崔瑩 吳潔萍 張俊霞 郝新意 徐偉榮

摘要：【目的】探究外源海藻糖影響葡萄抗寒性的生理機制?！痉椒ā恳猿嘞贾橛酌鐬樵囼灢牧?，分別以不同濃度海藻糖（10，15，30 mmol·L-1）噴施葉片，以清水處理為對照，人工模擬“倒春寒”條件（從16 ℃降到-3 ℃ ± 0.5 ℃，并保持4 h），分析低溫脅迫下海藻糖對葡萄幼苗葉片生長的表型、抗氧化酶活性、細胞膜穩(wěn)定性、糖（葡萄糖、果糖和蔗糖）含量與內(nèi)源激素（ABA、IAA、GA3和tZR）含量的影響?！窘Y果】葉面噴施適宜濃度的海藻糖可有效緩解低溫對赤霞珠幼苗的傷害，并存在一定的濃度效應。隨著低溫脅迫時間延長，與清水對照相比，15 mmol·L-1海藻糖處理的植株幼苗未出現(xiàn)植株萎蔫和葉片凍斑現(xiàn)象，存活率上升了60.52%。在“倒春寒”脅迫處理后（-3 ℃ 4 h），15 mmol·L-1海藻糖處理減少了活性氧（ROS）的產(chǎn)生，過氧化氫（H2O2）與超氧陰離子（O2.-）含量分別降低了23.82%和6.21%；CAT與POD活性分別提高了221.73%與54.53%，而SOD活性無顯著差異；ABA、GA3和tZR 的含量分別提高了701.21%、127.66%與80.03%，對照組中IAA含量未檢測到，而處理組中IAA含量（w）為0.94 ng·g-1；葡萄糖、果糖和蔗糖的含量分別提高了11.20%、12.56%與68.53%?！窘Y論】葉面噴施適宜濃度海藻糖可有效提高葡萄幼苗的抗低溫能力，通過增強根系抗氧化酶活性，減輕膜損傷，進而緩解低溫脅迫對幼苗生長的抑制，且15 mmol·L-1的海藻糖溶液葉面噴施處理效果最佳，而30 mmol·L-1海藻糖處理會加重低溫脅迫對葡萄幼苗的傷害，表明葉面噴施海藻糖可以緩解“倒春寒”對葡萄幼苗產(chǎn)生的危害，且存在濃度效應。

關鍵詞：赤霞珠；海藻糖；“倒春寒”；生理指標；內(nèi)源激素

中圖分類號：S663.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）03-0505-11

葡萄（Vitis L.）是全球重要的經(jīng)濟類果樹作物之一，具有重要的經(jīng)濟價值[1]。近年來，由于全球氣候變化加劇，“倒春寒”等極端天氣頻發(fā)，造成葡萄萌動新梢全部或部分受凍，易出現(xiàn)凍芽、凍花、甚至凍果的現(xiàn)象，造成樹勢受損，產(chǎn)量下降，對我國的葡萄生產(chǎn)造成了嚴重影響。目前，葡萄栽培生產(chǎn)上一般通過葡萄園噴灌水、熏煙、風機吹風以及噴施藥劑等措施來預防“倒春寒”[2]。因此，如何高效緩解葡萄“倒春寒”危害已成為葡萄栽培生產(chǎn)中亟待解決的問題。

海藻糖（Trehalose）是一種非還原性二糖，廣泛存在于細菌、酵母和無脊椎動物體內(nèi)。植物中海藻糖于19 世紀由Firdos 等[3]從黑麥麥角菌中首次發(fā)現(xiàn)，其合成途徑為海藻糖-6-磷酸合酶（Trehalose-6-phosphatesynthase，TPS）– 海藻糖- 6- 磷酸磷酸酶（Trehalose- 6- pho- sphate phosphatase，TPP）途徑[4]。

