吉爽秋 王力榮 李勇 朱更瑞 曹珂 方偉超 陳昌文 王新衛(wèi) 張琦 吳金龍

摘要：【目的】進一步完善桃花型基因型分類，開發(fā)桃花型相關分子標記，為觀賞桃花的分子輔助育種提供理論支持?！痉椒ā坷萌蚪M關聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）、IGV可視化軟件分析，以及競爭性等位基因特異性PCR（Kompetitive allele-specific PCR，KASP）技術，在定位到的候選位點進行鑒定分析?！窘Y果】GWAS定位分析在Pp08：14 518 604～14 521 291 bp 存在一個ms179810 轉座子的缺失，x2驗證結果表明，轉座子的插入與缺失與花型性狀無顯著性關系。在轉座子上游33 980 bp 處鑒定到一個單堿基核苷酸（SNP）變異，變異類型分為CC型、AC型、AA型3 種，比對結果顯示基因型為CC型、AC型，其表型為鈴形，基因型為AA型，其表型為薔薇形，在145 份桃自然群體中鑒定準確率為98.62%。但是通過表型比對發(fā)現(xiàn)，基因型為CC時，鈴形花冠直徑為（1.54 ± 0.46）cm，同時，基因型雜合的中蟠17 號自交群體后代192 株中基因型與表型準確率在98.44%?！窘Y論】根據桃基因組中Pp08：14 484 624 bp處的變異類型以及桃花型的調查結果，首次將鈴形花基因型細分為純合鈴形和雜合鈴形，且開發(fā)了同時鑒定純合鈴形、雜合鈴形及薔薇形的分子標記。

關鍵詞：桃；花型；全基因組關聯(lián)分析（GWAS）；IGV；競爭性等位基因特異性PCR（KASP）

中圖分類號：S662.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）03-0422-10

桃（Prunus. persica L.），薔薇科，李屬，多年生自花授粉落葉果樹。因其染色體數目少（2n=16），基因組?。?27 Mb），童期短，被認為是薔薇科果樹研究的模式植物[1]。中國是桃的起源中心，種質資源遺傳多樣性豐富。觀賞桃是桃種質資源的重要類型。其花型主要分為鈴形、薔薇形和菊花形（圖1），在三大花型的基礎上，通過育種技術的不斷更新，花型、花色、樹形、枝形和葉色的交叉組合，賦予桃花更多的表現(xiàn)形式[2-3]。

鈴形和薔薇形是一對等位基因控制的質量性狀。鈴形花冠直徑小，花瓣細長，完全開放時形似鈴鐺；薔薇形花冠直徑大，花瓣肥碩，開放時花瓣展開，在外觀上容易區(qū)分表型，且該性狀屬于質量性狀，定位分析相對簡單，因此前人對此做了大量的研究，例如，在2009 年Ogundiwin 等[4]利用罐桃品種Dr. Davis和鮮食桃品種Georgia Belle 的F1群體，構建了一個包含211 個標記的遺傳連鎖圖譜Pop-DG，將鈴形/薔薇形關聯(lián)位點定位于8 號染色體34.4 cM處；2010年Fan 等[5]利用QTL定位將桃花鈴形/薔薇形定位在8 號染色體上的CPPT006 與PacC13 兩個標記之間。之后隨著GWAS 定位技術在果樹分子育種上的發(fā)展，2015 年Micheletti 等[6]基于9K SNP 芯片對1580 份桃種質資源進行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)8 號染色體18 個SNP 標記與鈴形/薔薇形關聯(lián)緊密，范圍大小為4.3 Mb；2016 年Cao 等[7]利用129 份桃種質材料，在8 號染色體13 740 117 bp處發(fā)現(xiàn)的1個SNP位點與鈴形/薔薇形關聯(lián)度較高；2021 年孟歌等[8]利用199 份桃種質，將鈴形/薔薇形定位在8 號染色體14 484 624 bp處，并開發(fā)了相應的分子標記；2022 年Lian 等[9]利用黃水蜜×中油桃14 雜交后代81 株，在8號染色體PpB3-1 基因啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了1 個與表型關聯(lián)度極高的SNP。目前開展的花型定位分析絕大多數利用的數據是SNP基因型，將控制桃花型的候選基因范圍鎖定在8 號染色體14 Mb～16 Mb之間，但是基于SNP的GWAS結果定位區(qū)間往往較大，區(qū)間內的變異位點較多，開展關鍵基因挖掘工作仍具挑戰(zhàn)性。而變異的SV（Structure Variantions）較SNP而言，更能影響基因的功能[10]。因此筆者利用本課題組前期發(fā)表的327 份桃種質材料的重測序結果，利用鑒定到的SV 位點進行全基因組關聯(lián)分析（GWAS），將候選基因的范圍鎖定在14.4 Mb～14.6 Mb之間，并挖掘到1 個與表型相關性極高的SNP 位點Pp08：14 484 624 bp，利用KASP 基因分型技術驗證了該位點的準確性，同時在與表型的驗證過程中首次提出純合鈴形/雜合鈴形之分，為進一步克隆關鍵基因提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

