-1-磺酸（8-phenylaminonaphthalene-1-sulfonic acid，ANS）美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

F97 Pro熒光分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；VEC-TOR33傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀、Dimension Icon原子力顯微鏡 德國Bruker公司；DSC 200 F3差示掃描量熱儀德國耐馳公司；S3500激光粒度分析儀 美國Microtrac公司；FE28 pH計 梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；Scientz-12N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；X-12R高速冷凍離心機 美國Beckman公司；3150紫外-可見分光光度計 日本島津公司；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器 上海力辰邦西儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的提取

采用堿溶酸沉方法提取SPI，用10 倍質(zhì)量的去離子水溶解低溫脫脂豆粕粉，調(diào)節(jié)pH值至8.0、室溫（25 ℃）攪拌2 h后，8000 r/min離心20 min，取上清液。再調(diào)節(jié)pH值至4.6，4 ℃靜置1 h后，上述條件再次離心，用2 mol/L NaOH溶液攪拌至沉淀充分溶解，調(diào)節(jié)pH值至7.0，4 ℃透析48 h，冷凍干燥后備用。

1.3.2 大豆分離蛋白微凝膠（soy protein isolate microgel，SPIM）制備

參考Li Ting等[15]方法稍作修改。用超純水配制10 mg/mL的SPI溶液，4 ℃水化過夜，3 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2.0，15000 r/min離心15 min，取上清液。經(jīng)6～8 kDa透析袋透析24 h后，稀釋至2 mg/mL，在不同溫度（25、45、55、65、75、85 ℃）條件下，以200 r/min恒溫攪拌12 h后4 ℃冷卻，得到SPIM初始液，冷凍干燥后保存。不同溫度下制備的微凝膠，分別記作25SPIM、45SPIM、55SPIM、65SPIM、75SPIM、85SPIM。

1.3.3 ThT熒光光譜分析

參考Gharanjig等[16]方法稍加修改。取質(zhì)量濃度為2 mg/mL SPIM樣品溶液40 μL，經(jīng)過0.24 μm濾膜過濾，與4 mL ThT工作液（0.4 mg/mL）充分混合后，進(jìn)行熒光光譜分析。設(shè)定激發(fā)波長為440 nm，發(fā)射波長為488 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫為5 nm。

1.3.4 二級結(jié)構(gòu)測定

取1～2 mg凍干的樣品與200 mg KBr充分研磨混勻，150 MPa加壓5 min后，F(xiàn)TIR掃描樣品[17]，掃描范圍為4000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。PeakFit 4.12軟件分析酰胺I帶（1600～1700 cm-1），用峰面積比率表示蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的相對含量。

1.3.5 表面疏水性分析

采用ANS法[18]進(jìn)行分析。取4 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的樣品與20 μL的8 mmol/L ANS充分混合，避光反應(yīng)10 min后進(jìn)行熒光分析，設(shè)定激發(fā)波長為365 nm，發(fā)射波長為484 nm。

1.3.6 粒度測定

取4 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的樣品，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，采用激光粒度分析儀測定樣品粒度，將樣品累計粒度分布達(dá)到10%、50%、90%時的粒度值，分別記作Dx（10）、Dx（50）、Dx（90）。

1.3.7 差示掃描量熱分析

稱取50 μL質(zhì)量濃度為20 mg/mL的樣品，置于密封坩堝中，設(shè)定加熱溫度為20～200 ℃，升溫速率為10 ℃/min，利用差示掃描量熱儀自帶的軟件，計算變性溫度（Tm）和焓變（ΔH）。

1.3.8 微觀結(jié)構(gòu)觀察

采用原子力顯微鏡輕敲模式觀察樣品的微觀形貌，設(shè)定頻率為320 kHz，掃描速率為1 Hz，silicon tips長度為125 μm，曲率半徑為42 N/m。

1.3.9 乳化性分析

參考栗俊廣等[19]方法，并作適當(dāng)修改。取50 μL質(zhì)量濃度為10 mg/mL的SPIM樣品與5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液充分混勻，用紫外分光光度計于500 nm波長處測定吸光度。按照下式計算乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsion stability index，ESI）：

