黃奕，林麗珊，黃浩華，董航明

南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，廣東 廣州510515

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應性（AHR）為特征的炎癥性疾病，表現(xiàn)為反復發(fā)作的喘息、呼吸困難、咳嗽或胸悶。目前認為其發(fā)病機制由遺傳、環(huán)境。人體免疫等多個方面相關(guān)，在臨床上哮喘分為多種表型［1］，而在哮喘的所有表型中，都會出現(xiàn)了上皮損傷這一病理特征［2］。提示氣道上皮與哮喘密切相關(guān)，深入探討氣道上皮對哮喘的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。

線粒體是細胞內(nèi)重要的細胞器，是細胞多種代謝反應的中心，在細胞穩(wěn)態(tài)、代謝、先天免疫、細胞凋亡等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此線粒體損傷可影響細胞代謝和能量產(chǎn)生，進而引起一系列代謝紊亂和炎癥反應［3］。目前認為線粒體功能障礙與肺部疾病的發(fā)病機制相關(guān)，如慢性阻塞性肺疾?。–OPD）和特發(fā)性肺纖維化（IPF）［4-6］，可造成增殖、凋亡、氧化應激反應、Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞和活性氧（ROS）產(chǎn)生增加等影響。不同氣道細胞群中的線粒體功能障礙，包括肺泡上皮細胞、成纖維細胞和免疫細胞等，例如刺激上皮細胞衍生的細胞因子導致肌成纖維細胞的激活，從而促進成纖維過程［7］，但線粒體與哮喘的相關(guān)研究較少。為了更好地了解線粒體在哮喘中的作用并開發(fā)新的治療策略，有必要進一步的進行研究。

電壓依賴性陰離子選擇性通道蛋白1（VDAC1）是是錨定線粒體外膜上的多功能蛋白，它可以調(diào)控線粒體與細胞其他組分之間的物質(zhì)代謝，維持細胞的生理功能；而在調(diào)節(jié)能量產(chǎn)生、線粒體氧化酶應激、Ca2+運輸、物質(zhì)代謝等方面，VDAC1同樣參與其中［8］。當細胞受到外界刺激時，VDAC1還可通過與Bax結(jié)合，參與細胞凋亡的調(diào)節(jié)［9］；因此VDAC1與線粒體功能息息相關(guān)，但近年來，有研究指出，在香煙煙霧、空氣污染、炎癥因素、缺氧等因素刺激下，VDAC1可發(fā)生寡聚化釋放損傷相關(guān)分子模式從而引起炎癥反應，參與慢性炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展［10-12］，而哮喘作為全身性的慢性炎癥疾病，我們認為VDAC1參與了哮喘氣道炎癥的發(fā)生。

鐵死亡是一種程序性的細胞死亡形式，本質(zhì)是鐵依賴的脂質(zhì)過氧化過程，與神經(jīng)退行性變、缺血再灌注、癌癥等疾病有關(guān)［13-15］。在正常情況下，胱氨酸的正常運輸保護細胞免受脂質(zhì)過氧化和抑制鐵死亡［16］。在不同疾病模型的鐵死亡過程中都可以觀測到線粒體功能受損，活性氧（ROS）增多、膜電位（MMP）改變、脂質(zhì)過氧化加劇和線粒體內(nèi)鐵的積累都證明了這一點［17,18］。然而，對于目前鐵死亡與線粒體之間的調(diào)控作用與關(guān)系尚不明確［19］。本研究旨在探討HDM誘導的氣道上皮細胞細胞是否通過調(diào)控VDAC1引起線粒體功能障礙從而引起鐵死亡，以進一步揭示哮喘的發(fā)生機制并為哮喘的精準治療提供新的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