海藻糖作為植物生長調(diào)控因子、滲透保護劑或穩(wěn)定分子，在植物生長發(fā)育和逆境響應中發(fā)揮著重要作用[5]。例如，海藻糖可通過調(diào)節(jié)代謝調(diào)控信號來抵御植株干旱、低溫和鹽害等非生物脅迫[6-9]。逆境條件下，海藻糖可以保護細胞內(nèi)的活性物質(zhì)，促進蛋白質(zhì)合成，增強質(zhì)膜流動性以及功能酶的穩(wěn)定性[10]。海藻糖可作為植物適應逆境脅迫的應激代謝產(chǎn)物，協(xié)助植物細胞內(nèi)其他組分抵御外界不良環(huán)境，廣泛存在于耐低溫作物中[11]。此外，外源海藻糖通過顯著提高小花內(nèi)源亞精胺水平，增加小花內(nèi)谷胱甘肽和抗壞血酸含量，促進谷胱甘肽-抗壞血酸循環(huán)，降低小花內(nèi)活性氧含量，提高頂端小穗的小花育性，從而顯著緩解了低溫引起的每穗粒數(shù)下降[12]。目前，外源海藻糖在提高小麥幼苗、藜麥、冬小麥和玉米抗寒性方面的研究也已有報道[13-16]。然而，外源海藻糖是否能減輕低溫脅迫對葡萄幼苗生長發(fā)育的不利影響，生理機制尚不明晰。

筆者在本研究中以萌芽期赤霞珠葡萄自根苗為試驗材料，人工模擬“倒春寒”脅迫，采用葉面噴施不同濃度海藻糖，以噴施清水為對照組，初步探討海藻糖對低溫脅迫下赤霞珠幼苗的表型、生理生化指標及內(nèi)源激素的影響，以期為海藻糖在釀酒葡萄抵御低溫脅迫中的應用提供理論基礎和實踐依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試葡萄為1 年生赤霞珠自根苗，種植于含V 土∶V 蛭石∶V 珍珠巖為3∶1∶1 的營養(yǎng)缽中（10 cm×10cm），在25 ℃溫室下培育8 周。

1.2 試驗方法

選取健康、株型一致的幼苗，連續(xù)進行3 d 葉面噴施10 mmol·L-1、15 mmol·L-1和30 mmol·L-1的海藻糖溶液（索萊寶生物科技有限公司）（含有0.1%Tween-20），對照組噴施蒸餾水，置于低溫培養(yǎng)箱（RUMED P350，Rubarth Apparate GmbH；Germany）進行人工模擬“倒春寒”處理，設定程序為1 ℃·h-1進行程序性降溫，起始溫度為25 ℃，最低溫度為（-3 ±0.5）℃并保持4 h，設置16、4、0、-3 ℃ 0 h和-3 ℃ 4 h5個采樣點分別進行表型觀察，采集中上部（從下向上第3～5 枚）大小一致的葉片，液氮速凍并于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 存活率、MDA含量和葉綠素含量的測定

幼苗經(jīng)模擬“倒春寒”處理后對凍芽進行修剪，在25 ℃下緩苗1 個月，后統(tǒng)計成活率（存活率=存活棵數(shù)/處理總棵數(shù)×100%）；采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量[17]；采用無水乙醇提取法測定葉綠素含量[17]；每個處理3 次重復。

1.4 O2·-與H2O2含量的測定

采用羥胺氧化法測定超氧陰離子（Superoxideanion，O2·-）[18]；采用分光光度法測定過氧化氫（Hydrogenperoxide，H2O2）[19]；每個處理3 次重復。

1.5 抗氧化酶活性的測定

采用愈創(chuàng)木酚顯色法測定過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性[20]；采用紫外吸收比色法測定過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性[21]；采用氮藍四唑光還原法測定超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性[22]；每個處理3 次重復。

1.6 內(nèi)源激素含量的測定

采用超高效液相色譜法[23]。收集并稱取0.7 g葉片鮮樣，加液氮充分研磨，加入80%甲醇（含0.05%檸檬酸）混勻置于4 ℃提取4 h；后經(jīng)低溫離心15 min，分離上清液，提取2 次，合并上清液，氮吹至5 mL，用1.5 ×石油醚（7.5 mL）萃取3 次，棄醚相；用1×甲酸甲酯（5 mL）萃取3 次，收集酯相，氮吹至干，用2 mL甲醇溶解后用0.45 μm濾膜過濾，每個處理3 次重復。