式中：ρ為SPIM質(zhì)量濃度/（g/mL）；φ為油相體積分?jǐn)?shù)（20%）；A0和A10為靜置時間為0 min和10 min的吸光度。

1.3.10 持水性的測定

準(zhǔn)確稱取2 g的SPIM于離心管中，4 ℃、8000 r/min離心15 min后，稱量沉淀的質(zhì)量，按下式計算凝膠持水率：

式中：m1為離心前SPIM的質(zhì)量/g；m2為離心后SPIM的質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，單因素方差分析，實驗數(shù)據(jù)用表示，P＜0.05，差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義，并采用Origin 2019軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ThT熒光分析結(jié)果

ThT可以與蛋白質(zhì)中β-折疊結(jié)構(gòu)特異結(jié)合，β-折疊相對含量越多則ThT熒光強度越強[20]。圖1顯示，與25SPIM相比，酸性偏移結(jié)合熱誘導(dǎo)后SPIM的熒光強度增加，其中75SPIM和85SPIM的熒光強度最大，這可能由于酸性偏移環(huán)境使SPI表面呈現(xiàn)大量正電荷，分子間的靜電斥力增加，而酸性偏移結(jié)合熱誘導(dǎo)后，蛋白質(zhì)體積發(fā)生一定程度的膨脹，使其表面靜電荷密度相對降低，分子間靜電斥力減小，部分結(jié)構(gòu)互相靠近形成β-折疊結(jié)構(gòu)[21]。

圖1 SPIM的形成動力學(xué)曲線Fig.1 Kinetic curves of SPIM formation

從圖1還可以看出，SPIM形成動力學(xué)曲線的最初2 h內(nèi)熒光強度增長速率最快，而后速率逐漸減緩，在4～12 h處熒光強度達(dá)到最高并保持平穩(wěn)。SPIM形成初期（0～4 h），樣品ThT熒光強度增大，可能是由于酸性偏移結(jié)合熱誘導(dǎo)后蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變[22]，呈現(xiàn)“折疊-去折疊-復(fù)折疊”的變化，β-折疊相對含量增加[23]。平衡階段（4～12 h），樣品ThT熒光強度保持平穩(wěn)，表明蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變基本完成，β-折疊相對含量穩(wěn)定，此階段以β-折疊作為自組裝的“構(gòu)建單元”，相互交聯(lián)形成微凝膠[15]。

2.2 二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

FTIR可以分析不同熱誘導(dǎo)溫度對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響，以及微凝膠形成前后結(jié)構(gòu)的變化。如圖2所示，25SPIM的酰胺I帶特征峰在1635 cm-1，酰胺II帶在1535 cm-1，而微凝膠形成后酰胺I帶的特征峰紅移至1610 cm-1附近，酰胺II帶的特征峰紅移至1525 cm-1附近，酰胺A帶（3000～3600 cm-1）吸收峰的強度和位置也發(fā)生改變，這表明靜電作用、疏水作用、氫鍵作用[24]參與了SPIM的自組裝。

圖2 SPIM的FTIR圖Fig.2 Fourier transform infrared spectra of SPIM

二級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的基礎(chǔ)，當(dāng)α-螺旋/β-折疊比值降低時蛋白質(zhì)的有序性會增加，結(jié)構(gòu)變得疏松而有序、柔性增加[25]，當(dāng)β-折疊相對含量增加、β-轉(zhuǎn)角相對含量降低時，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性會增加[26]。通過PeakFit軟件去卷積擬合FTIR的酰胺I帶，可以定量評價蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分類和比例，其中β-折疊、無規(guī)卷曲、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)對應(yīng)波數(shù)分別為1610～1639、1640～1649、1650～1659、1660～1700 cm-1[27]。去卷積擬合后得到的各類二級結(jié)構(gòu)占比（圖3），可見隨著溫度升高β-轉(zhuǎn)角相對含量逐漸減少，β-折疊相對含量逐漸增加，α-螺旋/β-折疊比值逐漸降低，其中75SPIM和85SPIM組的比值最小，均約為0.23，比25SPIM組降低了48.89%，這表明酸性偏移結(jié)合熱誘導(dǎo)增加了SPIM的柔性和穩(wěn)定性。

