任 麗，鄒明遠，朱行春，3，徐文雋，3，劉剛，孫俊杰，范方田，張從利

蚌埠醫(yī)學院1檢驗醫(yī)學院，2臨床醫(yī)學院，3癌癥轉(zhuǎn)化醫(yī)學安徽省重點實驗室，4藥學院//安徽省生化藥物工程技術研究中心，安徽 蚌埠 233030；5第一附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 蚌埠233004

甲狀腺癌（TC）是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的腫瘤，約占96%［1］，占所有惡性腫瘤2%。TC發(fā)病率增長幅度遠超其它惡性腫瘤［1-4］。分化型甲狀腺癌（DTC）占TC病理類型的95%［5］。2005～2015年間，DTC發(fā)病率增長近5倍［6,7］。甲狀腺乳頭狀癌（PTC）是最常見的DTC病理類型，約占87%［5,8］。新發(fā)甲狀腺癌中，PTC占92%。部分PTC患者，尤其是復發(fā)性PTC患者因缺少有效的治療方法，遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生率及死亡率逐年升高［2,3,7-9］。近年來，有關PTC發(fā)生、發(fā)展機制的研究逐步深化、精準，而針對難治性、復發(fā)性PTC的小分子活性藥物靶向治療策略成為研究焦點。

由姜科植物提取的小分子化合物—姜黃素，抑制多種腫瘤細胞生長、轉(zhuǎn)移［10-13］，既往研究證實姜黃素抑制B-CPAP人甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)移能力的分子機制涉及細胞凋亡［14］、G2/M 期阻滯［15］、TGF-β/Smad2/3通路［16］等途徑。姜黃素通過調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子紅系-2-相關因子2（Nrf2）影響A549肺癌細胞、MCF-7乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲的研究已有報道［12,13］。而有關姜黃素對B-CPAP細胞Nrf2的影響及其與細胞遷移、侵襲能力間關系的報道較為少見。

此項研究目的在于驗證姜黃素對B-CPAP人甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，探討其與Nrf2通路間的關系。旨在為甲狀腺乳頭狀癌的治療提供分子靶點，為臨床開發(fā)治療新策略提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人甲狀腺癌細胞B-CPAP（賽庫），姜黃素（麥克林），胎牛血清（FBS）（Lonsera），RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco）。ABW 基質(zhì)膠（上海諾娃），N-乙酰半胱氨酸（NAC）、TRIzol（GLPBIO）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（近岸）、胰酶消化液、RIPA 裂解液(強)、活性氧（ROS）、SDS-PAGE 凝膠及MTT檢測試劑盒（碧云天）；transwell小室、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿及96孔、6孔板（Corning）；核蛋白提取試劑盒（上海貝博公司）；Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1（Keap1）Rabbit pAb 及二抗（ABclonal），Nrf2 mouse mAb 及二抗（Santa Cruz）。

1.2 細胞培養(yǎng)

B-CPAP細胞接種于培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿，該株細胞的培養(yǎng)液配方如下：FBS∶PR1640培養(yǎng)基=1∶10。細胞培養(yǎng)2～3 d后、細胞匯合度約80%時，進行傳代操作。

1.3 MTT實驗

B-CPAP細胞消化后鋪96孔板、細胞數(shù)約5000/孔，細胞密度約70%時分別加入含姜黃素0、5、10、15、20 μmol/L 的新培養(yǎng)液，相應時點（24、48、72 h）后加MTT溶液、100μL/孔，繼續(xù)孵育4 h；再加Formazan溶解液、100μL/孔，混勻Formazan溶解液與MTT溶液，37 ℃水浴箱中孵育約3 h，酶標儀檢測。

1.4 Transwell遷移實驗

接種細胞于Transwell小室、每室約50 000細胞，設姜黃素（0、5、10、15、20μmol/L）組，下室內(nèi)分別加入相應濃度姜黃素的完全培養(yǎng)基500 μL，24 h后刮去底面未穿過膜的細胞、依次用甲醇及0.1%結(jié)晶紫染液處理，各10 min。選取5以上個視野、高倍鏡下拍照并計算穿膜細胞的數(shù)量。