人氣道上皮細胞株（HBE細胞，ATCC）；角質(zhì)細胞培養(yǎng)基（KM培養(yǎng)基，ScienCell）；胎牛血清（GIBCO）；屋塵螨制劑（HDM，ALK-Abello）；VBIT-4（Selleckchem）；線粒體紅色熒光探針（Mito-Tracker Red），Hoechst 33342活細胞染色液（碧云天）；蘇木素染液，伊紅染液，瑞氏-姬薩姆復合染液（索萊寶）；免疫組化兔二步法檢測試劑盒（中國北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；兔抗VDAC1 單克隆抗體，鼠抗β-acitn 多克隆抗體（Proteintech）；兔抗谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）單克隆抗體（abcam），兔抗鐵蛋白重鏈1（FTH1）多克隆抗體；驢抗兔紅外二抗（Licor）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HBE 細胞使用KM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。HDM濃度梯度刺激分組如下：對照組；200 U刺激組組：用HDM（800 U/mL）處理24 h；400 U刺激組：用HDM（800 U/mL）處理24 h；800U刺激組組：用HDM（800 U/mL）處理24 h。VBIT-4分組處理如下：對照組；HDM組：用HDM（800 U/mL）處理24 h；VBIT-4組：用VBIT-4（10 μmol/L）處理24 h；HDM+VBIT-4組：HDM（800 U/mL）與VBIT-4聯(lián)合處理24 h；每天更換KM培養(yǎng)基。

1.2.2 細胞線粒體膜電位測定 將HBE細胞傳代鋪于小皿中，按照實驗設(shè)計進行處理后加入200μL JC-1染色工作液（1∶200）在37 ℃敷箱避光孵育20 min，PBS清洗后使用熒光顯微鏡拍照觀察。

1.2.3 線粒體ROS檢測 將HBE細胞傳代鋪于小皿中，按照實驗設(shè)計進行處理后加入200μL JC-1染色工作液（1∶1000，終濃度為5 μmol/L）在37 ℃敷箱避光孵育10 min，PBS清洗后使用熒光顯微鏡拍照觀察。

1.2.4 Western blot 根據(jù)目的蛋白的相對分子質(zhì)量配適合濃度（10%～15%）的SDS-PAGE膠，以80 V恒壓進行電泳至溴酚藍指示劑到達分離膠的底部（根據(jù)Maker位置），再以300 mA恒流進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)目的蛋白相對分子質(zhì)量+30 min公式來計算，用5%的BSA溶液室溫封閉1 h后，孵育對應的一抗稀釋液8 h或過夜（兔抗VDAC1濃度為1∶1000，兔抗GPX4濃度1∶1000，兔抗FTH1濃度1∶1000，鼠抗ACTIN濃度為1∶1000），孵育相應種屬的二抗（1∶10000）2 h，洗膜后通過Licor Odyssey顯影儀進行顯影分析。

1.2.5 哮喘模型構(gòu)建 SPF級雄性C57BL/6小鼠32只，6～8 周齡，體質(zhì)量20～24 g，飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院清潔級動物房，將小鼠隨機分為4組，8只/組：對照組；VBIT-4組；HDM組；HDM+VBIT-4組。本實驗經(jīng)南方醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準（NFYY-2021-1205）。

1.2.5.1 致敏階段 HDM及HDM+VDAC1組每只小鼠在第0天和第7天通過腹腔腔注射100μL的HDM混合液（4000 U/只，HDM40 μL+PBS60 μL）；對照組及VBIT-4組注射100μL的PBS磷酸緩沖液。

1.2.5.2 激發(fā)階段 第8天在異氟烷吸入麻醉下，HDM處理組的小鼠每兩天采用滴鼻給藥方式給予10μL HDM混懸液（400 U/只，HDM4μL+PBS6μL），總共激發(fā)10 次。HDM+VBIT-4組激發(fā)前進行VBIT-4混合液滴鼻（5μg/10μL），最后1次激發(fā)后在24 h內(nèi)處死小鼠進行收樣。

