陳 旭,馮雅梅,蔡茜茜,伍久林,黃建聯(lián),汪少蕓,
(1.福州大學生物科學與工程學院,福建 福州 350108;2.福州海洋研究院海洋食品研發(fā)中心,福建 福州 350108;3.福建省冷凍調理水產品加工重點實驗室,福建 廈門 361022;4.安井食品集團股份有限公司,福建 廈門 361022)
肌原纖維蛋白(myofibrillar protein,MP)是肌肉中具有重要生物學功能的鹽溶性蛋白質,其熱誘導凝膠特性是影響凝膠類肉糜制品品質的決定因素。相比于其他肉糜類凝膠,魚糜凝膠性能往往較差,通過添加不同多糖,如淀粉、親水膠體、膳食纖維等形成復合凝膠,可改善魚糜凝膠特性[1]。薏米俗稱“藥王米”,具有免疫調節(jié)、降血糖、抗炎等功效,再加上其藥食同源性的特點,使薏米的研究與開發(fā)備受關注,其中薏米淀粉(coix seed starch,CSS)占薏米質量的60%左右[2]。CSS作為一種新型的小顆粒淀粉資源,由于顆粒的結構、直鏈和支鏈淀粉含量、溶脹特性、糊化特性等特性,使其在工業(yè)應用中發(fā)揮獨特的作用[3]。NaCl是生產以鹽溶MP凝膠為基礎的魚糜產品的必要條件,但考慮到Na+攝入過多會導致高血壓、心血管疾病等健康問題,因此采取降低NaCl含量策略以改善魚糜產品的健康特性[4]。但在加工過程中,直接降低NaCl含量可能導致魚糜凝膠的劣化。為了在低鈉鹽條件下仍能保持魚糜凝膠特性,可用一些對人體有益的陽離子來替代部分Na+,如利用K+、Mg2+、Ca2+等,以維持或改善魚糜的凝膠性質,使魚糜產品更適合食用。因此,本研究旨在探究CaCl2、MgCl2和KCl替代NaCl后,其對低鈉鹽CSS-MP復合凝膠特性的影響,以期為開發(fā)低鈉鹽復合魚糜凝膠制品提供理論參考。
冷凍真鯛魚為福建省水產研究所提供。CSS為實驗室提取制備。
氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、五水合硫酸銅、乙二胺四乙酸 西隴科學有限公司;過硫酸銨 中國醫(yī)藥集團有限公司。
HH-S6數顯恒溫水浴鍋 河南金博儀器制造有限公司;FJ 300-SH高速分散均質機 上海滬析實業(yè)有限公司;WSD-3A色差計 北京康光光學儀器有限公司;LYNX6000高速離心機、Multiskan FC多功能酶標儀德國Thermo Fisher Scientific公司;MCR302旋轉流變儀奧地利安東帕有限公司;Fluoromax-4熒光光譜儀HORIBA科學儀器事業(yè)部;TS-5000Z電子舌 日本Insent公司;PEN3.5電子鼻 德國AIRSENSE公司。
1.3.1 MP的提取
參考陳旭等[4]方法。以魚肉-緩沖液料液比1∶4(g/mL)混合(緩沖液含0.1 mol/L NaCl、10 mmol/L 磷酸鹽、1 mmol/L乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸、2 mmol/L MgCl2,pH 7.0)。用均質機均質分散60 s并于4 ℃、6000×g離心,收集沉淀。重復上述操作3 次。再將得到的沉淀懸浮于0.1 mol/L NaCl溶液中均質、離心洗滌3 次后即得實驗用MP。所有操作過程均在低溫(0~4 ℃)進行。最終獲得的MP于4 ℃貯存?zhèn)溆茫?8 h內用完。利用雙縮脲法測定MP濃度。
1.3.2 CSS的提取
參考Cardoso等[5]的方法提取,利用冷凍干燥機進行凍干,得實驗用CSS。
1.3.3 低鈉鹽CSS-MP復合凝膠的制備
