【摘要】為篩選出對(duì)小麥赤霉菌有拮抗作用的生防放線菌，本文采用平板畫線法、對(duì)峙法等進(jìn)行放線菌的篩選。根據(jù)對(duì)小麥赤霉菌的抑菌率大小選定最優(yōu)抑菌效果的放線菌。放線菌液體培養(yǎng)基經(jīng)搖瓶發(fā)酵、正交試驗(yàn)優(yōu)化其培養(yǎng)基配料發(fā)酵條件，確定其發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，并利用牛津杯法比較抑菌圈的直徑平均值選擇最優(yōu)的組成比例。

【關(guān)鍵詞】小麥赤霉菌；生防放線菌；抑菌圈；發(fā)酵優(yōu)化；正交試驗(yàn)

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.05.030

Screening and Identification of Biocontrol Actinomycetes Against Wheat Scab and Optimization of Fermentation Conditions

JIN Keke

（Anhui Zhongqing Inspection and Testing Co.， Ltd.， Hefei 230088， China）

Abstract： In order to screen biocontrol actinomycetes that have antagonistic effects on wheat scab， this article uses plate drawing method， confrontation method， etc. to screen actinomycetes. Select the actinomycetes with the best antibacterial effect based on the antibacterial rate of biocontrol actinomycetes against wheat scab. The liquid culture medium of actinomycetes was subjected to shake flask fermentation and orthogonal experiments to optimize the fermentation conditions of the culture medium ingredients. Determine the composition of its fermentation medium and use the Oxford Cup method to compare the average diameter of the antibacterial zone to select the optimal composition ratio.

Key words： fusarium graminearum； biocontrol actinomycetes； antibacterial circle； fermentation optimization； orthogonal test

小麥赤霉病又稱爛穗病、麥秸枯、爛麥頭、紅麥頭、紅頭瘴。多發(fā)生在安徽西北部，因陰雨較多，導(dǎo)致小麥種植區(qū)域易發(fā)生小麥赤霉病。禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum Schw.）是小麥赤霉病的主要病原菌之一[1]。其發(fā)病率高，容易使小麥產(chǎn)量損失嚴(yán)重，每畝可減產(chǎn)10%～40%。大多小麥種植區(qū)都是以化學(xué)農(nóng)藥防御為主，效果不太顯著，而且逐年加大農(nóng)藥使用會(huì)導(dǎo)致農(nóng)藥殘留越來(lái)越多沉積在小麥中，不僅污染周圍的健康環(huán)境，還增強(qiáng)了小麥赤霉病的抗藥性。將微生物作用到農(nóng)作物病害預(yù)防治療上，不僅無(wú)環(huán)境污染、無(wú)農(nóng)藥殘留、不增強(qiáng)病菌抗病性，還能達(dá)到預(yù)防病害的效果，因此微生物液體農(nóng)藥是目前農(nóng)作物病蟲害防治的主題。微生物的分離、純化、篩選、發(fā)酵等研究將是微生物農(nóng)藥研究試驗(yàn)重點(diǎn)中的重點(diǎn)。篩選出抑制效果較好的放線菌，研究其發(fā)酵液的優(yōu)化條件，制成有預(yù)防作用的微生物農(nóng)藥，將有利于小麥的生長(zhǎng)和增產(chǎn)。放線菌培養(yǎng)基條件的優(yōu)化和生物農(nóng)藥的研究將有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

1材料和方法

1.1儀器設(shè)備

電子分析天平（YP30002，佑科儀器），立式壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-70A型，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司），雙人潔凈工作臺(tái)（OptiClean 1300），生化培養(yǎng)箱（LRH-250，上海一恒科學(xué)儀器有限公司），格蘭仕微波爐[P70D20P-TE（WO）型，格力公司]。

1.2材料和試劑

1.2.1小麥赤霉菌來(lái)源

皖西學(xué)院大別山植物內(nèi)生真菌資源研究中心所保存的部分放線菌和小麥赤霉病病原菌。

1.2.2試劑、培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基，高氏一號(hào)培養(yǎng)基。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1。