1.2.6 肺泡灌洗液計數(shù) 將收集的肺泡灌洗液充分混勻，吸取10μL混懸液滴加到自動細胞計數(shù)板中，放入細胞計數(shù)儀內(nèi)，調(diào)整相關(guān)參數(shù)，測得細胞總數(shù)后保存數(shù)據(jù)。

1.2.7 H&E染色 取小鼠肺臟組織，4%多聚甲醛固定24 h、石蠟包埋、連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟、水化后使用蘇木素和伊紅染色后封片。

1.2.8 瑞氏-姬薩姆染色 收集小鼠肺泡灌洗液，重懸后取適量灌洗液滴于載玻片上，固定后使用瑞氏-姬薩姆染液染色后封片，顯微鏡下觀并采集數(shù)據(jù)。

1.2.9 免疫組織化學染色 取小鼠的肺臟組織，使用4%多聚甲醛固定24 h、石蠟包埋、連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟、水化后封閉，孵育一抗過夜（GPX-4），在37 ℃下二抗孵育1 h，DAB顯色、改良蘇木素復染，透明后封片。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，對于計量數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標準差表示；均數(shù)滿足方差齊性時，組間比較采用單向方差分析，組間多重比較采用Bonferroni 法或q檢驗；均數(shù)不滿足方差齊性時，均數(shù)比較采用Welch法，組間多重比較采用Tamhane's T2檢驗比較，P＜0.05 提示差異有統(tǒng)計學意義。所有實驗都是獨立重復3次。

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)HDM 誘導的HBE細胞的線粒體出現(xiàn)損傷

在HDM刺激下，與對照組相比，HBE細胞mtROS的生成增多（圖1A），同時JC-1紅光減弱，綠光增強，提示線粒體膜電位下降(圖1B)，免疫印跡實驗結(jié)果顯示在濃度梯度的HDM刺激下，與對照組相比，當HDM濃度到200 U/mL或400 U/mL的濃度時，VDAC1、GPX4和FTH1的蛋白表達水平變化均無統(tǒng)計學意義（圖1C～E）；當HDM 濃度達到800 U/mL時，VDAC1的蛋白表達水平顯著上調(diào)（P=0.005）。同時鐵死亡相關(guān)蛋白FTH1的表達也上調(diào)（P=0.030），而GPX4則出現(xiàn)表達下調(diào)（P=0.015）。

圖1 HDM對HBE細胞線粒體功能與鐵死亡相關(guān)蛋白表達水平的影響Fig. 1 Mitochondrial function and expression of ferroptosis-related proteins in human airway epithelial (HBE) cells exposed to house dust mite (HDM). A: Mitochondrial ROS (mtROS) production assessed by immunofluorescence assay (Original magnification: ×600)and quantitative analysis of fluorescence intensity in each group(n=3).**P＜0.01 vs control group(n=3)B:Mitochondrial membrane potential was assessed by JC-1 staining(×400,n=3).C-E:Expression of GPX4,FTH1 and VDAC1 in the treated cells.*P＜0.05,**P＜0.05 vs control group(n=3).

2.2 使用VDAC1抑制劑VBIT-4可保護線粒體，抑制HBE細胞鐵死亡的發(fā)生

HDM組的出現(xiàn)表達上調(diào)（圖2），與HDM組相比，HDM+VBIT-4組中，VDAC1的表達顯著下調(diào)（P=0.001，圖2A），表明VDAC1被抑制，同時，F(xiàn)TH1的表達亦顯著下調(diào)（P=0.037，圖2B）而GPX4表達出現(xiàn)上調(diào)（P=0.029，圖2C）。免疫熒光提示，在VBIT-4干預下，與HDM組相比mtROS的生成減少（圖2D），提示線粒體功能得到改善。

圖2 使用VDAC1抑制劑VBIT-4可保護線粒體，抑制HBE細胞鐵死亡的發(fā)生Fig. 2 VBIT-4 protects mitochondria and inhibits ferroptosis in HBE cells.A-C:Protein expressions of VDAC1,GPX4 and FTH1 in the treated cells.*P＜0.05 vs Control group (n=3).#P＜0.05 vs HDM group (n=3).##P＜0.01 vs HDM group (n=3). D: mtROS assessed by immunofluorescence assay(×400)and quantitative analysis of the fluorescence intensity of each group(n=3).

