楊曉露 陳春曙 崔子璇 田德才 朱琳 牛軍鵬 惠偉

摘要：【目的】植物天然抗氧化物紫檀芪（pterostilbene，Pte）在抑制果實病害方面具有重要的作用，但在處理果實時由于缺少乳化劑導致水溶液不穩(wěn)定，很難在果實中展著和吸附，從而影響藥效發(fā)揮。旨在研制紫檀芪乳油制劑（pterostilbeneemulsifiable，Pte EC）以提高原藥藥效并研究其對碭山酥梨虎皮病的控制效果?！痉椒ā恳宰咸窜螢橛行С煞?，對其制劑進行溶劑、乳化劑篩選，并對乳油的質(zhì)量進行測定，確定最佳配方。在此基礎(chǔ)上以碭山酥梨為試材，研究二苯胺（diphenylamine，DPA）、Pte 和Pte EC對冷藏[溫度（-1 ± 0.5）℃，濕度90%～95%]和貨架期果實品質(zhì)的影響。【結(jié)果】10%紫檀芪乳油制劑的最佳配方為10%紫檀芪+ 10%吐溫20 + 80%無水乙醇。DPA、Pte 和Pte EC處理均可較好保持冷藏期間梨果實硬度等指標，同時能有效抑制冷藏期間梨果皮H2O2、丙二醛和共軛三烯的積累，從而抑制虎皮病的發(fā)生。

冷藏至210 d 時，DPA、Pte 和Pte EC處理組發(fā)病率分別比對照組低28.69%、12.19%和15.32%，且Pte EC對梨虎皮病的控制效果僅次于DPA，較Pte 處理效果好?！窘Y(jié)論】Pte EC優(yōu)于Pte，且綠色安全，能有效控制碭山酥梨虎皮病的發(fā)生，值得進一步進行商業(yè)應用的推廣示范。

關(guān)鍵詞：碭山酥梨；紫檀芪；乳油；二苯胺；虎皮病

中圖分類號：S661.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）03-0536-11

碭山酥梨（Pyrus bretschneideri Rehd.‘Dangshansuli）是中國栽培面積最大的梨品種，以果形端正、黃亮美觀、皮薄多汁、口感酥脆和耐貯等特點而著稱，具有潤肺止咳和清喉降火等功效。但在貯藏中后期易發(fā)生虎皮病，嚴重影響貯藏品質(zhì)。二苯胺（diphenylamine，DPA）和乙氧基喹可有效防止果實虎皮病的發(fā)生，但由于DPA殘留產(chǎn)生潛在致癌物和乙氧基喹毒害問題，在許多國家已被禁止使用[1]。

近年來，廣譜、低毒和高效的天然提取物是果蔬保鮮行業(yè)研究的熱點領(lǐng)域，多數(shù)研究表明香辛料提取物、植物精油（作為植物組織的次生代謝產(chǎn)物）和中草藥類植物提取物有抗菌防腐和調(diào)節(jié)果蔬生理功能的作用[2]，而且綠色安全環(huán)保，具有開發(fā)植物源保鮮劑的巨大潛力。

紫檀芪（pterostilbene，Pte）是一種天然的植物抗毒素，屬于酚類化合物的二苯乙烯家族[3]，是白黎蘆醇的甲基化衍生物。最初從檀香中分離得到，其后在血竭、蜂膠、藍莓和葡萄等中均有發(fā)現(xiàn)。Pte具有與白藜蘆醇相似的藥理活性，如抗氧化、抗病原微生物、抗腫瘤和保護神經(jīng)等功能[4]。白藜蘆醇防治蘋果和梨的虎皮病和改善果品品質(zhì)的研究已有報道[5-8]。與其他二苯乙烯化合物類似，與白藜蘆醇相比，Pte 在A-苯環(huán)上多2 個甲氧基，表現(xiàn)出更高的生物活性、穩(wěn)定性和利用性[4，9]。據(jù)報道，Pte 在抑制果實病害方面發(fā)揮重要作用。徐丹丹[10]研究發(fā)現(xiàn)，Pte 處理能顯著抑制荔枝霜疫霉和葡萄灰霉病，同時抑制荔枝褐變。楊佳瑤等[11]研究提到，葡萄葉提取物中含有白藜蘆醇和Pte，且均對葡萄霜霉病具有防治效果，且Pte 的抑菌活性要優(yōu)于白藜蘆醇，這與Pezet 等[12]的結(jié)果一致。此外，Koh 等[13]研究表明，Pte 是一種有效的殺菌劑和殺孢子劑，能夠顯著抑制油菜莖基潰瘍病的發(fā)生。Qi 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Pte 及其衍生物還可以作為針對植物細菌疾病的生物膜的抗菌劑。但Pte 在果品保鮮和虎皮病防治方面尚未見報道。

