蘭玉，王凱風(fēng)，藍智賢，周何琪，孫劍

器官衰竭防治國家重點實驗室，廣東省病毒性肝炎研究重點實驗室，南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院感染內(nèi)科，廣東廣州510515

肝細胞癌（HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的第3大原因，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)仍呈上升趨勢，嚴重威脅著人類健康［1］。HCC是肝癌中最常見的類型，占所有病例的90%以上。盡管近幾十年來，HCC的治療已取得很大進展，患者總生存期和生活質(zhì)量有所提高，但在大部分國家5年生存率仍不足30%［2,3］。因此，需要進一步探索HCC的有效預(yù)防和治療手段。

紅葡萄酒是一種由葡萄釀制發(fā)酵而成的酒精飲料，含有大量活性化合物，同時含有13%左右被認定為一級致癌物質(zhì)的酒精［4］。有證據(jù)顯示，在2020年全球所有新發(fā)癌癥病例中，有3.5%與過度飲酒和酗酒有關(guān)［5］，但是有流行病學(xué)研究表明，適度飲用紅酒與肺癌［6］、前列腺癌［7］、結(jié)直腸癌［8］、非霍奇金淋巴瘤［9］等癌癥的風(fēng)險降低有關(guān)，這可能與紅酒中含有的大量多酚類物質(zhì)的抑癌作用有關(guān)［10］。例如，紅酒中提取的白藜蘆醇［11］、類黃酮［12］、花青素［13］、沒食子酸［14］等均已被證實可通過相應(yīng)機制發(fā)揮對HCC的抑制作用。然而，有研究表明，由于不同多酚之間存在協(xié)同作用，相互提高生物利用度和生物效應(yīng)，多酚混合物的抑癌效果優(yōu)于單種多酚［15-17］。脫醇紅酒作為一種含有多種多酚但不含酒精的飲料，可能具有抑制HCC發(fā)生發(fā)展的作用，但是尚無研究報道證實。本研究的目的就是探索脫醇紅酒對HCC發(fā)生發(fā)展的影響，并通過RNA-seq探索其可能的機制，為HCC的預(yù)防和治療提供新策略。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞和動物 所有細胞株包括Huh7，HepG2 和SK-Hep-1購自中國科學(xué)院細胞庫。所有實驗動物包括：①BALB/c-Nu小鼠，4周齡，雄性，體質(zhì)量15±2 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004）；②C57BL/6J 小鼠，2 周齡，雄性，體質(zhì)量8±2 g，購自廣東斯嘉景達生物科技有限公司（動物許可證號：SCXK（粵）2020-0052）。所有動物實驗均由南方醫(yī)院實驗動物倫理委員會審查通過，并遵從動物實驗3R原則。

1.1.2 主要試劑耗材 DMEM、PBS、胰蛋白酶（Gibco）；胎牛血清（ThermoFisher）；Cell Cycle Staining Kit、Annexin V-FITC/PI kit（Multi Sciences）；CCK-8 試劑盒（MCE）；二已基亞硝胺、四氯化碳（Sigma）；橄欖油（阿拉?。?；細胞培養(yǎng)皿、槍頭、注射器等（NEST）。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（Labotect）；光學(xué)顯微鏡（Leica）；多功能酶標儀（BioTek）；生物安全柜、水平臺式離心機、-80 ℃超低溫冰箱（ThermoFisher）；真空冷凍干燥機（LaboGene）；InfluxTM流式細胞分選儀（BD Biosciences）。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫醇紅酒制備 紅葡萄酒產(chǎn)自法國波爾多拉菲羅斯柴德酒莊（傳奇波爾多紅，Vol 13%）。制備方法：第1階段：將紅酒分裝至玻璃容器，密封后放入-80 ℃冰箱過夜使物料凍結(jié)；第2階段：運行真空冷凍干燥機并預(yù)冷，待冷阱溫度降至-110 ℃時進行下一步；第3階段：將已凍結(jié)紅酒迅速轉(zhuǎn)移至冷阱中防止其溶化，放入后旋緊氣孔，打開真空泵持續(xù)抽真空，在真空狀態(tài)（＜100 mTorr）下冷凍干燥12 h。脫醇脫水結(jié)束后密封冷凍保存。實驗時將已脫水脫醇紅酒使用含10%血清的DEME溶液溶解至原體積使用，試劑盒檢測脫醇后酒精含量＜0.5%。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 所有細胞系均使用含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃和5%CO2環(huán)境的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8增殖實驗 取對數(shù)生長期細胞，以2000/孔的細胞密度鋪板至96孔板，每孔100 μL培養(yǎng)基。孵箱中培養(yǎng)8 h至細胞貼壁后，分為對照組（Control）和實驗組（DRW），每組5個重復(fù)孔。使用不同濃度脫醇紅酒溶液（0、5、10、25、50和100 μL/mL）培養(yǎng)48 h；使用含50 μL/mL 脫醇紅酒溶液的培養(yǎng)48和96 h。處理結(jié)束后，棄掉舊培養(yǎng)基，加入10%CCK-8溶液各100 μL，孵育2 h后使用酶標儀檢測450 nm處吸光值（A值）。細胞增殖抑制率（IR%）=（A對照組-A實驗組）/A對照組×100%。

