黃翠欣,張桂容,劉軍,舒林,曹榮,溫雪瓶,李麗,4*

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院,四川 宜賓,644000)2(四川思來(lái)生物科技有限公司,四川 成都,610000)3(四川太源井醋業(yè)有限公司,四川 自貢,643000)4(固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 宜賓,644000)

四川曬醋是麩醋的一類(lèi),以麩皮和大米為主要原料,用藥曲做糖化劑,采取糖化、酒化、醋化同池進(jìn)行的生料開(kāi)放式多菌混合固態(tài)發(fā)酵工藝。經(jīng)蒸煮、發(fā)酵、日曬(其醋醅和成品醋均經(jīng)日光暴曬)、陳釀四大工藝流程,20多道工序,使得四川曬醋色澤黑褐、無(wú)沉淀、香氣芬芳,具有酸味醇厚、微甜爽口、回味悠長(zhǎng)、久存不腐的特點(diǎn)[1-2]。霉菌是食醋發(fā)酵過(guò)程中一類(lèi)重要的微生物,包括毛霉、曲霉、青霉等,在發(fā)酵過(guò)程中不僅起著糖化、液化等作用,還與食醋風(fēng)味、品質(zhì)等緊密相關(guān)[3-4]。

在食醋釀造過(guò)程中,通過(guò)添加纖維素酶生產(chǎn)菌種可以提升食醋風(fēng)味[5-6],微生物所產(chǎn)生的纖維素酶系是一個(gè)多組分酶系,通常將纖維素酶分為內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶,可將纖維素水解成葡萄糖,用于生產(chǎn)乙醇、有機(jī)酸等化合物[7]。在這三類(lèi)酶的協(xié)同作用下,纖維素可降解為葡萄糖,內(nèi)切葡聚糖酶作用于纖維素的非結(jié)晶區(qū),將纖維素切割成聚合度不同的短鏈纖維素;外切葡聚糖酶從短鏈纖維素的非還原端開(kāi)始水解β-1,4糖苷鍵,釋放纖維二糖;β-葡萄糖苷酶通過(guò)將纖維素二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖來(lái)完成纖維素水解的最后一步[8-9]。

本研究從四川曬醋醋醅中分離得到一株能夠產(chǎn)纖維素酶的菌株,結(jié)合生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)手段鑒定為橫梗霉菌(Lichtheimiaramosa),以?xún)?nèi)切葡聚糖、β-葡萄糖苷酶活力為指標(biāo),通過(guò)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)確定該菌的產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì),以期為后期橫梗霉菌與四川曬醋風(fēng)味物質(zhì)形成的相關(guān)性研究提供理論依據(jù),并為四川曬醋的生產(chǎn)提供了一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

醋醅,采集于四川某曬醋廠。

主要試劑:羧甲基纖維素鈉、Na2SO3、乙酸、乙酸鈉、葡萄糖(分析純),成都科隆化學(xué)品有限公司;牛肉膏、蛋白胨(生化級(jí)),成都奧博星生物技術(shù)有限公司;酵母膏(生化試劑),上海展云化工有限公司;剛果紅,天津市大茂化學(xué)試劑廠;水楊苷(分析純),上海阿拉丁科技股份有限公司;瓊脂(食品級(jí)),石獅市環(huán)球瓊膠工業(yè)有限公司;馬鈴薯,市售。

T-114電子天平,奧豪斯儀器有限公司;QYC-2102C型恒溫培養(yǎng)搖床,上海福馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;BSG-24水浴鍋、THZ-98C恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;T6紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限公司;YXQ-75SII高壓蒸汽滅菌鍋,上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司;BM1000顯微鏡,南京江南永新光學(xué)有限公司;AT-710型pH計(jì),日本京都電子制造有限公司;SW-CJ-1FD單人單面凈化超凈工作臺(tái),上海滬凈醫(yī)療器械有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L):(NH4)2SO45,KH2PO41,MgSO4·7H2O 5,CaCl2·2H2O 0.1,酵母膏0.2,NaCl 0.1,碳源10(氮源5)。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基、羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[10-11]配制;胰蛋白胨大豆肉湯(tryptose soya broth,TSB)培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[12]配制。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株分離鑒定

1.3.1.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

取10 g醋醅投入盛有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中,充分振蕩后梯度稀釋至10-1～10-6。取上述各梯度的稀釋液100 μL涂布于PDA平板上,30 ℃倒置培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。挑取單菌落點(diǎn)接于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基中,30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后,倒入1 mg/mL剛果紅溶液染色10 min,倒去剛果紅溶液,向平板加入1 mol/L的NaCl溶液浸泡15 min脫色,觀察菌落周?chē)袩o(wú)水解圈,并測(cè)量菌圈比,并且將產(chǎn)纖維素酶活力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行斜面保藏。