筆者實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)Pte 對蘋果和梨的采后品質(zhì)保持和虎皮病防治有明顯效果，但處理時由于缺少乳化劑導致溶液不穩(wěn)定，有固體析出；同時由于果皮蠟質(zhì)層的影響，Pte 水溶液很難在果實表面充分展著和吸附，導致原藥在果實上滯留時間短，從而影響藥效的發(fā)揮。因此，筆者在本研究中旨在探究紫檀芪乳油制劑（pterostilbene emulsifiable，Pte EC）的最佳配方，并通過其與Pte、DPA 對采后碭山酥梨果實貯藏品質(zhì)和虎皮病的控制效果，探究紫檀芪乳油制劑Pte EC 能否提高藥效以替代DPA在生產(chǎn)上的應用，并為今后虎皮病的調(diào)控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 紫檀芪乳油制劑的配方研究

1.1.1 供試試劑原藥：紫檀芪（純度≥ 99.0%）購自西安晶博生物科技有限公司。

溶劑：無水乙醇、菜籽油、碳酸二甲酯、乙酸乙酯和甘油。

乳化劑：雙乙酰酒石酸單雙甘油酯、硬脂酰乳酸鈉、聚甘油單硬脂酸和酪蛋白乳酸鈉（食品級）；吐溫20、吐溫40、吐溫80、司盤20、EL-40（分析純）和大豆磷脂。

以上藥品均購自西安晶博生物科技有限公司，中國。

1.1.2 乳油的配方

（1）溶劑的選擇。參照郭武棣[15]的方法進行篩選。向試管中加入1.2 g 原藥，用移液管吸取2 mL的溶劑加入試管中，觀察其溶解情況，如不能完全溶解可用渦旋震蕩儀或微熱加以溶解。如還不能溶解，繼續(xù)用移液管吸取2 mL的溶劑加到試管中，重復此操作。直至溶劑加到10 mL時仍未完全溶解，則舍棄該溶劑。將溶解度大于10%，且在冰箱中（0 ℃）中貯藏3 d 后無沉淀或結(jié)晶的溶劑用作后續(xù)試驗。

（2）乳化劑的選擇。參照江志利[16]的方法。在精油中加入一定量（10%）的乳化劑，混合均勻后，在室溫靜置1 d，然后根據(jù)制劑的外觀、乳化性能及冷貯（0 ℃，3 d）穩(wěn)定性選擇乳化劑，能形成透明均一的單相液體，乳化性能好，且在冷貯中無結(jié)晶析出的乳化劑入選。

1.1.3 乳油的質(zhì)量檢測方法

（1）乳化分散性。乳化分散性試驗參照GB/T 32775—2016 測定，并對乳油乳化分散性的劃分等級進行觀察和記錄，乳化分散性為1～3 級為合格，4～5 級為不合格[16]。

（2）乳液穩(wěn)定性、熱貯穩(wěn)定性和冷貯穩(wěn)定性測定方法。參考GB/T 1603—2001 測定乳液的穩(wěn)定性。

參考GB/T 19136—2003 測定乳液的熱貯穩(wěn)定性。

參照江志利[16]的方法，用注射器吸取10.0 g 乳油試樣注入離心管，將離心管在0 ℃冰箱中靜置1 h，在此期間每隔15 min 攪拌1 次，并觀察和記錄是否有沉淀或油狀物析出。將離心管放回0 ℃冰箱靜置7 d，隨后取出拭凈，靜置3 h 后，離心15 min。如無離析物或離析小于0.3 g 為合格。