1.3.2小麥赤霉病病原菌和放線菌

將得到的小麥赤霉病病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行菌種活化培養(yǎng)，供試放線菌接種到高氏1號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行菌種活化培養(yǎng)（恒溫恒濕培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)3 d）。培養(yǎng)出的菌落無(wú)異常后，分別進(jìn)行菌種斜面保存。如果出現(xiàn)其他雜菌現(xiàn)象，重新培養(yǎng)、提純、斜面保存，直到培養(yǎng)得到純種菌。

1.3.3供試放線菌的抑菌篩選

1.3.3.1初篩

采用十字交叉對(duì)峙法[2]，在同一平板中涂上有拮抗作用的物質(zhì)。若供試放線菌對(duì)小麥赤霉病病原菌有抑制作用，則培養(yǎng)基上的菌落無(wú)法完全重合，有一定的弧度，放線菌菌落周圍會(huì)出現(xiàn)空白區(qū)域。無(wú)放線菌和小麥赤霉病病原菌生長(zhǎng)，形成不能完全密封的空白區(qū)域。

使用微波爐加熱滅過(guò)菌的PDA培養(yǎng)基至液體，冷卻至55℃左右，在超凈工作臺(tái)面上，酒精燈火焰旁倒平板，靜置冷卻至固體；用接種環(huán)從1.3.2中活化后的小麥赤霉菌菌絲，沿著PDA培養(yǎng)基平板中點(diǎn)向兩邊的培養(yǎng)皿邊緣劃一個(gè)交叉的十字，把培養(yǎng)基均勻劃分為四個(gè)區(qū)域；再用已滅菌的接種挑取適量大小的供試放線菌接種到培養(yǎng)基四個(gè)區(qū)域的邊緣中間，用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿的底部標(biāo)記供試放線菌的編號(hào)，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d。

1.3.3.2復(fù)篩

小麥赤霉病菌菌懸液。把1.3.2中活化的菌株，用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)的菌落上取兩環(huán)菌絲，放到裝有無(wú)菌水容量為250 mL的錐形瓶中，搖晃均勻，使菌均勻的分散開(kāi)。

放線菌對(duì)小麥赤霉病病原菌拮抗作用越大，周圍抑菌圈越大。反之抑菌圈越小，拮抗作用越小，對(duì)小麥赤霉病病原菌的抑制效果越高。

挑取1.3.3.1初篩出有抑制作用的防線菌瓊脂塊，接種在涂布均勻小麥赤霉病病原菌的培養(yǎng)基正中，擺正放入30℃培養(yǎng)箱3 d，取出觀察記錄是否放線菌周圍出現(xiàn)抑菌圈和抑菌圈的大小。

1.3.4優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1放線菌搖液制備

將1.3.3.2復(fù)篩出的抑制圈直徑最大的放線菌菌株活化后，接入高氏1號(hào)培養(yǎng)液中，固定于30℃，150 r/min恒溫?fù)u床搖5 d，備用。

1.3.4.2發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇

用移液槍接種1.3.4.1中放線菌液1 mL到錐形瓶?jī)?nèi)，30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)5 d，重復(fù)3次。用牛津杯法做抑菌圈試驗(yàn)，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.4.3發(fā)酵條件的優(yōu)化

通過(guò)正交試驗(yàn)獲得最佳培養(yǎng)基[3]，用最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵放線菌，發(fā)酵放線菌發(fā)酵條件（包括初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間）采用單一變量法優(yōu)化，用抑菌圈直徑表示，尋找最佳發(fā)酵條件。

2結(jié)果與分析

2.1純化與保存結(jié)果

如下圖2、圖3所示，菌落質(zhì)地致密，表面呈絨狀、干燥、多皺，菌落較小。

2.2放線菌初步篩選的結(jié)果

根據(jù)上述初篩試驗(yàn)，從提供的供試放線菌中選出有抑制作用，扇形區(qū)域面積最大的三株供試放線菌，分別為放線菌281、放線菌105。如圖4、圖5所示，圖片下方區(qū)域接種放線菌的地方有明顯的一塊扇形區(qū)域。105號(hào)放線菌對(duì)小麥赤霉菌具有抑制作用。