1.2.4 克隆形成實驗 取對數(shù)生長期細胞，以400個細胞/孔的密度鋪板至12孔板培養(yǎng)，待貼壁后加入不同濃度脫醇紅酒（0、10、25和50 μL/mL）培養(yǎng)10 d左右。有適當(dāng)數(shù)量克隆形成時，棄掉舊培養(yǎng)基并用PBS洗滌后，加入4%多聚甲醛固定20 min，再次PBS洗滌，隨后加入0.4%結(jié)晶紫染液染色20 min。染色完成后PBS洗凈染液并晾干，使用相機拍照。使用ImageJ 軟件對克隆形成數(shù)量進行統(tǒng)計及分析。

1.2.5 皮下異種移植腫瘤模型 選擇4周齡雄性BALB/c-nu 裸鼠18只，飼養(yǎng)于SPF 動物房適應(yīng)環(huán)境2 d。將SK-Hep-1細胞以5×106/只的量接種至裸鼠右腹股溝處，接種時于皮下推注100 μL細胞懸液，隨機分為對照組（Control）和實驗組（DRW），n=9只。實驗組每天灌胃給予脫醇紅酒300 μL，對照組給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥28 d，每周測量腫瘤長徑和短徑。腫瘤體積=1/2×長徑×短徑2。

1.2.6 化學(xué)誘導(dǎo)肝癌模型 選擇12 d齡雄性C57BL/6J乳鼠，飼養(yǎng)于SPF動物房適應(yīng)環(huán)境2 d。第14 d時腹腔注射二乙基亞硝胺（DEN，25 mg/kg）1次，第4周開始腹腔注射四氯化碳（CCL4，0.5 mL/kg，溶于橄欖油）每周1次至試驗結(jié)束。第12周時將小鼠隨機分為對照組（n=25）和實驗組（DRW，n=12）并開始干預(yù)。實驗組每天灌胃給予脫醇紅酒300 μL，對照組給與等量生理鹽水。干預(yù)至第18周時，麻醉后采用頸椎脫臼法將小鼠處死，剖腹取出肝臟，測量并記錄肝臟腫瘤數(shù)量、最大腫瘤直徑和肝臟質(zhì)量。肝體比=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.2.7 RNA-seq 取對數(shù)生長期的Huh7細胞接種至6孔板，培養(yǎng)至細胞貼壁后，實驗組使用60 μL/mL的脫醇紅酒溶液處理，對照組不干預(yù)，培養(yǎng)48 h。使用Trizol試劑裂解細胞，以提取總RNA。委托深圳華大基因股份有限公司使用BGISEQ平臺進行測序服務(wù)，使用DESeq2對實驗組和對照組進行差異基因表達分析。相關(guān)差異基因列表已公開至“國家生物信息中心國家生物信息中心OMIX 多元數(shù)據(jù)歸檔庫”（ID：OMIX004295，網(wǎng)址:https://ngdc.cncb.ac.cn/omix/）。

1.2.8 基因集富集分析（GSEA）參照分子標簽數(shù)據(jù)庫（MsigDB）中的HALLMARK類別的基因集，對經(jīng)過篩選的差異基因（|log2FC|≥2，Q≤0.05）采用GSEA進行基因集富集分析。將與對照組比較出現(xiàn)異常的基因集信號通路按照標準化富集分數(shù)（NES）值降序排列，結(jié)果中ES為富集分數(shù)，NES為標準化后的富集分數(shù)，NOMp-val為名義P值，是對ES的統(tǒng)計學(xué)分析，F(xiàn)DR p-val為錯誤發(fā)現(xiàn)率。當(dāng)NES 絕對值＞1，NOMp-val＜0.05 且FDRq-val＜0.25時，其通路下的基因集被認為有意義。