1.1.4 乳油制劑的配方研究

（1）溶劑的篩選。本試驗選用無水乙醇、95%乙醇、菜籽油、碳酸二甲酯、乙酸乙酯和甘油溶劑溶解Pte，按照1.1.2（1）進行篩選，觀察不同溶劑對紫檀芪的溶解情況。

（2）乳化劑的篩選。在最佳實驗條件下，按照1.1.2（2）對Pte 的乳化劑進行初步篩選，評價乳化結(jié)果并記錄冷貯后的現(xiàn)象。

（3）乳化分散性的測定。選擇最佳溶劑和初步篩選的乳化劑制備Pte EC并進行乳化分散性試驗，觀察最佳溶劑和不同乳化劑組合下Pte EC 的乳化分散效果。

（4）乳液穩(wěn)定性、熱貯穩(wěn)定性和冷貯穩(wěn)定性的測定。確定最佳配方后，按照1.1.3（2）對乳液的穩(wěn)定性、熱貯穩(wěn)定性和冷貯穩(wěn)定性進行檢測和結(jié)果評價。

1.2 紫檀芪制劑與DPA對碭山酥梨虎皮病的控制效果研究

1.2.1 采收和處理 2020-09-18 于陜西省銅川市商業(yè)果園采收碭山酥梨，采收時選取成熟度一致、大小相近、無病蟲害和機械損傷的果實。采收當天運回陜西華圣果業(yè)有限公司，次日進行各處理：2500 μL·L-1 DPA 水溶液浸泡2 min（在實驗室前期研究中，2500 μL · L- 1 是抑制虎皮病的最佳體積分數(shù)）；10 mg·L-1 Pte 水溶液處理2 min；10% Pte EC稀釋成10 mg·L-1水溶液處理2 min；對照組（CK）不做任何處理。處理后用發(fā)泡網(wǎng)包裝箱入庫冷藏[貯藏條件：（-1 ± 0.5）℃，RH為90%～95%]。貯藏期間每隔30 d 隨機取10 個梨果實，每個處理3 次重復。取出立即帶回實驗室測定果實品質(zhì)指標后，用液氮研磨果皮（厚度約0.5 mm）取樣保存于-80 ℃下，以供后續(xù)試驗。

1.2.2 指標測定 （1）品質(zhì)指標的測定。硬度：每個處理組取10 個果實，使用FT-327 型硬度計測定果肉硬度，將梨靠近果體赤道部位對稱的2 個部位去皮，將直徑為1.1 cm 的探頭刺入梨果肉深0.8 cm，讀數(shù)顯示果肉硬度值，單位為kg·cm-2。

可溶性固形物（soluble solids content，SSC）含量：使用PAL-1 型數(shù)顯手持糖度計測定單果赤道兩對稱面果汁SSC含量，單位為%。

可滴定酸（titratable acid，TA）含量：每個處理隨機取10 個果實，均勻取100 g 果肉采用酸堿指示劑滴定法進行測定。

（2）丙二醛含量、DPPH自由基清除能力和過氧化氫含量的測定。丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量參照許婷婷等[17]的方法，采用硫代巴比妥酸比色法測定，單位為nmol·g-1。

過氧化氫（H2O2）含量測定參照許婷婷等[17]的方法，單位為nmol·g-1。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力參照陳瑋琦等[18]方法測定。

（3）α-法尼烯和共軛三烯含量的測定。參考Zhao等[19]的方法測定α-法尼烯、共軛三烯含量，單位為nmol·g-1。

（4）虎皮病發(fā)病率和病情指數(shù)的測定?；⑵げ“l(fā)病率計算公式：發(fā)病率（%）=（發(fā)病果個數(shù)/總果個數(shù)）×100。每處理組隨機選取40 個果實，3 次重復。

虎皮病病情指數(shù)參照Zanella[20]的方法測定。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖，運用SPSS 26.0 軟件進行方差分析，Duncans多重比較進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫檀芪乳油制劑的配方研究

