白 雪,栗瑞蘭,張 健,李博淵,徐冰冰,王瑞軍,李金泉,張家新*

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)羊遺傳育種與繁殖重點實驗室/內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院,呼和浩特 010018;2.山西大同大學 醫(yī)學院,山西 大同 037000)

凍精的使用能夠為人工授精提供充足的精液來源,提高種公羊的利用效率。但在精子冷凍保存過程中,由于精子頻繁地暴露在冷凍應激中,使其結構和功能受到損傷[1],質(zhì)膜中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)發(fā)生重組、DNA斷裂、線粒體功能受損[2-3]。部分存活精子也會經(jīng)歷獲能樣變化(冷凍獲能)、膽固醇外流、Ca2+內(nèi)流激活酪氨酸磷酸化通路,降低精子受精能力[4]。

有研究表明,質(zhì)膜損傷被認為是細胞死亡的主要原因之一[5]。在冷凍保存過程中膜流動性和穩(wěn)定性是精子免受冷凍損傷的主要決定因素[6]。相關研究發(fā)現(xiàn)人類和兔精子中質(zhì)膜膽固醇/磷脂比值較高(0.99和0.88),精子抵抗冷應激的能力較強;大鼠(0.55)、牛(0.45)、綿羊(0.37)、豬(0.35)、山羊(0.59)的精子中膜膽固醇/磷脂比值較低,這些動物精子抵抗冷應激的能力較弱[7]。因此,膽固醇在精子冷凍保存中起到重要作用。

膽固醇作為細胞質(zhì)膜組成成分,對維持精子膜完整性具有重要作用。膽固醇外流改變了精子膜結構并增強了流動性,使許多蛋白質(zhì)、離子通道和酶的功能發(fā)生變化,導致冷凍解凍精子產(chǎn)生類似獲能的狀態(tài)[8]。這種現(xiàn)象可通過用外源性膽固醇或膽固醇類似物處理冷凍前精子來抑制獲能樣改變和自發(fā)性頂體反應[9]。環(huán)糊精是一種外表面親水、內(nèi)核疏水的環(huán)狀寡糖,對膽固醇有很強的親和力,可以作為膽固醇的載體轉(zhuǎn)移到細胞膜[10]。膽固醇-環(huán)糊精(CLC)是一種非滲透的冷凍保護劑,能夠通過外源添加提高提高精子膜中的膽固醇/磷脂比[11]。據(jù)報道,在牛、綿羊、兔、山羊、馬和豬的精子冷凍保存中,CLC預處理可以提高冷凍解凍后精子活力[12-17],但其具體的調(diào)控機制仍不清楚。因此,本研究比較了不同濃度膽固醇-環(huán)糊精預處理后對內(nèi)蒙古絨山羊精液的冷凍保存效果,在此基礎上進一步分析了精子內(nèi)Ca2+水平和酪氨酸磷酸化變化情況,為闡明絨山羊精子抗凍機制及提高絨山羊精液冷凍保存效果提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑和儀器

Tris、檸檬酸水合物、葡萄糖、乳酸和甘油,購自Sigma-Aldrich公司;青霉素-鏈霉素,購自GibcoTM公司;SOF液(NaCl 107.7 mmoL/L,KCl 7.16 mmoL/L,CaCl 21.71 mmoL/L,NaHCO325.07 mmoL/L,KH2PO41.19 mmoL/L,MgSO40.49 mmoL/L,Na Pyruvate 0.33 mmoL/L,Na Lactate 3.30 mmoL/L,Phenol-Red 1%,PS 1%,所需試劑均購自Sigma-Aldrich公司;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒,購自BD Pharmingen公司;精子頂體形態(tài)花生凝集素熒光標記(PNA-FITC)染色試劑盒,購自上海哈靈生物技術公司;Fluo3-AM(鈣離子熒光探針)、Western及IP細胞裂解液、PMSF和BCA蛋白濃度測定試劑盒,購自碧云天生物技術公司;10-壬基溴代吖啶橙,購自索萊寶科技有限公司;磷酸酶抑制劑,購自貝博生物科技有限公司;TCG(Tris 300 mmol/L,葡萄糖 56 mmol/L,檸檬酸 95 mmol/L;1%雙抗)。