取上述提取的MP,在CaCl2、MgCl2和KCl最佳添加量的單因素研究基礎之上[6],分別用添加不同量的氯鹽配制成對照組(3% NaCl)、CaCl2替代組(2.0% NaCl+1.0%CaCl2)、MgCl2替代組(2.5% NaCl+0.5% MgCl2)、KCl替代組(1.5% NaCl+1.5% KCl),并將各組MP質量濃度固定為120 mg/mL,即為不同鹽離子含量的MP溶液。再分別向對照組和不同氯鹽替代組添加4% CSS,充分攪拌均勻后,即得低鈉鹽CSS-MP復合溶膠。將復合溶膠置于25 mL的燒杯中并在80 ℃水浴30 min形成凝膠,之后立即置于冰水浴中冷卻至室溫(24~26 ℃),在4 ℃放置12 h后,再進行指標檢測。
1.3.4 凝膠強度的測定
參考Zhuang Xinbo等[7]的方法測定。將CSS-MP復合凝膠切割成邊長為2 cm左右的正方體。測試參數:直徑0.5 cm的圓柱型探頭,測前速率2.0 mm/s,測中速率1.0 mm/s,測后速率2.0 mm/s,觸發(fā)力5 g。以最大觸發(fā)力作為凝膠強度值。
1.3.5 持水力的測定
參考Yang Kun等[8]用離心法測定。將復合凝膠置于50 mL離心管中,稱量為m1。4 ℃、6000×g離心30 min,將離心管倒轉,用濾紙吸去殘留水,稱量為m2。記錄空離心管質量m0。持水力按式(1)計算:
1.3.6 流變學特性測定
參考Zhou Tiantian等[9]的方法。設置流變儀為振蕩模式,使用50 mm平行板,將低鈉鹽CSS-MP復合溶膠樣品分別置于上下板間距為1 mm的空隙中,硅油覆蓋在板的邊緣。測試頻率為1 Hz,應變?yōu)?%。以恒定的升降溫速率進行動態(tài)溫度梯度掃描測試,記錄樣品升溫-恒溫-降溫全過程的儲能模量(G’)和損耗模量(G”)的變化。
1.3.7 表面疏水性的測定
根據結合的疏水發(fā)色團溴酚藍(bromophenol blue,BPB)含量確定MP的表面疏水性[10]。參考陳旭等[4]樣品處理方法,用含有不同濃度的氯鹽溶液等比例稀釋CSS-MP復合溶液。取1 mL稀釋后的樣液與0.2 mL BPB(1 mg/mL)混合后旋渦振蕩10 min。6000×g離心15 min后取上清液,稀釋10 倍,通過595 nm紫外掃描分光光度計檢測BPB結合情況確定MP的表面疏水性。按式(2)計算:
1.3.8 巰基含量的測定
參考陳旭等[4]方法。取0.5 mL的樣液(MP質量濃度為5 mg/mL),加入4.5 mL緩沖液(含8 mol/L尿素、0.01 mol/L乙二胺四乙酸、0.1 mol/L磷酸二氫鈉)和100 μL Ellman試劑(0.01 mol/L 5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、0.01 mol/L磷酸二氫鈉)。充分混合反應,于波長412 nm處測定吸光度。除使用無尿素緩沖液外,活性巰基含量的測定方法如上所述。巰基含量按式(3)計算:
式中:A412nm為樣品在412 nm處的吸光度;D為稀釋倍數;C為MP質量濃度/(mg/mL);13600為摩爾消光系數(L/(mol·cm))。
1.3.9 同步熒光光譜分析
參照Pan Xingren等[11]的方法,將MP溶液稀釋為1 mg/mL,然后使用熒光光譜儀進行測定。激發(fā)波長為295 nm,狹縫寬為2.5 nm,波長掃描范圍為300~450 nm。設置激發(fā)波長和發(fā)射波長的波長差Δλ為15 nm和60 nm。
1.3.10 掃描電子顯微鏡分析
參考Wang Limei等[12]方法,凝膠樣品用3%戊二醛溶液固定24 h,磷酸鹽緩沖液漂洗3 次,然后用35%、50%、75%、85%、95%和100%乙醇溶液進行梯度脫水,再利用冷凍干燥機對凝膠樣品進行凍干。將凍干樣品鍍上一層金,置于掃描電子顯微鏡臺上觀察。
1.3.11 感官評分