2.1.1 溶劑的選擇 結(jié)果顯示，無水乙醇、碳酸二甲酯和乙酸乙酯均能完全溶解Pte，Pte 在無水乙醇中溶解度達到0.3 g·mL-1。而95%乙醇、菜籽油、甘油不能將其溶解。無水乙醇、碳酸二甲酯、乙酸乙酯溶解Pte 后，均形成均一透明黃色的溶液，且在0 ℃放置3 d 后無固體析出。根據(jù)綠色安全、對環(huán)境無污染等原則，最終選擇無水乙醇作為Pte的溶劑。

2.1.2 乳化劑的選擇 如表1 所示，吐溫20、吐溫80、司盤20 和EL-40 在冰箱（0 ℃）放置3 d 后均為均一透明溶液，可作為進一步篩選的乳化劑。

2.1.3 乳化劑的分散性 如表2 所示，選用吐溫20作為制備Pte 的乳化劑時乳化分散效果較好，乳油呈云霧狀自動分散，攪拌后呈藍色透明乳狀液，上無浮油，下無沉淀的乳化分散狀態(tài)符合國家標準。最終確定吐溫20為制備Pte EC的乳化劑。

2.1.4 最佳配方 通過對多種溶劑和乳化劑的比較和試驗，確定Pte EC 的溶劑為無水乙醇，乳化劑為吐溫20。其中Pte 占10%，乳化劑占10%，溶劑占80%。

2.1.5 乳液的穩(wěn)定性 Pte EC的乳液穩(wěn)定性檢測結(jié)果見表3，乳液上無浮油、下無沉油和沉淀為合格，符合GB/T 1603—2001。

2.1.6 熱貯穩(wěn)定性 根據(jù)GB/T 19136—2003 將密封乳油的橡皮塞試管置于54 ℃的水浴鍋中，14 d 后取出，把試管外部擦凈后分別稱量質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)3 支試管前后的質(zhì)量均未發(fā)生明顯變化，結(jié)果如表4 所示。于24 h 內(nèi)對其乳化分散性和乳液穩(wěn)定性進行檢測，發(fā)現(xiàn)其乳化分散性和乳液穩(wěn)定性均合格。

2.1.7 冷貯穩(wěn)定性 由表5 可知，10%紫檀芪乳油在規(guī)定條件下離心后，無離析物。于24 h 內(nèi)對其乳化分散性和乳液穩(wěn)定性進行檢測，發(fā)現(xiàn)其乳化分散性和乳液穩(wěn)定性均合格。故10%紫檀芪乳油冷貯穩(wěn)定性合格。

2.2 不同處理對碭山酥梨硬度、SSC和可滴定酸含量的影響

如圖1所示，果實硬度和SSC隨著貯藏時間的延長逐漸下降。由圖1-A可知，剛收獲時，梨果實硬度為5.82 kg·cm-2，冷藏至210 d時，CK、DPA、Pte、Pte EC果實的硬度分別降至2.83、3.27、3.04、3.09 kg · cm- 2。

冷藏初期（60～90 d）各處理組果實硬度顯著高于對照組（p＜0.05），但在貯藏中后期（90～210 d）差異不顯著。由圖1-B 可知，貯藏過程中，DPA、Pte 和PteEC 處理組的SSC 與對照差異不顯著。由此可知，DPA、Pte 和Pte EC 能保持梨果實的硬度，但并不能顯著延緩果實SSC的下降。

由圖1-C可知，隨著貯藏時間的延長，果實TA含量呈下降趨勢。與對照組相比，DPA、Pte和Pte EC處理組果實的TA含量略高。冷藏至120 d 時，DPA處理組果實TA含量顯著高于對照組（p＜0.01）。其他的貯藏時間，DPA、Pte和Pte EC處理可延緩冷藏期間梨果實酸度的下降，但與對照差異不顯著。

2.3 不同處理對碭山酥梨MDA含量、DPPH 自由基清除率和過氧化氫含量的影響

如圖2-A所示，果實果皮MDA含量隨著貯藏時間的延長呈上升趨勢。剛采收時，梨果皮MDA含量（b，后同）為1.90 nmol·g-1，冷藏至210 d時，CK、DPA、Pte、Pte EC 處理組梨果皮MDA 含量分別上升至6.72、5.31、5.74、5.58 nmol·g-1。冷藏前期（0～90 d）對照組果皮MDA含量呈緩慢上升，后期呈急速上升趨勢。貯藏后期各處理組果皮MDA含量顯著低于對照組（p＜0.05）。