圖3 SPIM的二級結(jié)構(gòu)組成Fig.3 Secondary structure composition of SPIM

2.3 表面疏水性分析結(jié)果

疏水相互作用是維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的主要作用力，表面疏水性指數(shù)可以表征蛋白質(zhì)分子表面疏水基團(tuán)的相對含量，是評價蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的重要參數(shù)[28]。圖4顯示，酸性偏移結(jié)合熱誘導(dǎo)后，SPIM表面疏水性指數(shù)隨著溫度升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中65SPIM表面疏水性指數(shù)最大，顯著高于其他各組（P＜0.05），比25SPIM增加了43.98%。這可能是由于酸性偏移結(jié)合熱誘導(dǎo)會加速蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)解折疊，使其內(nèi)部疏水性基團(tuán)暴露，ANS熒光探針結(jié)合位點增多[29]；但當(dāng)熱誘導(dǎo)溫度大于65 ℃時，大量疏水基團(tuán)暴露于蛋白分子表面，疏水效應(yīng)使疏水基團(tuán)彼此靠近，蛋白質(zhì)分子重新聚集，表面疏水性指數(shù)降低。

圖4 SPIM的表面疏水性Fig.4 Surface hydrophobicity of SPIM

2.4 粒度分析結(jié)果

粒度分析可以闡明蛋白質(zhì)聚集行為對其凝膠特性的影響。酸性偏移結(jié)合熱誘導(dǎo)后樣品的粒度分析結(jié)果如圖5、表1所示，各組樣品的粒度均在1000 nm以下，屬于微凝膠顆粒。如圖5所示，25SPIM粒度呈三峰分布，與其相比，45SPIM粒度分布3 個峰均左移，粒度變??；當(dāng)熱誘導(dǎo)溫度大于55 ℃時，SPIM粒度分布轉(zhuǎn)為單峰，峰形態(tài)趨近于正態(tài)分布，表明酸性偏移結(jié)合熱誘導(dǎo)改變了蛋白質(zhì)的形態(tài)。表1顯示，當(dāng)熱誘導(dǎo)溫度大于55 ℃時，隨著溫度的升高Dx（50）值逐漸增加，這可能是由于自組裝是熱力學(xué)平衡條件下進(jìn)行的分子重排過程，熱誘導(dǎo)使自組裝的“構(gòu)建單元”運動加劇，有效碰撞機率增加，導(dǎo)致了平均粒度的增加。表1還顯示，隨著熱誘導(dǎo)溫度升高，比表面積逐漸增加，其中75SPIM的比表面積最大，為25SPIM的9.26 倍，顯著高于其他各組（P＜0.05），但當(dāng)溫度大于75 ℃時，SPIM比表面積降低，表明熱誘導(dǎo)溫度過高不利于其比表面積的繼續(xù)增加。

表1 SPIM的粒度和比表面積Table 1 Particle size and specific surface area of SPIM

圖5 SPIM的粒度分布Fig.5 Particle size distribution of SPIM

2.5 差示掃描量熱分析結(jié)果

差示掃描量熱法可以分析熱誘導(dǎo)引起的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化。Tm值為熱變性過程中，蛋白質(zhì)中折疊狀態(tài)和去折疊狀態(tài)的含量相等時的溫度，其值越大蛋白質(zhì)越穩(wěn)定；ΔH表示蛋白質(zhì)變性需要的能量，ΔH增大則需要更多的能量使蛋白質(zhì)去折疊，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更緊湊[30]。表2顯示，酸性偏移結(jié)合熱誘導(dǎo)后，隨溫度升高樣品的Tm和ΔH值呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，其中55SPIM的Tm和ΔH值最低，75SPIM和85SPIM最高。這可能是由于酸性偏移結(jié)合低溫?zé)嵴T導(dǎo)引起了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解折疊，熱穩(wěn)定性較低，而隨著熱誘導(dǎo)溫度繼續(xù)升高，蛋白質(zhì)自組裝成結(jié)構(gòu)緊湊的微凝膠，熱穩(wěn)定性增加。