參考宋春勇[13]和任佳懌等[14]方法,選擇在校的食品專業(yè)學生對凝膠樣品進行感官評分。評價指標包括色澤、氣味、滋味和組織形態(tài)。
1.3.12 電子鼻分析
參考陳小冬等[15]方法,用分析天平稱量10.0 g凝膠樣品裝入容量為30 mL的頂空瓶中,在室溫下靜置平衡1 h后,進行電子鼻分析。
1.3.13 電子舌分析
參考楊峰等[16]方法,取30.0 g凝膠樣品,加入200 mL去離子水,用高速均質機勻漿5 min,之后于4 ℃,8000×g離心15 min,取上清液過濾成無沉淀無油液體,收集濾液進行電子舌檢測分析。
采用IBM SPSS Statistics 20對結果進行統(tǒng)計分析,通過Duncan多重范圍檢驗進行方差分析確定均值之間的差異顯著性,結果以表示,P<0.05,差異顯著,采用Origin 2018軟件進行作圖。
如圖1所示,與對照組的凝膠強度179.8相比,CaCl2、MgCl2和KCl替代組的凝膠強度分別降低至178.4、164.8和172.3。相比之下,含有1.0% CaCl2的復合凝膠表現(xiàn)出較好的凝膠強度,與對照組相比無顯著差異。這可能與低濃度NaCl不利于MP的展開有關,因為低鈉鹽會抑制肌球蛋白從致密結構中溶出,并且Ca2+、Mg2+、K+的存在可能導致MP的水結合能力較弱,不利于蛋白質與蛋白質、蛋白質-多糖之間的相互作用,最終影響了蛋白質的結合性能,降低了CSS-MP復合凝膠的質地特性[17]。Ge Ge等[18]發(fā)現(xiàn)當KCl取代量為25%時,凝膠強度顯著增強(P<0.05),而當KCl取代量為50%時,凝膠強度降低,表明低濃度K+能促進MP的展開,而過高濃度的K+則會對凝膠強度產生不利影響。S—S鍵和疏水相互作用有助于形成穩(wěn)定、不可逆、規(guī)則的凝膠網絡。然而,不同鹽離子引起過度的相互作用會導致蛋白質聚集,阻礙肌球蛋白的交聯(lián),使凝膠強度降低。雖然有文獻報道Ca2+會導致蛋白質結構發(fā)生改變,對MP的凝膠強度產生消極影響[19],但適量的Ca2+替代Na+對MP的凝膠強度影響不顯著。
圖1 氯鹽對低鈉鹽CSS-MP復合凝膠強度和持水力的影響Fig.1 Effect of different chloride salts on the strength and WHC of low sodium CSS-MP composite gel
低鈉鹽條件下復合凝膠的持水力均有所降低,與凝膠強度具有相似的變化趨勢,說明凝膠強度與持水力密切相關。與KCl替代組相比,CaCl2替代組和MgCl2替代組持水力顯著低于對照組(P<0.05)。這與Zheng Jiabo等[20]的研究結果類似。由于鹽離子與蛋白質的強結合作用,NaCl可激活蛋白質,對于MP凝膠的持水能力有著重要的作用,而Mg2+和Ca2+的存在阻止了Cl-滲透到蛋白質分子中,對蛋白質的持水能力產生負面影響[19-21]。此外,不同鹽對MP構象的影響不同,如K+比Na+具有更弱的電場和更低的靜電作用,這可能導致肌球蛋白的溶解度和總蛋白的理化性質不同[22],最終影響了蛋白凝膠的持水能力。
G’值表示黏彈性材料在變形過程中的存儲能量,反映了試樣的彈性特性[23]。熱誘導MP凝膠網絡的形成是一個多步驟的過程,包括蛋白質變性或天然蛋白質空間結構的部分展開,然后通過形成二硫鍵或非共價鍵的相互作用進行聚集,包括靜電、氫鍵和疏水相互作用等[24]。由圖2可知,在25~80 ℃的升溫階段,CaCl2和MgCl2替代組與對照組的凝膠行為不同。對照組的G’值最初增長緩慢,在38.4 ℃時達到峰值,隨后迅速下降到49.7 ℃時的最小值,這與疏水相互作用和二硫鍵的形成有關。進一步加熱至80 ℃后,G’值又迅速增加,而CaCl2和MgCl2替代組則相反,在50~80 ℃的加熱過程中,G’顯著下降(P<0.05)。