計算機輔助精子分析系統(tǒng)(型號為IVOS Ⅱ,CASAS),購自IMV Technologies公司;流式細胞檢測儀(NovoCyte2040R),購自ACEA NovoCyteTM公司;酶標儀(Synergy HT)、凝膠成像儀(ChemiDoc XPC),購自Bio-Rad 公司;IMV密度儀,購自IMV Technologies公司。

以上試劑和儀器均來源于內(nèi)蒙古自治區(qū)羊遺傳育種與繁殖重點實驗室(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉羊遺傳育種重點實驗室)。

1.2 試驗動物

試驗羊選用內(nèi)蒙古金萊牧業(yè)有限公司的6只具有正常繁殖功能、1.5～2.0歲的內(nèi)蒙古絨山羊種公羊,飼養(yǎng)管理條件一致。

1.3 試驗步驟

1.3.1 精液采集及稀釋

采用假陰道法采集精液,取2 μL精液,與TGG室溫混合后取4 μL,于精子分析儀專用載玻片上,利用計算機輔助精子分析系統(tǒng)檢測精子活力,選擇射精量在1.5～2.0 mL、精子密度在30×109/mL以上、精子活力大于75%的精液在室溫下混合后使用,以消除個體差異。根據(jù)V.M.Salmon等[18]的方法配制不同濃度(0,1,2,3,4 mg/mL)的CLC,以零添加CLC組為對照組。在37 ℃條件下將混合后的精液與不同濃度CLC按1∶2.5(精液∶CLC)比例進行稀釋并孵育15 min。隨后將預處理的精液與基礎冷凍稀釋液(TCG+卵黃+甘油)進行混合。

1.3.2 精液冷凍

將稀釋后的精液置于30 ℃的水浴中,然后在4 ℃冰箱中緩慢降溫,1.5 h后水浴溫度降至4 ℃,灌裝于0.25 mL冷凍細管中,封管。將封裝后的冷凍細管置于4 ℃冰箱平衡30 min,然后在距離液氮液面4 cm處熏蒸10 min,投入液氮中冷凍。冷凍保存的精液于3 d后解凍,解凍時將凍精細管置于38 ℃水溫中解凍30 s。

1.3.3 運動參數(shù)檢測

冷凍解凍后的精液,利用計算機輔助精子分析系統(tǒng)檢測至少5個視野,檢測系統(tǒng)至少捕捉 1 000 個精子細胞。

1.3.4 精子結構完整性檢測

精液解凍后,加入1 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌,1 350 g/min離心5 min,棄去上清液。用PBS稀釋調(diào)整濃度為1.2×107/mL,加入PI/PNA-FITC進行精子頂體染色,用流式細胞檢測儀檢測精子頂體的完整性;用Annaxin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒檢測精子質(zhì)膜的完整性,方法同上。用PI/PNA-FITC染色后統(tǒng)計Q2(PI--PNA-),作為具有完整頂體的活精子比例;再用Annaxin V-FITC/PI染色后統(tǒng)計Q2(PI--Annexin V-)作為完整質(zhì)膜的活精子比例。在上述濃度下,加入吖啶橙染液,用流式細胞檢測儀檢測精子DNA的完整性,統(tǒng)計綠色熒光精子。

1.3.5 精子Ca2+水平檢測

檢測精子細胞中游離Ca2+濃度,洗滌后的精子加入PBS懸浮液,調(diào)整濃度為1.0×107/mL,加入5 μmol/L Fluo3-AM,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱避光孵育60 min,離心,棄去上清液后加入PBS懸浮液,繼續(xù)孵育30 min,之后洗滌2次,用流式細胞檢測儀檢測熒光強度。剩余部分通過PI染色后在熒光顯微鏡下觀察Ca2+分布情況。