表2 SPIM的變性溫度和焓變值Table 2 Denaturation temperature and enthalpy change of SPIM

2.6 微觀形態(tài)觀察結(jié)果

圖6顯示酸性偏移結(jié)合不同溫度熱誘導(dǎo)后，SPIM微觀形態(tài)發(fā)生了明顯變化。25SPIM呈現(xiàn)球狀結(jié)構(gòu)，顆粒大小均勻；45SPIM球狀結(jié)構(gòu)部分消失，顆粒大小不均勻，出現(xiàn)細(xì)小的顆粒樣結(jié)構(gòu)；55SPIM呈現(xiàn)長度較短的棒狀結(jié)構(gòu)；65SPIM呈現(xiàn)樹形聚集物，分枝細(xì)長；75SPIM和85SPIM凝膠結(jié)構(gòu)相似，都具有網(wǎng)狀的微觀結(jié)構(gòu)。這可能由于酸性偏移結(jié)合低溫?zé)嵴T導(dǎo)時，自組裝的“構(gòu)建單元”濃度較低，其端基相連成棒狀結(jié)構(gòu)[31]，隨著熱誘導(dǎo)溫度升高，“構(gòu)建單元”濃度增加，聚集成為空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。由圖6還可見，75SPIM的孔徑較均勻且規(guī)則，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)連續(xù)，而85SPIM部分網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)連續(xù)部分中斷，孔徑大小不一，出現(xiàn)熱誘導(dǎo)過度現(xiàn)象。

圖6 SPIM的微觀形態(tài)Fig.6 Microscopic morphology of SPIM

2.7 EAI及ESI分析結(jié)果

如圖7所示，隨著熱誘導(dǎo)溫度的升高，樣品的EAI和ESI呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。75SPIM的EAI及ESI顯著高于其他各組（P＜0.05），分別為87.17 m2/g和65.55%，較25SPIM分別提高了30.87%和85.54%，這可能由于SPIM二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋/β-折疊比值降低，凝膠柔性升高，利于蛋白-界面相互作用，可以承受更高的外界干擾，乳液的穩(wěn)定性提高[32]。與75SPIM相比，85SPIM的EAI及ESI顯著降低（P＜0.05），這可能與其微觀結(jié)構(gòu)的孔徑大小不均勻、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不連續(xù)、比表面積減小、吸附能力下降有關(guān)。

圖7 SPIM的EAI和ESIFig.7 EAI and ESI of SPIM

2.8 持水性分析結(jié)果

微凝膠的持水性可以反映其空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的緊密程度。圖8顯示，隨著熱誘導(dǎo)溫度升高，微凝膠持水性呈現(xiàn)階段性變化，其中25～55 ℃階段，隨著溫度的升高，持水率呈現(xiàn)增加的趨勢，即55SPIM持水性最高，這表明熱誘導(dǎo)增加了微凝膠吸附和結(jié)合水的能力，且具有較強的穩(wěn)定性和抗干擾能力。55～85 ℃階段，持水性呈現(xiàn)降低的趨勢，這可能與其微觀結(jié)構(gòu)較緊密，基質(zhì)中存在未結(jié)合的過量水，離心后這些水被釋放出來有關(guān)[33]。本研究持水率的變化與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋相對含量變化趨勢一致。

圖8 SPIM的持水性Fig.8 Water-holding capacity of SPIM

3 結(jié)論

通過酸性偏移結(jié)合熱誘導(dǎo)對SPI進(jìn)行膠凝化改性，對比熱誘導(dǎo)溫度對SPIM結(jié)構(gòu)及其凝膠特性的影響，發(fā)現(xiàn)適度的熱誘導(dǎo)能使SPI自組裝成孔徑大小均勻的網(wǎng)狀微凝膠。結(jié)果表明，酸性偏移結(jié)合熱誘導(dǎo)提高了蛋白質(zhì)中β-折疊相對含量，靜電相互作用、疏水相互作用、氫鍵作用參與了微凝膠的自組裝。隨著熱誘導(dǎo)溫度升高，SPIM的表面疏水性指數(shù)先上升后下降，熱穩(wěn)定性逐漸增強。與25SPIM相比，75SPIM的比表面積增加，乳化活性、乳化穩(wěn)定性增強，持水性升高。綜上所述，酸性偏移結(jié)合熱誘導(dǎo)是一種調(diào)控蛋白質(zhì)微凝膠結(jié)構(gòu)和特性的有效方法，通過精準(zhǔn)控溫可以提升微凝膠的質(zhì)量。