2.3 在HDM誘導的哮喘小鼠模型中，VBIT-4抑制氣道炎癥水平

在哮喘小鼠模型中，免疫組織化學染色結(jié)果提示，相較于對照組組，HDM組的氣道上皮細胞中GPX4的免疫組化染色明顯變淺，而使用VBIT-4干預后，GPX4的免疫組化染色明顯加深（圖4A）。同時HE染色提示給予VBIT-4處理后，HDM誘導的小鼠模型炎癥水平得到改善（圖3B）而肺泡灌洗液細胞計數(shù)與瑞氏-姬薩姆染色結(jié)果顯示，VBIT-4降低了肺泡灌洗液中細胞總數(shù)（P=0.0002）和嗜酸粒細胞的數(shù)量（P=0.001，圖3C、D）。

圖3 在HDM誘導的哮喘小鼠模型中，VBIT-4抑制氣道炎癥水平Fig. 3 VBIT-4 alleviates airway inflammation in mice with HDM-induced asthma.A:Immunohistochemical staining of GPX4 in mouse airway(×400).B:HE staining showing aggregation of inflammatory cells around the airway(×400).C:Total cell counts in the bronchoalveolar lavage fluid(BALF).*P＜0.05 vs Control group(n=3).#P＜0.05 vs HDM group(n=3).D:Eosinophil counts in the BALF.***P＜0.001 vs Control group(n=3).##P＜0.01 vs HDM group(n=3).

3 討論

目前臨床主要采用糖皮質(zhì)激素或支氣管擴張劑緩解哮喘患者的癥狀［20］。但傳統(tǒng)的抗炎藥物會引起很多不良反應，損害人體健康，且近年來越來越多的研究表明，糖皮質(zhì)激素對不同哮喘表型的治療效果不相同［21］，對于激素抵抗型哮喘，糖皮質(zhì)激素治療并不能讓患者獲益。因此，我們需要進一步研究哮喘發(fā)生發(fā)展的分子機制，以開發(fā)最新的治療方案。本研究從體內(nèi)外兩方面探討了鐵死亡在哮喘發(fā)病機制中的啟動機制，以及可能的調(diào)控機制。