1.3.6 鮮精獲能處理

新鮮精液用獲能液(SOF 液+2%山羊血清+6 IU/mL 肝素鈉)在 38 ℃、5% CO2條件下孵育 30 min,之后吸取上游精液,1 350 r/min離心3 min。

1.3.7 Western blot

將獲能處理的鮮精、冷凍解凍后的對照(LCL零添加)組和2 mg/mL CLC組精子分別用PBS洗滌,調(diào)整精子濃度為1.2×107/mL,加入300 μL Western及IP細胞裂解液、PMSF和磷酸酶抑制劑進行總蛋白提取,將細胞懸浮液進行超聲波裂解,之后10 000 r/min、4 ℃離心15 min,吸取上清液為總蛋白。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行總蛋白濃度測定。將待使用蛋白質(zhì)加入SDS-PAGE loading buffer(5×)中用開水煮沸10 min變性,-20 ℃保存,待用。變性后的蛋白樣品經(jīng)過12%的SDS-PAGE電泳分離,每個泳道上樣20 μL,總質(zhì)量40 μg,待電泳結束后使用半干轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)至PVDF膜(PALL)。將轉(zhuǎn)印有蛋白的PVDF膜在3%脫脂奶粉中室溫封閉2 h,再分別使用鼠源P-Tyrosime(cell signal,1∶2 000)4 ℃孵育過夜。用PBST洗膜3次,每次10 min,室溫分別孵育帶有HRP標簽的山羊抗鼠二抗(博奧森,1∶1 000),37 ℃孵育2 h,再用PBST洗膜3次,每次10 min。最后使用ECL曝光,凝膠成像儀掃描。利用ImageJ軟件對蛋白條帶進行灰度值分析。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

采用SAS 9.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA),P>0.05為差異不顯著,P<0.05 為差異顯著,P<0.01 為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 CLC對解凍后內(nèi)蒙古絨山羊精子質(zhì)量的影響

精子冷凍前用不同濃度的CLC處理,解凍后精子活力見圖1A,精子結構完整性結果見圖1B、圖1C、圖1D。由圖1可以看出:與對照組相比,各試驗組解凍后精子活力、質(zhì)膜與頂體完整率顯著升高(P<0.05),精子DNA完整率極顯著升高(P<0.01)。

注:柱標字母相間表示差異極顯著(P<0.01),相鄰表示差異顯著(P<0.05),相同表示差異不顯著(P>0.05)。

2.2 CLC對精子Ca2+水平的影響

內(nèi)蒙古絨山羊精液冷凍解凍后精子細胞中游離Ca2+水平見圖2。由圖2可以看出,2 mg/mL CLC組的精子Ca2+水平極顯著低于對照組(P<0.01),1,3,4 mg/mL CLC組顯著低于對照組(P<0.05)。

注:柱標字母相間表示差異極顯著(P<0.01),相鄰表示差異顯著(P<0.05),相同表示差異不顯著(P>0.05)。

2.3 CLC對精子蛋白酪氨酸磷酸的影響

Western blot分析結果見圖3。由圖3可以看出:鮮精獲能后精子的30,37,40,70 kD蛋白發(fā)生了酪氨酸磷酸化,但冷凍解凍后的精子在30,37,40 kD蛋白處發(fā)生了酪氨酸磷酸化,精子冷凍前用2 mg/mL的CLC處理后,與對照(CLC零添加)組相比,30,37,40 kD蛋白酪氨酸磷酸化明顯下降,但兩個冷凍組均未在70 kD蛋白處發(fā)生酪氨酸磷酸化。

注:A圖中1,2,3分別代表CLC零添加、鮮精獲能和2 mg·mL-1 CLC處理;B圖中柱標字母相間表示差異極顯著(P<0.01),相鄰表示差異顯著(P<0.05),含相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