G’的增加表明MP凝膠化或彈性蛋白網絡開始形成,對照組、CaCl2、MgCl2、KCl替代組在32.1、30.5、31.6 ℃和31.2 ℃時開始形成凝膠。在升溫階段,與Na+和K+相比,Ca2+和Mg2+的存在大大降低了G’,這可能是由于不同鹽離子對MP溶解性的差異,而KCl滲透可以增強G’,因為它的擴散速度比其他鹽更快[22]。另外,鹽離子也會影響蛋白質分子間的靜電相互作用,從而影響熱成膠過程中蛋白質-蛋白質、淀粉-蛋白質之間的相互作用,導致流變學性質的變化[25]。在恒溫(80 ℃)和降溫階段(80~25 ℃),大量氫鍵的形成加強了凝膠網絡,不同處理組的G’顯著升高,最終CaCl2替代組復合凝膠的流變特性明顯優(yōu)于對照組和MgCl2、KCl替代組。原因可能是在CSS-MP復合凝膠體系中,Ca2+的添加有利于在已形成的凝膠網絡基礎上,進一步促進蛋白聚集交聯(lián),使凝膠網絡結構變得更加致密有序。這與前面觀察到的凝膠質構特性趨勢一致。
圖2 氯鹽對低鈉鹽CSS-MP復合凝膠G’的影響Fig.2 Effect of different chloride salts on the storage modulus (G’) of low sodium CSS-MP composite gel
如圖3所示,不同氯鹽部分替代NaCl對CSS-MP復合凝膠表面疏水性有顯著的影響(P<0.05)。CaCl2替代組和MgCl2替代組的表面疏水性顯著高于對照組,而KCl替代組的表面疏水性顯著低于對照組(P<0.05)。二價金屬離子會導致蛋白質結構發(fā)生改變,促進蛋白分子鏈的伸展,使包埋在蛋白質內部的疏水性基團暴露于分子表面,因而增大了蛋白質表面疏水性[26]。但經過KCl的替代后表面疏水性下降,原因可能是K+使蛋白質內部疏水基團的卷曲度發(fā)生改變,促進了MP的聚集。不同氯鹽與MP分子側鏈形成“鹽橋”,促進蛋白分子的展開,使得疏水性氨基酸暴露,基團暴露程度的不同可能會對CSS與MP的相互作用產生影響,進而引起復合體系在熱誘導過程中發(fā)生分子聚集作用,最終引起CSS-MP復合凝膠功能特性的改變。
圖3 氯鹽對低鈉鹽CSS-MP復合凝膠表面疏水性的影響Fig.3 Effect of different chloride salts on the surface hydrophobicity of low sodium CSS-MP composite gel
巰基對于蛋白質空間結構的穩(wěn)定性有重要作用。如圖4所示,與對照組相比,CaCl2替代組和MgCl2替代組的總巰基含量顯著降低(P<0.05),KCl替代組的總巰基含量無顯著差異??値€基明顯減少,說明Ca2+和Mg2+的加入使未展開的蛋白質重新排列并與其他分子相互作用,這一結果表明,CaCl2和MgCl2的替代有助于CSS和MP相互作用形成二硫鍵。陳立德[27]研究也表明Mg2+和Ca2+的添加有利于促進豬肉MP熱誘導成膠時二硫鍵的生成。但不同氯鹽替代NaCl后,復合凝膠的活性巰基含量均顯著下降(P<0.05)?;钚詭€基含量的減少主要是由于蛋白質表面活性基團的嵌入,或通過生成二硫鍵將暴露的分子間基團氧化所致[28],這與Zhang Ziye等[29]的研究結果類似。
圖4 氯鹽對低鈉鹽CSS-MP復合凝膠巰基含量的影響Fig.4 Effect of different chloride salts on sulfhydryl group content of low sodium CSS-MP composite gel