1.2.9 流式細胞術(shù) 選擇對數(shù)生長期細胞接種至6孔板中，使用不同濃度脫醇紅酒溶液（0、75和150 μL/mL）培養(yǎng)48 h。分別使用Cell Cycle Staining試劑盒和Annexin V-FITC/PI試劑盒處理并收集所得的細胞，操作均按照標準化步驟進行，然后通過流式細胞儀進行檢測，細胞周期分布和細胞凋亡情況使用FlowJo 7.6 軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析并繪制圖表，采用R 3.6.0 進行差異基因篩選，采用GSEA4.3.2 軟件進行基因集富集分析。計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，每項實驗至少重復(fù)3次。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脫醇紅酒抑制肝癌細胞的增殖活性

脫醇紅酒以劑量和時間依賴的方式抑制Huh7和HepG2的增殖（圖1）。脫醇紅酒對兩種細胞的抑制具有劑量效應(yīng)，隨著劑量升高抑制率逐漸增大，對Huh7和HepG2的IC50分別為55.81和23.85 μL/mL。在固定濃度（50 μL/mL）下，脫醇紅酒對兩種細胞的抑制具有時間效應(yīng)，時間越久，細胞活力越弱。

圖1 DRW對肝癌細胞的增殖抑制作用Fig. 1 Inhibitory effect on dealcoholized red wine(DRW)on proliferation of HCC cells.A:Inhibition rate and A valve of Huh7 cells. B: Inhibition rate and OD valve of HepG2 cells.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs DRW group.

2.2 脫醇紅酒抑制肝癌細胞的克隆形成能力

脫醇紅酒以劑量依賴的方式抑制Huh7 和SKHep-1細胞的克隆形成能力，劑量越高克隆形成數(shù)量越少（圖2）。Huh7細胞中，實驗組（10、25和50 μL/mL）克隆形成數(shù)量相較于對照組均減少，其中25和50 μL/mL組顯著減少（P＜0.001，圖2B）；SK-Hep-1細胞中，實驗組（10、25和50 μL/mL）克隆形成數(shù)量相較于對照組均顯著減少（P＜0.001，圖2C）。

圖2 DRW對肝癌細胞克隆形成數(shù)量的影響Fig. 2 Effect of dealcoholized red wine (DRW) on clone formation of HCC cells. A: Gross observation of the colonies.B:Colony number of Huh7 cells.C:Colony number of Sk-Hep-1 cells.***P＜0.001 vs Control group.

2.3 脫醇紅酒抑制裸鼠異種移植腫瘤的生長

脫醇紅酒的干預(yù)能夠抑制裸鼠皮下荷瘤的生長，脫醇紅酒組的腫瘤生長速度顯著慢于對照組（圖3）。第4周時兩組腫瘤大小（圖3A），結(jié)果顯示實驗組腫瘤的體積（646.2±206.5 mm3）顯著小于對照組（360.7±164.3 mm3），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3B）。

圖3 DRW抑制裸鼠皮下荷瘤的生長Fig. 3 Dealcoholized red wine(DRW)inhibits subcutaneous HCC xenograft growth in nude mice.A:General observation of the tumors.B:Tumor growth curve of DRW and Control groups.*P＜0.05 vs DRW group.

2.4 脫醇紅酒抑制小鼠化學(xué)誘導(dǎo)原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展

本實驗采用DEN聯(lián)合CCl4誘導(dǎo)小鼠肝癌的發(fā)生，造模示意圖及兩組代表性肝臟腫瘤生長情況（圖4A、B）。該模型結(jié)合了DEN誘導(dǎo)的DNA損傷和突變，及CCl4介導(dǎo)的炎癥和纖維化，最終導(dǎo)致小鼠肝臟腫瘤發(fā)生，與人類HCC的微環(huán)境具有一些共同特征［18］。結(jié)果顯示，脫醇紅酒顯著抑制小鼠肝臟腫瘤發(fā)生和發(fā)展，表現(xiàn)為實驗組肝臟腫瘤數(shù)目（10.8±3.6）顯著少于對照組（18.2±5.9，P＜0.001，圖4C），最大腫瘤直徑（4.3±1.00 mm）顯著小于對照組（5.1±0.9 mm，P＜0.05，圖4D），肝體比（4.9±0.38）也顯著低于Control 組（5.45±0.48，P＜0.01，圖4E）。