用于本試驗GWAS分析的材料主要源于327 份桃種質材料，具體品種參考Guo等[11]，用于轉座子驗證的材料主要來源于1 個192 株的自交群體，2 個96株的雜交群體，自交群體為中蟠17 號，雜交群體為瑞光39 號×08-9-106 和晴朗× 中油蟠7 號，用于IGV可視化分析的145 份桃種質材料（表1），其中有59份為GWAS 已有重測序數據，86 份新增重測序數據。以上種質資源及自交和雜交群體后代均來自國家園藝種質資源庫和中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所桃種質資源圃。

1.2 表型數據的調查

2022 年3、4 月對自然群體及雜交群體的表型進行調查。具體調查結果如表2 所示。

1.3 DNA提取與測序

樣品DNA的提取采用改良的CTAB法，具體方法參考張南南等[12]的方法，DNA 質量用NanoDrop1000 spectrophotometer（Themo Scientific）紫外分光光度儀檢測。用于KASP 基因分型的樣品DNA質量濃度調整至50～100 ng·μL。用于GWAS定位分析的DNA純化后構建文庫和測序，文庫大小為350 bp，測序平臺選用Hiseq X Ten（Illumina），測序任務由安諾優(yōu)達基因科技有限公司（北京）完成。經數據質控后（FastQC），每個樣本產生至少5 Gb的數據[11]。

1.4 全基因組關聯(lián)分析

利用SV數據開展GWAS分析，最終產生181 381個變異位點，定位出鈴形/薔薇形相關的變異位點，并曼哈頓（Manhattan）圖顯示關聯(lián)位點。

1.5 IGV可視化分析

利用IGV可視化查看基因組重測序結果，比對文件為下機的bam文件，導入IGV的bam文件附加samtools 文件，生成3 個相關的tracks，AlignmentTrack，Coverage Track，Splice Junction Track，對145份桃品種基因組序列進行比對。

1.6 KASP標記分型

競爭性等位基因特異性PCR（KASP）擴增體系：5 μL 2× KASP master mix（廣州固德生物技術有限公司，廣州，中國），1 μL DNA 樣品，0.5 μL混合引物以及3.5 μL水，添加混合試劑前加入等體積石蠟油封體系。KASP 擴增程序如下：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性20 s，61～55 ℃復性延伸60 s，10 個循環(huán)，每個循環(huán)復性延伸溫度降低0.6 ℃；95 ℃變性20 s，55 ℃復性延伸60 s，32 個循環(huán)。熒光數據讀取和分析儀器為Roche LC96 Ⅱ（Roche Diagnostics，USA），讀取溫度為37 ℃，讀取時間為60 s，所用熒光為羧基熒光素（FAM，carboxy fluorescein）和六氯熒光素（HEX，hexachlorouorescein）。KASP 引物序列信息見表3。

2 結果與分析

2.1 鈴形/薔薇形性狀關鍵位點全基因組關聯(lián)分析

筆者在本研究中通過對327 份桃材料進行重測序分析，利用SV變異定位鈴形/薔薇形候選區(qū)間，在桃全基因組中共獲得181 381 個高質量SV 位點。GWAS 結果發(fā)現(xiàn)在Pp08：14 518 604～14 521 291 處有一個2866 bp 轉座子（TE）與花型顯著相關（圖2），縮短了前人的定位區(qū)間。PCR擴增該轉座子后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳在23 份種質資源（圖3）和384份雜交群體后代中進行驗證（表4）。發(fā)現(xiàn)在23 份桃種質中沒有差異，在384 份雜交群體后代中雖然存在分離，但x2檢驗結果卻表明轉座子的插入與缺失與花型無顯著的相關性。

2.2 IGV可視化分析挖掘變異關鍵位點

由于轉座子的插入與花型之間沒有顯著性關系，且該定位區(qū)間附近基因數量較少，從而在原有的定位基礎上，擴大定位區(qū)間，在定位區(qū)間前后100 kb 的范圍內，利用IGV軟件，以Prunuspersica-genome.v2.0.a1作為參考基因組，在145份桃種質材料重測序數據中比對分析，發(fā)現(xiàn)在轉座子上游33 980 bp 處存在一個變異的SNP（C→A），該位點為Pp08：14 484 624 bp，經比對發(fā)現(xiàn)，該位點存在3種變異類型，如圖4-a～c所示，圖4-a位點為CC時，表現(xiàn)為鈴形花，圖4-b位點為AC時，表現(xiàn)依然為鈴形花，圖4-c位點為AA時，表現(xiàn)為薔薇形花。但是通過與表型比對發(fā)現(xiàn)，位點為CC時的鈴形花冠直徑比位點為AC的更小，位點為CC時花冠直徑為（1.54±0.46）cm，位點為AC時花冠直徑為（2.61±0.4）cm。因此筆者認為，在花型的分類中，鈴形花又可以分為純合鈴形和雜合鈴形。