1.7 糖含量的測定

采用超高效液相色譜法[24]。稱取葉片0.2 g，加入ddH2O，定容至2 mL，60 ℃超聲提取30 min，90 ℃恒溫水浴60 min，冷卻至室溫后離心15 min，吸出上清液并進行過濾，放入檢測器進行液相分析檢測。

將標準葡萄糖、果糖、蔗糖均配制成2.5 mg·mL-1的混標母液，并分別稀釋為0.05～1.00 mg·mL-1等一系列標準溶液濃度，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進行液相測定，每個處理3 次重復。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

利用Microsoft Office Excel 2016 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，分別使用Origin 2021b 中插件Principal ComponentAnalysis 進行主成分分析（PCA），CorrelationPlot 進行相關性分析以及Paired Comparison Plot 進行柱狀圖作圖和顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 緩解低溫傷害最適海藻糖濃度的篩選

對赤霞珠幼苗進行連續(xù)3 d 葉面噴施不同濃度的海藻糖，以噴施清水為對照組，后放入低溫培養(yǎng)箱中進行模擬“倒春寒”處理（圖1-a～t）。在模擬“倒春寒”脅迫條件下，隨著低溫脅迫加劇，在-3 ℃時噴施清水對照組的赤霞珠幼苗局部葉柄出現(xiàn)發(fā)紫現(xiàn)象，在該溫度保持4 h，葉片與莖段出現(xiàn)嚴重萎蔫的現(xiàn)象（圖1-d、1-e）。噴施不同濃度海藻糖的葉片受到程序性降溫的影響不同。其中，10 mmol·L-1海藻糖預處理的葉片與嫩梢比30 mmol·L-1海藻糖預處理受到低溫脅迫的萎蔫程度弱，而15 mmol·L-1海藻糖處理組則幾乎未出現(xiàn)萎蔫，無明顯凍害。

2.2 海藻糖處理對低溫脅迫下赤霞珠存活率、MDA含量和葉綠素含量的影響

在模擬“倒春寒”脅迫條件下，對不同濃度海藻糖處理組植株的存活率、MDA和葉綠素含量進行統(tǒng)計分析。結果表明，不同濃度海藻糖處理與清水對照組相比，赤霞珠幼苗的存活率不同。其中，CK組的存活率為10.53%，10 mmol·L-1、15 mmol·L-1海藻糖處理組存活率分別為25.00%、71.05%，為對照組的2.37 倍和6.75 倍，而30 mmol·L-1海藻糖處理組的存活率為8.33%，低于CK組存活率。MDA含量測定結果表明，各處理組MDA含量均呈上升趨勢，與清水對照相比，16 ℃時各處理組（10、15、30 mmol·L-1）葉片MDA 含量分別降低了32.49% 、33.72% 、16.98%；4 ℃、0 ℃、-3 ℃ 0 h 3 個采樣點，外源海藻糖處理組（10、15、30 mmol · L-1）葉片MDA 含量分別降低了26.02% 、27.05% 、9.93% 和20.35% 、12.23%、7.74%和24.89%、23.29%、7.71%；-3 ℃ 4 h時，10 mmol · L-1、15 mmol · L-1 海藻糖處理組MDA含量分別降低了28.63%、21.16%，而30 mmol·L-1海藻糖處理組MDA含量增加了2.71%（圖2-A）。此外，葉綠素含量測定結果表明，各處理組葉片葉綠素含量均有所下降，其中15 mmol·L-1海藻糖處理組5個采樣點葉綠素含量較CK分別提高了3.55%、14.71%、10.49%、3.55%和31.17%，其余處理組（10 mmol·L-1、30 mmol · L-1）效果不顯著（圖2-B）。由此可見，15 mmol·L-1海藻糖處理組的赤霞珠幼苗葉片細胞膜受損程度最輕，表明15 mmol·L-1海藻糖處理可以有效緩解低溫對赤霞珠幼苗的傷害。