1.3.1.2 菌株形態(tài)觀察

載片培養(yǎng)[13]后進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察。

1.3.1.3 菌株的生理生化特性觀察

根據(jù)《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[14]和《微生物分類(lèi)學(xué)》[15]對(duì)菌種進(jìn)行碳氮源利用試驗(yàn)、溫度耐受試驗(yàn)、鹽耐受試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)。

1.3.1.4 菌株分子鑒定

采用DNA試劑盒對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行全基因組提取,以ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)純化后送至上海派森諾生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用NCBI Blast程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募cNCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),得到與待測(cè)物種序列相似性最大的物種信息,利用軟件MEGA 6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)橫梗霉菌產(chǎn)酶能力影響

將菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基,于30 ℃培養(yǎng)48 h后,用無(wú)菌水洗脫孢子,調(diào)節(jié)稀釋倍數(shù),用血球計(jì)數(shù)板計(jì)孢子數(shù),使生物量為3.5×106CFU/mL,再以5%(體積分?jǐn)?shù),下同)接種量接種于PDA發(fā)酵培養(yǎng)基,分別測(cè)定培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h后的纖維素酶活力。

1.3.2.2 接種量對(duì)橫梗霉菌產(chǎn)酶能力影響

根據(jù)1.3.2.1節(jié)的測(cè)定結(jié)果,選擇最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間,在此培養(yǎng)時(shí)間條件下探索不同接種量(0.5%、1%、3%、5%、7%和9%)對(duì)產(chǎn)酶的影響。

1.3.2.3 反應(yīng)溫度對(duì)酶活力的影響

在確定接種量、發(fā)酵時(shí)間后,取粗酶液,設(shè)置不同的反應(yīng)溫度(4、30、40、50、60 ℃),比較反應(yīng)溫度對(duì)纖維素酶活性的影響。

1.3.2.4 pH值對(duì)酶活力的影響

在最適反應(yīng)溫度的基礎(chǔ)上,設(shè)置不同酶反應(yīng)體系pH值(3.0～10.0),測(cè)定不同pH值條件對(duì)纖維素酶活性的影響。

1.3.3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選用培養(yǎng)時(shí)間、酶反應(yīng)底物pH值、酶反應(yīng)溫度進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn),分別測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶活力,酶活力單位為U/mL,內(nèi)切葡聚糖酶活力正交設(shè)計(jì)見(jiàn)表1,β-葡萄糖苷酶活力正交設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。取最佳組合條件做驗(yàn)證性試驗(yàn),比較結(jié)果,確定最佳酶作用條件。

表1 內(nèi)切葡聚糖酶活力因素水平表Table 1 factor levels of Endoglucanase activity

表2 β-葡萄糖苷酶活力因素水平表Table 2 factor level of β-glucosidase activity

1.3.4 酶活力測(cè)定方法

發(fā)酵液于4 ℃、6 000 r/min離心10 min,上清液即為粗酶液。

采用DNS法[16-17]測(cè)定酶活力:取3支干燥潔凈的20 mL具塞刻度試管,分別在試管中加入0.5 mL粗酶液和1.5 mL反應(yīng)底物(內(nèi)切葡聚糖酶活力測(cè)定采用羧甲基纖維素鈉溶液;β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定采用水楊苷溶液),同時(shí)另取一組已滅活的粗酶液作為空白對(duì)照。50 ℃水浴30 min后,立即向試管中各加入2 mL DNS溶液,充分搖勻后沸水浴5 min,冷卻后用蒸餾水定容至20 mL,充分混勻。在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各試管溶液的OD值,根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查相應(yīng)的葡萄糖量,并計(jì)算相應(yīng)的酶活力。

反應(yīng)底物的制備:0.5 g羧甲基纖維素鈉(即1.0 g水楊苷)定容到100 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.2 mol/L pH 4.5)中。

在特定溫度、特定pH值條件下,每分鐘內(nèi)催化底物產(chǎn)生1 μg還原糖所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U),計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:ρ,對(duì)照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到的葡萄糖質(zhì)量濃度,mg/mL;V0,反應(yīng)體積,mL;t,反應(yīng)時(shí)間,min;V,粗酶液體積,mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均平行測(cè)定3次,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Excel軟件處理數(shù)據(jù),運(yùn)用SPSS 22進(jìn)行單因素ANOVA分析,并使用Duncan’s法進(jìn)行多重比較,P<0.05表示差異顯著,數(shù)值后標(biāo)注不同小寫(xiě)字母表明差異性顯著。正交試驗(yàn)結(jié)果采用極差分析法確定最優(yōu)的組合。采用Origin 2021軟件繪制柱狀圖,運(yùn)用MEGA 6軟件,Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株篩選結(jié)果