圖4 DRW抑制化學(xué)誘導(dǎo)小鼠肝癌的發(fā)生發(fā)展Fig. 4 DRW inhibits occurrence and progression of chemically induced HCC in mice.A:Experimental design of DEN/CCL4-induced mouse model.B:General view of HCC in the two groups.C-E:Tumor number,largest tumor diameter and liver/body ratio in the control group(n=25)and DRW group(n=12).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.5 脫醇紅酒對Huh7細胞轉(zhuǎn)錄組及通路的影響

對Huh7 細胞進行RNA-seq 共得到1112 個顯著差異基因（|log2FC|≥2，Q≤0.05），其中實驗組上調(diào)478個，下調(diào)634 個?；蚣患治鼋Y(jié)果顯示，脫醇紅酒干預(yù)使細胞周期相關(guān)通路（包括E2F TARGETS、G2M CHECKPOINT 和MYC TARGETS 等基因集）顯著下調(diào)（表1），細胞凋亡通路（Apoptosis）顯著上調(diào)（表2）。

表1 DRW組下調(diào)信號通路Tab.1 Down-regulated signaling pathways in DRW group

表2 DRW組上調(diào)信號通路Tab.2 Up-regulated signaling pathways in DRW group

2.6 脫醇紅酒誘導(dǎo)Huh7細胞周期G1期阻滯和細胞凋亡

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，脫醇紅酒能夠誘導(dǎo)Huh7細胞的G1期阻滯，75 μL/mL和150 μL/mL組的G1期細胞占比[（60.5±0.63）%和（63.9±0.58）%]相比于對照組[（45.5±0.62）%]顯著增加（P＜0.001，圖5C）；同時脫醇紅酒也能夠誘導(dǎo)細胞凋亡，75 μL/mL和150 μL/mL組凋亡率[（46.5±1.4）%和（50.6±2.5）%]相比于對照組[（2.7±0.1）%]顯著增加（P＜0.001，圖5D）。

圖5 DRW誘導(dǎo)Huh7細胞周期G1期阻滯和細胞凋亡比例增加Fig. 5 DRW induces G1 phase arrest and apoptosis of Huh7 cells.A:Cell cycle distribution in DRW(75 and 150 μL/mL)and control groups.B:Flow cytometric analysis of cell apoptosis in DRW(75 and 150 μL/mL)and control groups. C: Percentage of cell population in G1,S and G2 phases in different groups. D: Cell apoptosis rates in different groups.***P＜0.001.

3 討論

HCC是一個全球性的嚴重健康問題，迫切需要我們探索新的預(yù)防和治療手段［19］。細胞周期和凋亡失調(diào)是所有腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機制之一，也被認為是HCC預(yù)防和治療的潛在靶點［20,21］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，脫醇紅酒能夠抑制HCC的發(fā)生發(fā)展，并初步探明其機制涉及脫醇紅酒誘導(dǎo)的肝癌細胞周期G1期阻滯和細胞凋亡，這顯示了脫醇紅酒應(yīng)用于肝癌預(yù)防和治療的潛在價值。