2.3 KASP基因分型技術鑒定純合鈴形種質

由于鈴形/薔薇形是由一對等位基因控制的質量性狀，根據孟德爾遺傳規(guī)律，變異位點為AC的鈴形花自交后代應該出現(xiàn)以上3種花型的分型。因此采用該位點基因型為AC的中蟠17號，利用其自交群體后代192株，對Pp08：14 484 624 bp進行KASP基因分型驗證，發(fā)現(xiàn)中蟠17號自交群體有3種基因型（圖5），分離比為41∶94∶54，接近1∶2∶1。對中蟠17號自交群體的花冠直徑進行了調查統(tǒng)計（圖6），花冠直徑被分為（1.54±0.46）cm、（2.61±0.4）cm、大于3.7 cm 3種類型，分別為純合鈴形、雜合鈴形、薔薇形，與基因型比對正確率在98.44%（表5）。對所得結果進行聚類分析（圖7），發(fā)現(xiàn)純合鈴形和雜合鈴形關系更近，較薔薇形關系較遠。

3 討論

在花型分類中，育種家更傾向于培育花冠直徑大且重瓣的薔薇形花，比如：灑紅龍柱、報春、迎春、滿天紅等[13-16]。花冠直徑大小也一直被認為是區(qū)分鈴形/薔薇形的標準之一，因此開發(fā)控制花型的分子標記，對觀賞桃花分子育種具有重要指導意義。有研究推斷花的大小進化軌跡是從小花到大花，此過程要經過多年的遺傳變異和自然選擇[17-18]。

Landis 等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，黃花菜種群的花從種質的起源到現(xiàn)在變大了2.5 倍；Mojica 等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，在自然變異中，大的菊花需要花費2000 年的時間才能從小的菊花突變而來?；ㄐ褪怯绊懡慌湎到y(tǒng)進化和繁殖成功的一個關鍵生態(tài)性狀，傳粉者、天敵和非生物環(huán)境是花型變異的驅動力，花型差異通常與不同的傳粉者有關，形成傳粉綜合征[21]，花型一直被認為是操控傳粉者的一種適應方式[22-23]，促進花型向著大花型的方向進化，更有利于傳粉者授粉。但是一些物種花形態(tài)的差異往往不符合這一推斷，有研究發(fā)現(xiàn)，自交群體的起源是和他們祖先非常接近的雜交群體，從異花授粉到自花授粉伴隨著花的形態(tài)學向“自交綜合征”的顯著變化，其特征就是花的大小縮小，花的性狀大多數變異是由群體遺傳變異而來，但是花形態(tài)上的某些差異可能歸因于一個單獨的進化史[24]。桃就是典型的自花授粉植物，雖然鈴形對薔薇形為顯性，但是上海水蜜作為栽培桃的祖先[25-26]，其花型為薔薇形，并且有研究報道GF677（薔薇形）與紅根甘肅桃1 號（薔薇形）雜交，后代出現(xiàn)了廣泛的分離，F(xiàn)1代出現(xiàn)了鈴形花，因此鈴形花可能是桃、扁桃與甘肅桃種間雜交而來的[27]。綜合桃花的發(fā)展和進化史，從而推斷鈴形花可能從薔薇形花中突變而來。研究桃花型的進化史，首先需明確控制花型的關鍵基因，盡管此前對于鈴形/薔薇形的定位做了大量研究，將關鍵基因定位在8 號染色體14 Mb～16 Mb之間，但具體位置一直存在差異。筆者在本研究中利用基于SV 的GWAS 分析，最顯著的信號位于8 號染色體ms179810 轉座子，x2檢驗結果卻表明轉座子的插入與缺失與花型沒有顯著的相關性，但在該定位區(qū)間挖掘到一個與表型相關度極高的SNP（Pp08：14 484 624 bp），經查閱文獻資料，孟歌等[8]利用199 份桃資源，篩選到1 042 687 個SNP標記，利用GWAS 分析找到同樣的位點，經鑒定與表型的準確率在93.46%。筆者通過改進引物、增加驗證群體，提出并驗證了純合鈴形的存在，因此該標記在桃自然群體中表型符合率在98.62%，在雜交群體中表型準確率在98.44%，證明該位點不僅可作為區(qū)分鈴形/薔薇形的分子標記，還可以作為區(qū)分純合鈴形/雜合鈴形的分子標記。

4 結論

筆者根據桃基因組Pp08：14 484 624 bp 處的變異類型以及桃花型的調查結果，首次將鈴形花細分為純合鈴形和雜合鈴形，且開發(fā)了同時鑒定純合鈴形、雜合鈴形及薔薇形的分子標記。純合鈴形種質資源的鑒定，為鑒定與挖掘提供新的實驗材料，推動了桃花型的研究進展。

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