DPPH自由基清除率是反映果皮的抗氧化能力變化的重要指標。如圖2-B所示，貯藏期間梨果皮DPPH自由基清除率隨著冷藏時間的延長大體呈下降趨勢。剛收獲時果皮DPPH 自由基清除率為96.50%，貯藏至210 d 時，CK、DPA、Pte、Pte EC處理果皮DPPH 自由基清除率下降至84.94%、87.45%、86.22%、86.73%。整個貯藏過程中各處理組果皮DPPH自由基清除率均高于對照，但差異不顯著。

如圖2-C所示，對照和各處理組梨果皮H2O2含量隨著冷藏時間的延長逐漸增加，前中期緩慢上升，后期急速上升。剛收獲時果皮H2O2 含量為25.98 nmol · g- 1，冷藏至210 d 時，CK、DPA、Pte、PteEC 處理組果皮H2O2含量分別上升至92.25、78.13、81.56、81.83 nmol· g-1。此時，各處理組梨果皮H2O2含量顯著低于對照組（p＜0.05）。由此可知，DPA、Pte、Pte EC 處理不能顯著抑制冷藏期間梨果皮DPPH 自由基清除率的下降，但能顯著抑制梨果皮MDA和H2O2的積累，DPA處理效果最佳。

2.4 不同處理對碭山酥梨α-法尼烯和共軛三烯含量的影響

如圖3-A所示，果實果皮α-法尼烯含量隨著冷藏時間的延長呈先上升后下降趨勢，并在120 d 時出現(xiàn)峰值，此時DPA、Pte 處理能顯著降低α-法尼烯峰值（p＜0.05）。由3-B可知，貯藏期間，各處理組和對照組梨果皮共軛三烯含量呈上升趨勢。剛收獲時，果皮共軛三烯含量為1.13 nmol·g-1，冷藏至210 d 時，CK、DPA、Pte、Pte EC處理組果皮共軛三烯含量分別上升至98.46、76.52、87.07、87.19 nmol·g-1，此時，各處理組果皮共軛三烯含量極顯著低于對照（p＜0.01），其中DPA處理與對照組之間差異顯著（p＜0.000 1）。由此可知，DPA、Pte、Pte EC處理能有效抑制α-法尼烯的氧化，減少果實共軛三烯的積累（p＜0.05）。冷藏后期DPA處理效果最佳。

2.5 不同處理對碭山酥梨虎皮病發(fā)病率、病情指數(shù)和發(fā)病狀態(tài)的影響

如圖4 所示，冷藏期間梨果實的虎皮病發(fā)病率和病情指數(shù)均呈上升趨勢。對照和各處理組果實在150 d 時開始發(fā)病，冷藏至210 d 時，CK、DPA、Pte、Pte EC 果實發(fā)病率和病情指數(shù)分別為51.58% 、22.89% 、39.39% 、36.26% 和34.55% 、20.73%、26.58%、23.60%，其中對照組果實發(fā)病率最高。DPA、Pte、Pte EC處理均能有效抑制碭山酥梨果實虎皮病的發(fā)生，Pte 和Pte EC處理差異顯著（p＜0.01），DPA處理效果極顯著（p＜0.000 1）。由此可知，DPA、Pte、Pte EC處理均能有效控制虎皮病的發(fā)生（見圖4-C），以DPA處理效果最佳，其次是Pte EC處理。

3 討論

傳統(tǒng)乳油中含有較多的甲苯和二甲苯等有機溶劑，可以通過滲透作用進入植物果皮和動物皮膚，故在生產(chǎn)、運輸和銷售過程中對人體健康和食品安全構(gòu)成威脅。筆者在本研究中通過對溶劑和乳化劑的篩選、理化性能的檢測研制出了10% Pte EC，且各項性能均符合國家農(nóng)藥制劑標準[21]，最終配方選用無水乙醇為溶劑，吐溫20 為乳化劑。與傳統(tǒng)有機溶劑相比，該配方綠色環(huán)保，果實食用更安全。