精子對冷凍保存過程所引發(fā)的冷凍損傷極其敏感,這種敏感性與細胞膜的脂質(zhì)組成密切相關,特別是冷凍解凍過程所引起的精子膜脂質(zhì)的相變和聚集,質(zhì)膜中脂質(zhì)-脂質(zhì)和脂質(zhì)-蛋白間相互作用的改變[19]。精子質(zhì)膜中膽固醇/磷脂含量比與精子冷凍耐受性相關,膽固醇能夠使精子質(zhì)膜在低溫條件下的流動性增加,降低精子對冷應激的敏感性[20]。在本試驗中,冷凍前用CLC處理內(nèi)蒙古絨山羊精子,與對照組相比,冷凍解凍后精子活力、DNA完整性、具有完整質(zhì)膜和頂體的活精子比例顯著或極顯著升高。在綿羊、山羊和牛精子的冷凍保存中也都發(fā)現(xiàn)CLC預處理能夠提高精子解凍后活力和結構完整性[21-22]。但是膽固醇在精子冷凍保存過程中的具體調(diào)控機制仍需要進一步闡明。

蛋白酪氨酸磷酸化是調(diào)節(jié)精子獲能最重要的細胞內(nèi)信號事件之一。cAMP/PKA和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶是蛋白酪氨酸磷酸化的重要信號通路。在精子獲能過程中,細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加激活了可溶性腺苷酸環(huán)化酶,進而觸發(fā)了cAMP/PKA下游通路,導致精子發(fā)生酪氨酸磷酸化[23-25]。精子冷凍保存過程也會導致精子提前獲能。有報道表明,牛和豬精子冷凍解凍后發(fā)生的獲能變化主要表現(xiàn)為酪氨酸磷酸化水平顯著提升[26-27]。但冷凍保存后的精子與正常獲能精子發(fā)生的蛋白酪氨酸磷酸化存在差異,因此冷凍造成的精子提前獲能不是真正意義上的獲能[28-29]。在本研究中,內(nèi)蒙古絨山羊新鮮精液經(jīng)獲能處理后,在30,37,40,70 kD位點的4種蛋白發(fā)生酪氨酸磷酸化,其中37,40 kD位點的酪氨酸磷酸化與豬精子和馬鹿精子誘導獲能后發(fā)生的酪氨酸磷酸化一致[30]。但是,冷凍保存后的精子蛋白酪氨酸磷酸化主要發(fā)生在30,37,40 kD蛋白,這也說明冷凍保存只引起精子的部分獲能樣變化。在本試驗中,內(nèi)蒙古絨山羊精子經(jīng)CLC預處理后再進行冷凍保存,結果發(fā)現(xiàn)30,37,40 kD蛋白酪氨酸磷酸化都發(fā)生明顯降低,表明膽固醇預處理內(nèi)蒙古絨山羊精子可降低精子冷凍保存所引起的“獲能”樣變化。另外,本試驗中2 mg/mL CLC預處理后,冷凍解凍的精子細胞中游離Ca2+水平顯著降低,這可能是由于CLC預處理后,降低了精子在冷凍保存過程中的膜通透性,進而抑制冷凍誘導的精子細胞Ca2+內(nèi)流、并導致精子蛋白酪氨酸磷酸化水平的顯著下降。M.L.M.Carro等[31]的研究也證明,綿羊精子經(jīng)過膽固醇前體物鏈甾醇預處理后,解凍后保持了較低的酪氨酸磷酸化水平。

4 結 論

冷凍前利用適量濃度 CLC預處理內(nèi)蒙古絨山羊精液,能夠提高精子在冷凍保存過程中的膜結構穩(wěn)定性,減少Ca2+內(nèi)流,降低精子蛋白酪氨酸磷酸化水平,進而提高絨山羊精子冷凍保存效果。