同步熒光光譜已被廣泛應用于揭示蛋白質配體相互作用,利用同步熒光光譜提供的信息可以反映色氨酸殘基(Trp)和酪氨酸殘基(Tyr)周圍微環(huán)境的變化[30]。如圖5所示,不同氯鹽替代NaCl后均發(fā)生了熒光猝滅現(xiàn)象,其中KCl替代組,CaCl2替代組和MgCl2替代組的同步熒光強度依次降低,說明疏水分子與MP的結合導致了發(fā)色團在溶液環(huán)境中的暴露更大,熒光強度降低[31]。并且在Δλ=60 nm時,Trp殘基的發(fā)射峰表現(xiàn)出輕微的藍移,最大熒光發(fā)射峰從對照組的348 nm到CaCl2替代組的344 nm,MgCl2替代組的343 nm和KCl替代組的349 nm,這表明Ca2+、Mg2+、K+的加入,使Tyr和Trp殘基周圍微環(huán)境的極性降低,疏水性增強,這與表面疏水性測定結果一致。此外,Trp殘基的熒光強度要強于Tyr殘基,這表明Trp殘基對低鈉鹽復合凝膠中MP猝滅固有熒光的貢獻更大[32]。同步熒光結果表明,CSS可能主要通過疏水相互作用與MP蛋白分子形成復合物,而CaCl2、MgCl2和KCl的替代在一定程度上影響兩者的相互作用,進而影響蛋白質結構,最終增強MP的熱穩(wěn)定性。
圖5 氯鹽對低鈉鹽CSS-MP復合凝膠同步熒光的影響Fig.5 Effect of different chloride salts on synchronous fluorescence spectrum of low sodium CSS-MP composite gel
放大低鈉鹽CSS-MP復合凝膠2000 倍和20000 倍的掃描電鏡圖像如圖6所示。添加3% NaCl的對照組復合凝膠表面呈現(xiàn)致密的結構,孔隙和絲狀結構相對均勻,整體表現(xiàn)出明顯的三維凝膠網絡,這與文獻報道的MP通過熱誘導凝膠化形成結構良好、高度相互連接的三維蛋白質網絡結構相符合[33]。在低鈉鹽CSS-MP復合凝膠體系中,以CaCl2、MgCl2和KCl部分替代NaCl后,凝膠的網絡結構發(fā)生了顯著的變化。當復合凝膠中的NaCl被1.0%的CaCl2部分取代后,其凝膠結構較為松弛,凝膠網絡結構呈雪花狀,通過細絲交聯(lián)在一起,其結構較為致密,促使CaCl2替代組的凝膠強度與對照組相當。對于MgCl2替代組,在圖6E、F可以觀察到,凝膠表面部分呈片狀結構,相鄰層被細絲附著,且內部結構出現(xiàn)了大小不一的孔洞,凝膠結構變得松散。觀察圖6G、H,KCl部分替代NaCl后,復合凝膠中蛋白質聚集,呈不均勻、不規(guī)則孔隙結構,內部還存在較大的團聚體。不同氯鹽的替代引起凝膠結構的變化可能與MP和不同鹽離子交聯(lián)程度不同從而導致蛋白質-淀粉之間的反應不均勻有關。CaCl2、MgCl2和KCl的替代,使復合凝膠呈現(xiàn)出更無序、更聚集的結構,導致凝膠質量下降。但對于CaCl2替代組而言,致密孔洞的形成也導致該替代組的凝膠質量較好,可能由于CaCl2的存在刺激了MP與CSS顆粒的相互作用,這有助于結構的均勻性。
圖6 氯鹽對低鈉鹽CSS-MP復合凝膠微觀結構的影響Fig.6 Effect of different chloride salts on the microstructure of CSS-MP gel
如表1所示,與對照組相比,在色澤上,CaCl2替代組和KCl替代組復合凝膠的評分有所增加,但無顯著差異;在氣味上,不同氯鹽替代組的評分均顯著高于對照組(P<0.05);在滋味上,CaCl2替代組和KCl替代組的評分顯著低于對照組(P<0.05);在組織形態(tài)上,MgCl2替代組評分顯著低于對照組(P<0.05),CaCl2替代組和KCl替代組無顯著差異。綜合各指標的得分情況,從整體看,CaCl2、MgCl2和KCl替代組與對照組的感官評定總分沒有顯著差異。通過感官評分的結果可以得出,在一定濃度范圍內,用CaCl2、MgCl2和KCl替代部分NaCl對低鈉鹽CSS-MP復合凝膠的感官特性不會有太大影響,總體上在消費者的可接受范圍內。