在果品保鮮方面，Pte 處理能夠延緩梨果實硬度下降，使果實的SSC、TA、DPPH 自由基清除率高于對照組。但Pte 和Pte EC處理在保持果實的品質(zhì)指標以及提高果皮DPPH 效果方面差異不顯著（p＞0.05）。由此可知，Pte 處理可以在一定程度上改善果品的采后品質(zhì)，延緩果實的衰老。在虎皮病防治方面，各處理都能夠顯著降低冷藏期間碭山酥梨虎皮病發(fā)病率和病情指數(shù)（p＜0.05），其中DPA效果最佳，其次是Pte EC，最后是Pte。

可見Pte 制成乳油制劑后可以更好地控制碭山酥梨虎皮病的發(fā)生，并且Pte 與Pte EC 兩處理組之間差異顯著（p＜0.05）。乳油制劑雖改善藥效，但與DPA處理效果仍有明顯差距（p＜0.01）。在抑制虎皮病相關(guān)指標方面，與Pte 相比，Pte EC處理能更有效抑制冷藏期間碭山酥梨果皮H2O2和共軛三烯的積累（p＜0.05），這可能是Pte 虎皮病控制效果低于Pte EC的原因。

大多數(shù)梨品種中黑皮病的發(fā)生與細胞內(nèi)部α-法尼烯及其氧化產(chǎn)物共軛三烯在果實中的積累有關(guān)[22]。這種氧化分解和氧化還原的失衡導致細胞膜損傷，細胞區(qū)隔被破壞，多酚氧化酶通過鄰苯二酚生成醌并最終形成棕色色素，介導大部分酶促褐變[23-24]。本研究中Pte EC能抑制冷藏期間梨果皮α-法尼烯含量的增加，但其含量在峰值出現(xiàn)后開始下降，該變化趨勢與虎皮病發(fā)病情況并不一致。與α-法尼烯相比，共軛三烯在虎皮病的發(fā)生中發(fā)揮更重要的作用[25-28]。與上述結(jié)論一致，本試驗中Pte EC處理可以顯著（p＜0.05）抑制果實共軛三烯的積累，且其處理的果實在冷藏期間的發(fā)病率和病情指數(shù)顯著（p＜0.05）低于對照組。因此，本研究猜測共軛三烯是碭山酥梨虎皮病發(fā)生的誘因，Pte EC處理可以顯著降低其積累來抑制虎皮病的發(fā)生。

虎皮病是一種低溫疾病，其發(fā)生與細胞內(nèi)ROS誘發(fā)的氧化脅迫也密切相關(guān)。由于寒冷誘導的電子傳遞細胞色素途徑受損，導致超氧自由基和H2O2累積相互作用形成羥基自由基，這些羥基自由基具有高度活性，并導致法尼烯氧化形成H2O2 等過氧化產(chǎn)物[29]。當病果抗氧化系統(tǒng)遭到破壞后，大量ROS積累會誘發(fā)果皮發(fā)生膜脂過氧化，膜通透性增強，導致細胞膜系統(tǒng)損壞。MDA是膜脂過氧化的終產(chǎn)物，也是評價氧化脅迫的重要指標之一。本研究中冷藏后期果皮中H2O2含量的急速增加，加速了虎皮病病情的發(fā)展，而Pte EC處理能顯著抑制果皮H2O2含量的增加和MDA的積累（p＜0.05），減少活性氧的積累，減輕膜脂過氧化，保持細胞膜的完整性，從而抑制虎皮病的發(fā)生。

4 結(jié)論

筆者在本研究中最終確定的10%Pte EC 的優(yōu)選配方為10%紫檀芪+ 10%吐溫20 + 80%無水乙醇，該制劑各項性能均符合國家農(nóng)藥制劑標準。配方綠色安全，且提高了藥效，在一定程度上能改善果品品質(zhì)，延緩果實衰老。同時Pte EC 還能有效控制碭山酥梨的虎皮病，防治效果僅次于DPA。筆者為虎皮病的防治提供了新的思路，也為Pte EC 進一步進行商業(yè)應用示范提供了理論依據(jù)。

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