2.3 海藻糖處理對低溫脅迫下赤霞珠葉片活性氧系統(tǒng)的影響

赤霞珠在遭受低溫脅迫時，活性氧系統(tǒng)失衡，大量的活性氧在細胞中積累，會破壞植物的細胞結構[25]。對葉片H2O2和O2·-含量測定的結果表明，隨著模擬“倒春寒”脅迫加劇，對照組和處理組H2O2和O2·-含量均呈上升趨勢，且在-3 ℃ 4 h時達到峰值。與清水對照相比，15 mmol·L-1海藻糖處理組植株葉片5 個采樣點H2O2含量分別降低了11.68%、8.72%、19.91%、22.48%和23.82%（圖3-A）；在-3 ℃ 0 h、-3 ℃ 4 h 2個采樣點，15 mmol·L-1海藻糖處理組O2· -含量分別降低了10.02%、6.21%（圖3-B）。綜上，15 mmol·L-1海藻糖處理可降低低溫脅迫下赤霞珠幼苗葉片中活性氧的積累。

2.4 海藻糖處理對低溫脅迫下赤霞珠葉片抗氧化酶活性的影響

植物細胞膜的穩(wěn)定性及酶保護系統(tǒng)與植物抗寒能力緊密關聯(lián)，抗氧化酶可有效清除植物體內(nèi)活性氧等物質(zhì)的積累，從而減輕逆境脅迫下植物體受到的危害[26]。隨著低溫脅迫時間的延長，-3 ℃4 h 較16 ℃，CK 組CAT 活性增加了5.91 U· g-1，而15 mmol·L-1海藻糖處理組增加了25.92 U·g-1，相比對照組提高了221.73%（圖4-A）；15 mmol·L-1海藻糖處理對低溫脅迫下SOD 活性僅在4 ℃下有顯著差異，其他處理時間點與CK無明顯差異（圖4-B）。模擬“倒春寒”處理后，與CK相比，15 mmol·L-1海藻糖處理顯著提高了葡萄幼苗的POD活性，在5 個采樣點的POD 活性分別比CK 高出3.77%、44.08%、39.69%、46.85%和54.53%（圖4-C）。說明15 mmol·L-1海藻糖處理可以提高低溫脅迫下赤霞珠幼苗葉片的抗氧化酶活性，從而提高活性氧的清除能力。

2.5 海藻糖處理對低溫脅迫下赤霞珠葉片4 種內(nèi)源激素含量的影響

當植物遭遇低溫、干旱、鹽堿等非生物脅迫時，可以通過調(diào)控體內(nèi)相關激素的表達來應對環(huán)境脅迫[27]。本研究中對15 mmol·L-1海藻糖預處理赤霞珠幼苗在低溫脅迫下的4 種內(nèi)源激素（tZR、GA3、IAA 和ABA）含量進行了測定分析。結果表明，隨著處理時間的延長，CK 組赤霞珠幼苗葉片tZR 與GA3含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（0 ℃出現(xiàn)拐點），而處理組大體呈現(xiàn)上升趨勢（圖5-A）；其中，在-3 ℃4 h 時，15 mmol·L-1海藻糖處理組tZR、GA3含量較CK分別提高了80.03%、127.66%。CK組與處理組中IAA含量均呈下降趨勢，-3 ℃ 4 h 較16 ℃，CK中IAA 含量比處理組分別降低了13.54 ng · g- 1 和12.66 ng·g-1，在-3 ℃維持4 h 后對照組IAA 含量降為0 ng·g-1，15 mmol·L-1海藻糖處理組IAA含量降為0.94 ng·g（-1 圖5-C）。CK組和處理組中ABA含量隨處理時間的延長均呈先升高后降低趨勢（4 ℃時對照組略有下降），但出現(xiàn)峰值的時間不同。在0 ℃、-3 ℃ 0 h、-3 ℃ 4 h 3 個采樣點，處理組ABA含量較CK組分別高出39.14%、5.47%、701.21%（圖5-D）。綜上，15 mmol·L-1海藻糖處理對低溫脅迫下葡萄幼苗的激素合成系統(tǒng)具有一定的保護作用。