鐵死亡是細胞中大量游離鐵的積累導致脂質(zhì)過度氧化，最終導致細胞死亡［22］的過程。谷胱甘肽（GSH）是細胞內(nèi)主要的抗氧化劑，作為GPX4的還原底物發(fā)揮抗氧化作用，從而減少細胞中脂質(zhì)過氧化物的積累。異胱氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)運受體主要作用是將胱氨酸導入細胞，還原為半胱氨酸合成GSH，從而保護細胞免受氧化損傷。當細胞胱氨酸運輸受到抑制時，胞內(nèi)GSH被耗盡，導致GPX4失活，誘發(fā)細胞死亡。雖然鐵死亡調(diào)控機制復雜，目前仍不明確，但上游通路都是通過各種因素導致的GPX4活性下降，從而可誘導脂質(zhì)過氧化物還原受阻，最終導致細胞發(fā)生鐵死亡［23］。鐵死亡參與了人類的生物過程和多種人類疾病，但是關(guān)于哮喘發(fā)生鐵死亡的證據(jù)很少。此前有研究報道，鐵死亡誘導劑（FINs）可誘導嗜酸性粒細胞鐵死亡，GSH可抑制這種細胞死亡，提示鐵死亡參與了氣道炎癥，抑制鐵死亡可能緩解過敏性氣道炎癥［24］。同時有報道稱重度或輕中度哮喘患者肺泡灌洗液中游離鐵的水平降低，與肺功能降低相關(guān)［25］。所以，鐵死亡是一種鐵依賴的脂質(zhì)過氧化的細胞死亡方式，與氧化應激高度相關(guān)，線粒體是ROS的主要來源，有研究表明與作用廣泛的抗氧化劑相比，特異性靶向線粒體的抗氧化劑在保護細胞免受鐵死亡方面更有效［26］，使用鐵死亡激活劑erastin刺激HT-22和MEF細胞也能觀察到線粒體ROS 顯著增加［27］，這提示我們線粒體ROS參與鐵死亡發(fā)生的過程。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)線粒體膜電位降低，mtROS水平升高，這反映了細胞的氧化損傷［28］。在哮喘小鼠肺組織或HDM刺激的HBE細胞中，GPX-4的表達同樣受到抑制，同時我們還發(fā)現(xiàn)主要負責鐵儲存的鐵蛋白FTH1的表達也發(fā)生上調(diào)，有研究表明，當細胞內(nèi)鐵水平較低時，自噬體可與FTH1結(jié)合，并將自噬體轉(zhuǎn)移到溶酶體中降解，釋放游離鐵離子［29］，引起細胞鐵離子增加，F(xiàn)TH1的上調(diào)表明鐵離子的蓄積，為細胞鐵死亡的啟動做準備。

既往研究表明在腫瘤等［14］疾病中已發(fā)現(xiàn)線粒體損傷與鐵死亡之間存在關(guān)聯(lián)，但具體的調(diào)控機制仍不明，我們研究發(fā)現(xiàn)HDM刺激的HBE細胞同樣存在這種關(guān)系，此外VDAC是錨定在線粒體外膜上的通道蛋白，可以轉(zhuǎn)運線粒體與其他組分之間的離子和代謝產(chǎn)物，這提示了VDAC可能與鐵死亡存在關(guān)聯(lián)，VDAC在哺乳動物上有三種亞型：VDAC1、VDAC2 和VDAC3，其中VDAC1表達最廣泛［8］，既往研究指出erastin可能直接與VDAC結(jié)合導致VDAC的構(gòu)象改變，引起線粒體損傷［30,31］，同時有研究表明鐵死亡誘導劑erastin可作用于VDAC2 和VDAC3，引起鐵死亡，用siRNA 干 預VDAC2/3 表達能抑細胞鐵死亡的發(fā)生，但是過表達VDAC2和VDAC3卻并不能顯著引起erastin誘導下的細胞發(fā)生鐵死亡［32］。而我們研究首次發(fā)現(xiàn)，在HDM誘導的體內(nèi)外模型中，VDAC1的表達都顯著上調(diào)，炎癥細胞浸潤明顯，肺泡灌洗液中的細胞總數(shù)增多，嗜酸粒細胞聚集，而VBIT-4的應用緩解了哮喘引起的上述變化，同時減少了mtROS的積累，恢復氣道上皮細胞GPX4的表達，表明抑制VDAC1減輕了氧化損傷對哮喘起到保護作用。但VDAC1在細胞中充當線粒體“看門人”的作用，可調(diào)控線粒體與其他組分之間離子和代謝產(chǎn)物的跨膜交換［33,34］，功能復雜，有報道指出，VDAC1有多個泛素化位點，不同泛素化方式可讓VDAC1執(zhí)行不同的功能［35-37］，因此VDAC1是否直接發(fā)生構(gòu)象改變造成線粒體功能障礙，導致鐵死亡從而加重氣道炎癥反應仍需要進一步研究。

綜上所述，本研究通過細胞及動物實驗證了VDAC1參與HDM誘導的哮喘氣道炎癥，并可能通過調(diào)控線粒體功能及鐵死亡發(fā)揮作用。VDAC1可能是哮喘新的靶點，以改善哮喘患者的預后結(jié)果。