表1 低鈉鹽CSS-MP復合凝膠感官評分結果Table 1 Sensory evaluation results of low sodium CSS-MP composite gel
采用金屬電子鼻傳感器對低鈉鹽CSS-MP復合凝膠的揮發(fā)性成分進行檢測。雷達圖中主要涉及10 種傳感器W1C(芳香成分、苯類)、W3C(芳香成分靈敏、氨類)、W5C(短鏈烷烴芳香成分)、W1S(甲基類)、W2S(對醇類、醛酮類)、W3S(長鏈烷烴類)、W5S(氮氧化合物類)、W6S(氫化物)、W1W(硫化物)、W2W(芳香成分、有機硫化物)響應值的變化。由圖7可知,對照組和CaCl2、MgCl2和KCl替代組復合凝膠的風味輪廓相似,說明各處理組中對凝膠樣品主體風味特征貢獻較大的化合物種類基本相同。W1W、W1S、W2W和W2S這4 種類型的傳感器對低鈉鹽CSS-MP復合凝膠的響應值較高,而W3C、W5C和W6S這3 種類型的傳感器對凝膠的響應值較低,并且與對照組相比,以0.5% MgCl2替代NaCl后的復合凝膠對W1W傳感器的響應值明顯提高,表明低鈉鹽CSS-MP復合凝膠中的揮發(fā)性風味物質主要為硫化物成分、甲基類、醇類和醛酮類,其中MgCl2的添加更是提高了硫化物的含量。
對低鈉鹽CSS-MP復合凝膠電子鼻響應信號進行主成分分析(principal component analysis,PCA),結果如圖8所示。PC1貢獻率為71.6%,PC2貢獻率為23.9%,2 種成分的貢獻率之和超過95%,說明這2 個PC能夠較好反映低鈉鹽CSS-MP復合凝膠的總體風味特征。從圖8對照組和不同氯鹽替代組之間的距離可以看出,CaCl2替代組與對照組幾乎重合,說明2 組樣品的氣味差異較小。這可能是由于Ca2+有利于促進蛋白聚集交聯(lián),也可能由于Ca2+存在刺激了MP與CSS顆粒的相互作用,形成更加致密均勻的凝膠網絡結構,不利于氣味釋放,因此表現(xiàn)出CaCl2替代組與對照組的氣味差異較小。
采用電子舌系統(tǒng)對低鈉鹽CSS-MP復合凝膠的甜味、酸味、咸味、苦味、澀味、鮮味、澀味回味、苦味回味和豐富性進行檢測。所有數據均是以人工唾液(參比溶液)為標準的絕對輸出值,以基準溶液的輸出為“0”,即各項指標的無味點均表示為0,除了酸味和咸味的無味點為負值(分別為-13和-6),無味點以下的指標可以認為是該物質沒有味道。由圖9可知,對照組和不同氯鹽替代組的甜味、苦味回味、澀味回味和豐富性均接近于無味點。與添加了3% NaCl的對照組相比,CaCl2的替代產生了酸味,但減少了復合凝膠的苦味,而MgCl2和KCl的替代無明顯差異。此外,CaCl2和MgCl2的替代提高了復合凝膠的鮮味和咸味,而KCl的替代使這2 種味道顯著減弱(P<0.05)。以上結果說明1.0% CaCl2和0.5% MgCl2的替代可達到與3% NaCl相似的咸味感知,并且在一定程度上還能起到增鮮提味的作用。
圖9 低鈉鹽CSS-MP復合凝膠的電子舌雷達圖Fig.9 Electronic tongue radar charts of low sodium CSS-MP composite gel
基于鈣鎂鉀鹽替代的低鈉鹽CSS-MP復合凝膠中,CaCl2替代組的凝膠特性優(yōu)于其他氯鹽替代組。然而,與KCl替代組比,CaCl2替代組和MgCl2替代組表現(xiàn)出較弱的持水力。在感官特性方面,1.0% CaCl2和0.5% MgCl2的替代可達到與3% NaCl相似的咸味感知,綜合感官評分結果顯示3 種氯鹽以一定比例替代NaCl對低鈉鹽CSS-MP復合凝膠的感官特性沒有顯著影響。