1.5 Transwell侵襲實驗

接種于已包被基質(zhì)膠（10 mg/mL）Transwell小室中、約5×104/室，余步驟同Transwell遷移實驗。

1.6 ROS檢測

細胞鋪6孔板、約2×105/孔，密度70%時分別加入含姜黃素0、5、10、15、20μmol/L的新培養(yǎng)液。24 h后，按照DCFH-DA 液∶PRIM 1640 培養(yǎng)基=1∶1000 比例配制DCFH-DA稀釋液，加稀釋液1 mL/孔，培養(yǎng)箱孵育30 min，吸棄稀釋液，培養(yǎng)基洗滌細胞、3次/孔；胰酶消化液消化細胞、500 μL/孔，1.5 min后終止消化，轉(zhuǎn)移消化脫落的細胞液至離心管，1000 r/min離心5 min；重懸每管液體后檢測。

1.7 Western blot

B-CPAP細胞鋪于100 mm×20 mm培養(yǎng)皿中，待細胞密度約70%時換含姜黃素0、5、10、15、20μmol/L的新完全培養(yǎng)基：①24 h 后用刮刀刮至出現(xiàn)濃稠液體、2000 r/min離心15 min后上清部分即為總蛋白；②500g離心5 min，棄上清、PBS清洗2次、加入約300 μL預冷提取液A，混勻、標本放冰盒中繼續(xù)振蕩約20 min，2000g離心5 min后上清部分即為細胞胞漿蛋白。沉淀中加入80～200 μL預冷提取液B、振蕩15 s、標本放冰盒中繼續(xù)振蕩30～40 min、12 000g離心10 min，上清部分即為細胞核蛋白。定量及變性待檢測蛋白選用BCA法。配分離膠、濃縮膠膠，SDS-PAGE電泳法80 V先電泳約30 min、再120V電泳60～90 min。200 mA轉(zhuǎn)膜2 h。封閉60 min；孵育一抗、二抗，HRP底物顯色。圖像結(jié)果處理應用Image J 軟件、灰度值定量分析及繪制柱狀圖應用Graphpad Prism7軟件。

1.8 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

B-CPAP細胞鋪在100 mm×20 mm培養(yǎng)皿中，細胞密度約70%時加入含姜黃素（0、5、10、15、20μmol/L）新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細胞總RNA應用TRIZOL法制備好后應用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄總RNA，熱循環(huán)參數(shù)為：95 ℃20 s、60 ℃20 s、72 ℃30 s，40 個循環(huán)，最終72 ℃再延伸5 min。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法，ΔΔCt=實驗組（Ct 目標基因-Ct 內(nèi)參）-對照組（Ct 目標基因-Ct 內(nèi)參）?；颉?nèi)參的擴增引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences used for qRT-PCR

1.9 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 19.0軟件分析實驗結(jié)果，其中計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示、用Graphpad Prism 7作圖；比較實驗數(shù)據(jù)組間差異用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素抑制B-CPAP細胞增殖

不同濃度（0、5、10、15、20 μmol/L）姜黃素作用B-CPAP 細胞24、48、72 h的MTT結(jié)果顯示：細胞存活率隨姜黃素濃度的升高、作用時間的延長顯著降低（P＜0.05或P＜0.01，圖1）。

圖1 姜黃素對B-CPAP細胞增殖的影響Fig. 1 Viability of B-CPAP cells treated with different concentrations(0,5,10,15,and 20 μmol/L)of curcumin for 24,48 and 72 h.*P＜0.05,**P＜0.01 vs 0 μmol/L.

2.2 姜黃素抑制B-CPAP細胞遷移、侵襲

Transwell 遷移實驗所示，與0 μmol/L 組細胞比較，B-CPAP細胞遷移數(shù)量隨姜黃素濃度增加而顯著減少（P均＜0.001，圖2A、B）；Transwell侵襲實驗可見與0μmol/L組細胞比較，穿過小室的B-CPAP細胞數(shù)量隨姜黃素濃度增加而顯著減少（P均＜0.001，圖2C、D）。

圖2 姜黃素對B-CPAP細胞遷移、侵襲能力影響Fig. 2 Curcumin inhibits migration and invasion of B-CPAP cells.A:Transwell migration assay(Scale bar:100 μm).B: Number of migrated cells.C: Transwell invasion assay (Scale bar: 100 μm).D: Number of invasion cells.***P＜0.001 vs 0 μmol/L.