2.3供試放線菌對(duì)小麥赤霉菌二次篩選的結(jié)果

如圖6、圖7所示，抑菌結(jié)果相比較，可以看出對(duì)小麥赤霉菌抑制作用最明顯的為67號(hào)放線菌。

2.4優(yōu)化放線菌發(fā)酵條件結(jié)果

2.4.1優(yōu)化選擇發(fā)酵培養(yǎng)基配料結(jié)果

在配制供試的4種培養(yǎng)基中，2、3、4號(hào)培養(yǎng)基抑菌效果不明顯（牛津杯抑菌圈法）。1號(hào)培養(yǎng)基抑菌圈直徑平均值最大（見(jiàn)圖8、圖9）。因此選用1號(hào)培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，配方為：黃豆粉、蛋白胨、葡萄糖、MgSO4·7H2O、KH2PO、CaCO3。

2.4.2放線菌發(fā)酵液條件優(yōu)化結(jié)果

2.4.2.1培養(yǎng)基的配料對(duì)發(fā)酵的影響

正交試驗(yàn)采用黃豆粉（1.5%～3.5%，按1%遞增）、蛋白胨（1%～1.5%，按0.5%遞增）、葡萄糖（1%～1.5%，按0.5%遞增）3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平所選的3種營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)于放線菌67號(hào)菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響大小程度依次為：蛋白胨﹥黃豆粉﹥葡萄糖。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析出，最佳配方為：2.5%黃豆粉、2%蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.05%MgSO4·7H2O、0.1%KH2PO4、0.5%CaCO3，見(jiàn)表1。

2.4.2.2培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響

如圖10所示，發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液產(chǎn)生抑菌物質(zhì)有很大的影響。在24～60 h，隨著時(shí)間的遞增，抑菌圈大小逐漸增加，在60 h左右時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大，之后逐漸下降，此時(shí)67號(hào)放線菌生成的抑菌物質(zhì)達(dá)到最大。因此60 h為最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間。

2.4.2.3初始pH值對(duì)發(fā)酵液培養(yǎng)的影響

如圖11所示。發(fā)酵液初始pH值設(shè)定在5.5～8.5之間，67號(hào)放線菌發(fā)酵液產(chǎn)生的抑菌圈在pH值5.5～7.5之間直徑逐漸增大。在pH值為7.5左右抑菌圈為最大值，隨后逐漸變小。所以7.5為發(fā)酵最優(yōu)初始pH值。

2.4.2.4培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵的影響

如圖12所示，使用最佳培養(yǎng)基，確認(rèn)其他變量不變，改變搖床內(nèi)發(fā)酵液的環(huán)境溫度，記錄隨時(shí)間變化抑菌圈的大小。在25～35℃之間，67號(hào)放線菌能產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)較多，30℃時(shí)放線菌抑菌圈直徑達(dá)到最大。因此30℃為最佳發(fā)酵溫度。

3結(jié)束語(yǔ)

本文通過(guò)對(duì)小麥赤霉病病原菌和放線菌分別進(jìn)行純化與保存，通過(guò)選擇配方、培養(yǎng)時(shí)間、pH值，以及發(fā)酵溫度優(yōu)化條件得出最佳配方為：2.5%黃豆粉、2%蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.05%MgSO4·7H2O、0.1%KH2PO4、0.5%CaCO3。60 h為最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間，7.5為發(fā)酵最優(yōu)初始pH值，30℃為最佳發(fā)酵溫度，篩選鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化出67號(hào)放線菌，為后期解決放線菌對(duì)小麥赤霉菌的抑菌作用、放線菌抑菌因素、微生物農(nóng)藥的制備因素提供基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]全國(guó)小麥赤霉病研究協(xié)作組.我國(guó)小麥赤霉病穗部鐮刀菌種類、分布及致病性[J].上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)，1984（3）：69-82.

[2]陸凡，陳志誼，劉永鋒，等.拮抗細(xì)菌處理稻種對(duì)水稻惡苗病的防治效果及對(duì)水稻產(chǎn)量形成的影響[J].中國(guó)生物防治，1999，15（2）：59-61.

[3]孫會(huì)強(qiáng)，周賽男，譚周進(jìn)，等.一株煙草內(nèi)生拮抗放線菌發(fā)酵條件優(yōu)化[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2011，17（6）：914-917.

【作者簡(jiǎn)介】

靳苛苛，女，1991年出生，助理工程師，學(xué)士，研究方向?yàn)闄z驗(yàn)檢測(cè)。

（編輯：李加鵬）