脫醇紅酒的抗癌特性一直受到人們關(guān)注，并且在幾個靶器官中已被報道，如結(jié)腸癌、皮膚癌、神經(jīng)纖維瘤和骨肉瘤［22-25］，我們的研究結(jié)果首先發(fā)現(xiàn)了脫醇紅酒能夠抑制HCC的發(fā)生發(fā)展，進一步擴展了脫醇紅酒的應(yīng)用范圍。細胞增殖失控是癌癥早期發(fā)生和后期進展中的核心要素，被認為是肝癌發(fā)病機制的重要基礎(chǔ)［26,27］。因此，尋找能夠抑制肝癌細胞增殖的藥物是篩選抗腫瘤藥物的關(guān)鍵步驟。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脫醇紅酒能夠以劑量和濃度依賴的方式抑制多種肝癌細胞的增殖和克隆形成能力，這說明脫醇紅酒具備抗HCC的潛力。隨后，我們利用裸鼠皮下瘤和化學(xué)誘導(dǎo)肝癌小鼠模型對脫醇紅酒的抑癌作用做了進一步驗證。結(jié)果顯示，脫醇紅酒干預(yù)后，裸鼠腫瘤體積顯著減小，化學(xué)誘導(dǎo)小鼠肝癌的數(shù)量和大小也顯著低于對照組。這些結(jié)果均表明，脫醇紅酒具有很好的抑制HCC發(fā)生發(fā)展的作用。脫醇紅酒的抑癌作用有賴于其含有的多酚，既往已有大量研究顯示紅酒多酚具有抗癌活性［28-30］，如白藜蘆醇、類黃酮、兒茶素和花青素均已被證實具有抗肝癌作用［12,31-33］。并且，研究顯示多酚相互之間能夠通過抑制葡萄糖醛酸化和磷酸化而提高生物利用度，具有協(xié)同抗癌作用［34,35］。在使用脫醇紅酒的混合物時，可以更好地觀察到葡萄酒多酚的保護作用［36］。脫醇紅酒作為富含多酚等活性化合物的混合物，由于酒精脫除，既可避免攝入乙醇對人體健康的不良影響，又可一定程度上保持葡萄酒的風(fēng)味與化合物性質(zhì)的穩(wěn)定，并且制備方法簡單成熟［37］，更具有進一步開發(fā)為抗腫瘤藥物的應(yīng)用價值。

為了進一步探究脫醇紅酒抑制HCC發(fā)生發(fā)展的機制，我們利用RNA-seq 對肝癌細胞進行了mRNA 測序。GSEA分析發(fā)現(xiàn)，脫醇紅酒的干預(yù)能夠顯著下調(diào)細胞周期相關(guān)通路的基因集（包括E2F Targets、G2M Checkpoint和MYC Targets），同時顯著上調(diào)細胞凋亡相關(guān)通路基因（APOPTOSIS）。有研究顯示，E2F靶點和G2M檢查點相關(guān)基因在肝癌組織中高表達，與肝癌患者預(yù)后不良相關(guān)［38］。E2Fs是一個復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族，主要調(diào)控G1-S期細胞周期基因的轉(zhuǎn)錄，E2F靶點基因的異常表達會激活致癌E2F的活性，最終導(dǎo)致腫瘤細胞不受控制的增殖［39］。靶向細胞周期，包括影響E2F活性的細胞周期成分，被證明是癌癥治療的關(guān)鍵策略［40］。G2M檢查點也是抗腫瘤藥物開發(fā)的領(lǐng)域之一，許多靶向G2M 檢查點的小分子抑制劑能夠用于治療癌癥［41,42］。有研究顯示紅酒多酚共同作用能夠通過誘導(dǎo)細胞周期阻滯和促進凋亡的方式協(xié)同保護結(jié)腸癌［17,43］。結(jié)合我們的結(jié)果，提示脫醇紅酒可能通過細胞周期和凋亡相關(guān)通路基因的介導(dǎo)從而發(fā)揮抑癌作用。接下來，我們利用流式細胞術(shù)檢測驗證了脫醇紅酒對細胞周期分布和凋亡的影響。結(jié)果顯示，脫醇紅酒能夠阻滯細胞周期從G1期到S期的過度，并且誘導(dǎo)細胞凋亡，與以上結(jié)果相符。這些結(jié)果提示脫醇紅酒可能通過細胞周期和凋亡相關(guān)通路基因的介導(dǎo)，誘導(dǎo)細胞周期G1期阻滯和凋亡從而抑制HCC的發(fā)生發(fā)展。需要說明的是，脫醇紅酒作為多種活性化合物的混合物，其抑制HCC的機制可能是多方面、多靶點的［44］。我們的結(jié)果雖尚未闡明脫醇紅酒發(fā)揮作用的具體靶點，但為后續(xù)研究提供了一定的參考依據(jù)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明脫醇紅酒能夠通過誘導(dǎo)肝癌細胞周期G1期阻滯和細胞凋亡從而抑制HCC的發(fā)生發(fā)展。這些結(jié)果為HCC預(yù)防和治療提供了新思路和潛在手段，后續(xù)研究仍需進一步闡明其潛在機制和具體靶點以促進其臨床轉(zhuǎn)化。