從曬醋醋醅中篩選出1株絲狀真菌,命名為CPM,通過(guò)將單菌落點(diǎn)接于羧甲基纖維素鈉瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),并進(jìn)行產(chǎn)纖維素酶活力檢測(cè),菌落1、2、3周?chē)纬蔁o(wú)色暈圈,如表3所示菌圈比分別為2.61±0.14、2.72±0.13、2.69±0.05,初步確定該菌具有降解纖維素的能力[18]。因此,選擇該菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表3 菌株菌圈比Table 3 Ratio of bacterial ring

2.2 菌株生理生化試驗(yàn)及形態(tài)特征結(jié)果

生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4,本研究選用12種碳源、11種氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株CPM,發(fā)現(xiàn)其均可利用;在30 ℃、37 ℃均能生長(zhǎng),但37 ℃下生長(zhǎng)較為緩慢;該菌可在含有0～10% NaCl溶液的培養(yǎng)基中生長(zhǎng);可分解明膠、淀粉。

表4 生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Physiological and biochemical test results

如圖1-a所示,于PDA培養(yǎng)基30 ℃條件培養(yǎng),48 h后菌落呈疏松的絮狀,白色,邊界不清晰;72 h后鋪滿(mǎn)平皿,成熟菌絲轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色到不同程度灰色。

a-菌落形態(tài);b-孢子囊及孢子形態(tài)圖1 菌株CPM菌落、孢子囊及孢子形態(tài)Fig.1 Colony, sporangium and spore morphology of CPM strain

由圖1-b可看出孢子囊表面光滑呈球形,孢子表面光滑呈橢圓形。根據(jù)文獻(xiàn)[19-20]初步鑒定該菌為真菌界、毛霉門(mén)(Mucoromycota)、毛霉綱(Mucoraceae)、毛霉目(Mucorales)、橫梗霉屬(Lichtheimia)。

2.3 菌株分子生物學(xué)鑒定

建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),比較菌株之間的同源性,如圖2所示,菌株CPM與橫梗霉菌(Lichtheimiaramosa)同源性較高。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)觀察、生理生化分析,初步認(rèn)定該菌為橫梗霉菌(Lichtheimiaramosa)。

圖2 菌株CPM的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain CPM

2.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定結(jié)果得到線(xiàn)性回歸方程:

y=1.454 6x-0.008,R2=0.999 1。如圖3-a所示,菌株CPM的產(chǎn)酶效果和接種時(shí)間存在一定關(guān)系。接種量為5%,培養(yǎng)36 h時(shí),內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活力最高,分別為(76.86±0.43)、(44.55±0.22) U/mL。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間<36 h時(shí),隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加酶活力升高,而36 h后,酶活力下降,可能是由于培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng),菌體老化,從而影響菌株的產(chǎn)酶能力[21]。

2.4.2 接種量的優(yōu)化

如圖3-b所示,菌株CPM的產(chǎn)酶效果在接種量為1%時(shí),內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活力均為最高,分別為(96.52±0.26)、(49.72±0.36) U/mL。當(dāng)接種量大于1%時(shí),酶活力下降,可能是由于接種量過(guò)高,培養(yǎng)基中菌濃度較大,經(jīng)36 h后培養(yǎng)基中缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),使菌株代謝受阻,進(jìn)而降低產(chǎn)酶效果[22]。

2.4.3 反應(yīng)溫度對(duì)酶活力的影響

由圖3-c可知,在50 ℃條件下反應(yīng)30 min時(shí),該菌的內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶活力均為最高,分別為(97.85±0.92)和(49.22±0.61) U/mL;60 ℃條件下反應(yīng)30 min仍有較高的酶活力,說(shuō)明內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶有一定的耐高溫特性,但是比50 ℃下的酶活力低,可見(jiàn)反應(yīng)溫度太高依然會(huì)降低酶活力;4 ℃反應(yīng)30 min條件下酶活力最低,內(nèi)切葡聚糖酶酶活力為(28.57±0.79) U/mL,β-葡萄糖苷酶酶活力(19.91±0.55) U/mL,可見(jiàn)低溫會(huì)抑制酶的活性。綜上所述,內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃,且有較好的耐熱性,耐高溫這一特性與HONG等[23]研究結(jié)果一致。