2.6 海藻糖處理對低溫脅迫下赤霞珠葉片內(nèi)源糖組分的影響

糖作為供能物質(zhì)，為植株的生長發(fā)育供能，在遭受逆境脅迫時，抗逆調(diào)節(jié)和生長發(fā)育存在一定的競爭關系，植物為了抵御低溫脅迫會以生長發(fā)育受損為代價，造成糖含量積累[13]。因此，本研究對低溫脅迫下內(nèi)源糖組分進行測定，結果表明，與CK 組相比，15 mmol·L-1海藻糖處理組5 個采樣點果糖含量分別提高了10.80%、31.26%、18.99%、19.88%和12.56%（ 圖6-A）。此外，葡萄糖含量分別提高11.39%、23.02%、23.47%、15.31%和11.20%（圖6-B）。蔗糖含量在16 ℃與4 ℃時CK 組幾乎檢測不到，而對照組分別為487 mg · L- 1 與483 mg · L- 1，在0 ℃時，CK組蔗糖快速累積，與處理組累積的蔗糖無顯著差異；然而，后續(xù)處理時間點，兩者差異顯著。其中，在-3 ℃ 4 h 時，15 mmol·L-1海藻糖處理組中蔗糖含量較CK組提高了68.53%（圖6-C）。綜上，15 mmol·L-1海藻糖處理有利于低溫脅迫下赤霞珠幼苗葉片中糖分的積累。

2.7 各項生理指標間的主成分分析

為了驗證15 mmol·L-1海藻糖處理對人工模擬“倒春寒”的緩解效果，對5 個采樣點的生理生化指標進行主成分分析（principal analysis，PCA），每個處理相對于PC1 和PC2 軸的距離顯示了處理間的差異大?。▓D7-A）。PC1 45.9%和PC2 29.9%顯示占總方差的75.8%，較好地解釋了整體數(shù)據(jù)的特征。為了分析不同處理與各項生理生化指標間的相關關系進行冗余分析（redundancy analysis，RDA）（圖7-B），RDA圖中各指標與處理間夾角的余弦值表示相關性，夾角越小，則相關性越大，如果箭頭同向，表示正相關；箭頭反向，表示負相關。RDA圖中的第一組變量與PC1 呈正相關，涉及到蔗糖、葡萄糖、果糖、SOD、POD、CAT、ABA、GA3、tZR、H2O2、O2.-、MDA等變量，相反，PC1 變量與IAA和葉綠素含量呈顯著負相關。

3 討論

低溫脅迫會引發(fā)植物產(chǎn)生一系列的生理生化反應[28-29]，導致植物體內(nèi)參與抗逆相關的調(diào)節(jié)物質(zhì)大量積累，激發(fā)植物滲透調(diào)節(jié)能力，從而增強植物對逆境脅迫的響應[30]。MDA是植物細胞內(nèi)一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可作為細胞膜遭遇逆境損傷程度的重要評價指標[31]。隨著溫度的降低，所有處理的赤霞珠葉片MDA含量均逐漸升高，與對照組相比，15 mmol·L-1海藻糖處理葉片5 個采樣點MDA含量分別降低了32.49%、26.02%、20.35%、24.89%和21.16%，效果最顯著，這與Raza 等[32]的研究結果一致。葉綠素作為光合作用中最有效的色素，其含量在一定程度上反映了植物同化物質(zhì)的能力[33]，低溫脅迫造成植物的光合能力下降[34]。本研究中，赤霞珠幼苗在模擬“倒春寒”過程中，葉綠素含量均有不同程度的下降，但15 mmol·L-1海藻糖處理組植株葉片5 個采樣點的葉綠素含量較CK 分別提高了3.55%、14.71%、10.49%、3.55%和31.17%，很大程度上緩解了葉綠素含量的下降。因此，海藻糖在調(diào)節(jié)植物的抗寒性方面可能存在劑量效應?？寡趸竿ㄟ^清除活性氧，將植物體內(nèi)氧自由基維持在較低水平，從而緩解植物質(zhì)膜損傷，減輕氧自由基對細胞膜系統(tǒng)的傷害[35]。海藻糖則通過提高抗氧化酶活性和降低質(zhì)膜損傷途徑來提高植物對非生物脅迫的抗性[3]。隨著處理溫度的降低，赤霞珠葉片中CAT、SOD 和POD 活性均有不同程度的升高，但15 mmol · L-1 海藻糖處理組中3 種酶活性均高于對照組，其中CAT 和POD的活性顯著高于對照組，這與孫嘉華等[36]和楊婭倩[37]的研究成果不一致，推測3種抗氧化酶活性對不同植株響應低溫脅迫的能力不同。當赤霞珠幼苗受到低溫脅迫時，CAT、POD對活性氧的清除能力高于SOD，且15 mmol·L-1海藻糖處理下這種現(xiàn)象更為明顯。綜上，15 mmol·L-1海藻糖處理可有效緩解低溫脅迫帶來的損傷。