2.3 姜黃素誘導B-CPAP細胞ROS水平升高

姜黃素呈劑量依賴性觸發(fā)B-CPAP細胞總ROS產(chǎn)生（與0 μmol/L 組細胞比較，P＜0.05 或P＜0.01，圖3A）。用5μmol/L抗氧化劑NAC與20μmol/L姜黃素聯(lián)合作用B-CPAP細胞24 h，發(fā)現(xiàn)與姜黃素組細胞比較，NAC聯(lián)合姜黃素組細胞ROS水平顯著降低（P＜0.001，圖3B）。

圖3 姜黃素對B-CPAP細胞ROS水平影響Fig. 3 Effect of curcumin on ROS level in B-CPAP cells.A:Changes of ROS in B-CPAP cells after treatment with different concentrations of curcumin for 24 h.B:Changes of ROS in B-CPAP cells after treatment with 20 μmol/L curcumin with and without NAC(5 μmol/L)for 24 h.*P＜0.05,**P＜0.01 vs 0 μmol/L;▲P＜0.001 vsCurcumin 20.

2.4 姜黃素對B-CPAP細胞Nrf2、Keap1的影響

2.4.1 姜黃素對B-CPAP 細胞Keap-1 及Nrf2 蛋白、mRNA水平的影響 Western Blot結(jié)果所示，與0 μmol/L組細胞比較，10、15、20 μmol/L姜黃素均可誘導Nrf2蛋白表達顯著降低、Keap1蛋白水平顯著增加（P＜0.05或P＜0.01，圖4A、B）。與0 μmol/L組細胞比較，20 μmol/L姜黃素顯著降低細胞Nrf2 mRNA 水平（P＜0.05，圖4C）、顯著升高Keap1 mRNA水平（P＜0.01，圖4D）。

圖4 姜黃素對B-CPAP細胞Nrf2、Keap1蛋白及mRNA水平的影響Fig. 4 Nrf2 and Keap1 protein expressions in BCPAP cells treated with curcumin.A:Western blots of Nrf2 and Keap1 proteins in BCPAP cells treated with different concentrations of curcumin for 24 h.B:Quantification of the results of Western blotting.C,D:Nrf2 and Keap1 mRNA expressions in BCPAP cells treated with 20 μmol/L curcumin for 24 h detected by qRT-PCR.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs 0 μmol/L.

2.4.2 姜黃素抑制B-CPAP 細胞核Nrf2 活性水平 與0 μmol/L組細胞比較，20 μmol/L姜黃素處理后胞胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05，圖5A、B）、而胞漿內(nèi)Nrf2蛋白表達量未見顯著差異（P＞0.05，圖5C、D）。

圖5 姜黃素對B-CPAP細胞細胞核、細胞漿Nrf2蛋白水平的影響Fig. 5 Western blotting for detecting Nrf2 protein expressions in the cell nuclei and cytoplasm of B-CPAP cells treated with different concentrations of curcumin for 24 h.A,B:Western blots of nuclear Nrf2 and quantitative analysis of the results.C,D:Western blots of cytoplasmic Nrf2 and quantitative analysis of the results.*P＜0.05 vs 0 μmol/L.

3 討論

研究認為姜黃素的抗癌作用主要歸因于高濃度姜黃素可誘導ROS升高及促氧化，高水平ROS觸發(fā)細胞下游一系列事件［17］。20 μmol/L姜黃素可通過誘導BGC-823胃癌細胞ROS升高而激活應激信號通路，最終促使細胞凋亡［18］。高濃度姜黃素亦可通過誘導ROS升高而抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞、結(jié)腸癌細胞生長、增殖［18,19］。本研究中，姜黃素在0、5、10、15、20 μmol/L濃度范圍內(nèi)，呈劑量依賴性地抑制B-CPAP細胞增殖、遷移及侵襲能力，劑量依賴性誘導ROS升高、在20 μmol/L時達峰值，并且可被ROS清除劑NAC特異性逆轉(zhuǎn)。而ROS生成和清除失衡可誘發(fā)氧化應激損傷。以上結(jié)果與既往文獻研究結(jié)果一致［15,17,18］。進一步驗證了姜黃素通過誘導腫瘤細胞ROS升高致細胞發(fā)生DNA損傷，而促使腫瘤細胞死亡的結(jié)論。