2.4.4 pH值對(duì)酶活力的影響

過(guò)酸或過(guò)堿條件下都會(huì)影響纖維素酶的結(jié)構(gòu),從而降低酶的活力[24]。由圖3-d可知,內(nèi)切葡聚糖酶在pH 5.0時(shí)酶活力最高,為(96.72±0.83) U/mL,高于或低于pH 5.0酶活力均有所下降,說(shuō)明該酶屬于酸性酶,并且pH值范圍在3.0～10.0均保持活性,說(shuō)明菌株CPM所分泌出的內(nèi)切葡聚糖酶具有良好的適應(yīng)能力;pH 6.0時(shí)β-葡萄糖苷酶酶活力最高,為(51.07±0.83) U/mL,在pH值為3.0～10.0均保持活性,但是酸性條件下的酶活力均高于堿性條件,由此可知β-葡萄糖苷酶在酸性條件下的活力更高。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

內(nèi)切葡聚糖酶活力正交試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。經(jīng)極差分析,可知對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶活力影響的主次關(guān)系為A>B>C,培養(yǎng)時(shí)間影響最大,其次是pH值和溫度;通過(guò)比較均值K,得到最佳組合為A1B2C3,即培養(yǎng)時(shí)間24 h、反應(yīng)底物pH 5.0、反應(yīng)溫度60 ℃;通過(guò)比較酶活力可知試驗(yàn)2的酶活力最大,達(dá)(95.92±0.99) U/mL。

β-葡萄糖苷酶活力正交試驗(yàn)結(jié)果如表6所示。經(jīng)極差分析,可知對(duì)β-葡萄糖苷酶活力影響的主次關(guān)系為C′>A′>B′,溫度影響最大,其次是培養(yǎng)時(shí)間和pH值;通過(guò)比較均值K,得到最佳組合為A′1B′1C′2,即培養(yǎng)時(shí)間24 h、反應(yīng)底物pH 5.0、反應(yīng)溫度50 ℃;通過(guò)比較酶活力可知試驗(yàn)11的酶活力最大,達(dá)(47.57±3.66) U/mL。

表6 β-葡萄糖苷酶活力正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Orthogonal test results of β-glucosidase activity

2.6 驗(yàn)證性試驗(yàn)

按正交試驗(yàn)結(jié)果,取最佳組合1(A1B2C3)測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶活力,最佳組合2(A′1B′1C′2)測(cè)定β-葡萄糖苷酶活力,試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果如表7所示,正交試驗(yàn)2號(hào)的內(nèi)切葡聚糖酶活力高于最佳組合1,正交試驗(yàn)11號(hào)的β-葡萄糖苷酶活力高于最佳組合2。故內(nèi)切葡聚糖酶最優(yōu)的酶作用條件為A1B2C2,即培養(yǎng)時(shí)間24 h、反應(yīng)底物pH 5.0、反應(yīng)溫度50 ℃;β-葡萄糖苷酶最優(yōu)的酶作用條件為A′1B′2C′2,即培養(yǎng)時(shí)間24 h、反應(yīng)底物pH 6.0、反應(yīng)溫度50 ℃。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of verification test

3 結(jié)論

真菌產(chǎn)纖維素酶的主要特點(diǎn)是酶系全、產(chǎn)量高,并且能分泌到細(xì)胞外[25],橫梗霉菌屬于毛霉目的其中一種絲狀真菌,可產(chǎn)生羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和β-木糖苷酶[5]、β-甘露聚糖酶[26]、淀粉酶[27]等。橫梗霉菌在醋醅中比較少見(jiàn),常存在于大曲中[28-29]。本文從四川曬醋醋醅中篩選出的1株能夠產(chǎn)纖維素酶的橫梗霉菌(Lichtheimiaramosa),通過(guò)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)探究其產(chǎn)酶條件與酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明該菌所產(chǎn)的內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶分別在pH 5.0和pH 6.0條件下酶活力較高,具有較寬作用pH值和溫度范圍,對(duì)環(huán)境具有較強(qiáng)的耐受能力和適應(yīng)性。后續(xù)還可以結(jié)合曬醋主料配方繼續(xù)優(yōu)化發(fā)酵底物,測(cè)定橫梗霉菌在醋酸發(fā)酵過(guò)程中的代謝產(chǎn)物,這有助于橫梗霉菌與四川曬醋風(fēng)味物質(zhì)形成的相關(guān)性研究。