植物激素是一種廣泛參與植物逆境脅迫的信號物質(zhì)，在植物逆境脅迫響應過程中發(fā)揮重要作用，可引起植物體內(nèi)適應性調(diào)節(jié)反應[38-40]。ABA作為最重要的植物激素之一，在植物抵抗低溫、干旱等應激反應中具有重要作用。本研究中，經(jīng)過-3～16 ℃低溫脅迫后，15 mmol·L-1海藻糖處理組葉片ABA含量持續(xù)上升，而對照組ABA含量在-3 ℃維持4 h 后顯著降低，且IAA為0，表明對照組在-3 ℃維持4 h后喪失生長能力，其余激素合成也受到嚴重抑制，15 mmol·L-1海藻糖處理有效提高了赤霞珠幼苗對低溫脅迫的耐受性，這與張盛楠等[41]的研究結果不一致，推測不同內(nèi)源激素對低溫的響應程度不同。低溫脅迫下ABA含量顯著上升，加快細胞新陳代謝，從而提高植株的抗寒性，由半致死溫度的測定可知，在-3 ℃維持4 h 后，赤霞珠幼苗細胞破裂甚至死亡，內(nèi)源激素合成受損，造成細胞內(nèi)激素含量急劇變化。

糖作為影響細胞膜和蛋白質(zhì)的保護劑，可溶性糖的積累可以保護植物免受低溫脅迫造成的傷害[42]。在遭遇“倒春寒”時，非還原性二糖蔗糖分解為單糖葡萄糖，參與機體供能[33]。在遭受低溫脅迫時，植物的抗逆調(diào)節(jié)和生長發(fā)育之間存在競爭關系，植物通過調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)來抵御低溫脅迫的侵害，而赤霞珠幼苗在遭遇“倒春寒”時，正處于一個這樣的復雜關系。本研究中，隨著溫度的降低，果糖、葡萄糖和蔗糖均有不同程度的積累，在-3 ℃ 4 h時，15 mmol·L-1海藻糖處理組中蔗糖含量分別為對照組的1.69 倍，差異顯著，此前大量研究顯示，蔗糖的積累有利于增強植物的抗逆性，這與Nemati 等[43]和Zhou 等[44]的研究成果一致。本研究結果表明，葉面噴施15 mmol·L-1海藻糖有效提高了內(nèi)源糖組分的含量。本研究通過分析不同濃度海藻糖處理下赤霞珠幼苗抗寒性，結合生理生化指標綜合評價篩選出緩解葡萄植株“倒春寒”凍害的最佳海藻糖濃度，對葡萄等園藝作物抗寒栽培提供了理論參考，但在栽培生產(chǎn)實踐中，針對不同品種和樹齡葡萄植株的緩解作用還有待于進一步驗證。

4 結論

研究篩選出了緩解“倒春寒”危害的最佳海藻糖濃度。在人工模擬的“倒春寒”脅迫下，葉面噴灑海藻糖促進了赤霞珠幼苗的生長，提高了葉綠素含量，誘導增強抗氧化酶的活性，維持了細胞滲透調(diào)節(jié)的水平，提高了內(nèi)源激素的水平，調(diào)節(jié)了可溶性糖的水平，從而能夠顯著降低低溫脅迫對赤霞珠幼苗的損傷效應，因此在生產(chǎn)上，可以通過葉面噴施15 mmol·L-1海藻糖溶液來應對“倒春寒”，減緩“倒春寒”對葡萄植株的危害。

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