作為抗氧化應激最主要的核轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2表達不足是ROS清除減弱的重要原因。生理情況下，細胞合成Nrf2的同時亦降解Nrf2。未降解的Nrf2與Keap1結(jié)合為復合物，以非活性狀態(tài)存在于胞質(zhì)中。而氧化應激情況下，Keap1構象變化和/或Nrf2磷酸化，活化的Nrf2與Keap1解偶聯(lián)、易位至細胞核，先后與Maf蛋白、抗氧化反應原件結(jié)合，誘導下游抗氧化，解毒基因轉(zhuǎn)錄、表達，提高細胞抗氧化應激能力［20-22］。Nrf2作為機體抗氧化應激的重要因子，主要受Keap1 調(diào)控，二者組成Keap1-Nrf2通路。腫瘤細胞高度活躍的增殖、分裂狀態(tài)致使細胞內(nèi)ROS升高，進而誘發(fā)細胞氧化損傷。而Nrf2可通過降低ROS水平而減輕其介導的細胞凋亡。Nrf2過度激活增強腫瘤細胞增殖能力、代謝水平、凋亡抗性及侵襲能力［23-25］。正常情況下，Nrf2的激活可提高細胞對癌變的防御能力。而在腫瘤誘導條件下，Nrf2無限異常激活，可保護腫瘤細胞免于氧化應激損傷、誘發(fā)放療抵抗［26］，降低化療藥物敏感性［27］。而姜黃素可增強耐藥腫瘤細胞的藥物敏感性，與化療藥物聯(lián)用時可提高化療藥物的作用［12-14］。姜黃素可通過抑制Nrf2 降低A549細胞、MCF-7細胞增殖、遷移及侵襲能力。受此啟發(fā)，為進一步驗證姜黃素抑制甲狀腺乳頭狀癌B-CPAP細胞增殖、遷移及侵襲的分子機制，我們應用Western Blot法驗證姜黃素劑量依賴性升高細胞總蛋白Keap-1水平、降低Nrf2水平，本研究更有意義的發(fā)現(xiàn)是姜黃素主要通過降低Nrf2水平及活性而降低B-CPAP細胞抗氧化應激能力，誘導ROS升高。我們推測姜黃素對BCPAP細胞增殖、遷移及侵襲能力的抑制與Keap1-Nrf2通路有關。

多項研究表明Keap1-Nrf2通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具促癌、防癌的雙重作用，是一把“雙刃劍”。腫瘤發(fā)生的初始階段，Nrf2通過其Neh2結(jié)構域結(jié)合Keap1的Kelch結(jié)構域而泛素化、Nrf2的降解可促進癌癥發(fā)生；腫瘤的發(fā)展階段，Nrf2的激活突變及Keap1的功能突變破壞二者的結(jié)合狀態(tài)、Nrf2被過度激活，增加腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移能力，甚至影響細胞自噬、鐵死亡、代謝重編程等情況［28］。腫瘤組織中Nrf2亦常見過表達，且腫瘤組織Nrf2高表達與不良臨床結(jié)果及預后顯著相關［29,30］。Nrf2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及治療中的雙重作用使Nrf2靶點及相關通路成為研究熱點。抑制Nrf2為癌癥藥物研發(fā)提供了新的靶點。Nrf2抑制劑可通過增加化療藥物作用敏感型而提高臨床腫瘤放、化療治療效果。最近有關Nrf2抑制劑治療、預防癌癥的臨床及基礎研究一定程度證實抑制Nrf2在腫瘤治療中的潛在價值。本研究亦證實姜黃素可通過降低甲狀腺乳頭狀癌B-CPAP 細胞Nrf2含量及活性而抑制細胞增殖、遷移及侵襲。與既往研究中姜黃素可通過降低Nrf2抑制肺癌、乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲研究結(jié)論一致［12,13］。但是，Nrf2抑制劑的臨床治療效果及適用性需要進一步的研究［31,32］。而本研究亦缺少患者甲狀腺乳頭狀癌標本Nrf2蛋白水平檢測及Nrf2抑制劑治療的研究。

有關Nrf2激活、失活分子機制的研究亦成為癌癥研究的新方向。Keap1-Nrf2信號通路是目前Nrf2研究的焦點，目的是探索該通路在癌癥、甚至其他以氧化還原穩(wěn)態(tài)改變?yōu)樘卣骷膊≈械臐撛趦r值。綜上，本研究初步證實姜黃素抑制甲狀腺乳頭狀癌B-CPAP細胞增殖、遷移及侵襲能力，具體機制可能與姜黃素通過抑制Nrf2活性調(diào)控Keap1-Nrf2通路有關。此項研究將為臨床開發(fā)姜黃素治療甲狀腺乳頭狀癌的新策略提供潛在靶向分子以及理論基礎。