孟月麗 管 樂 俞 蓓 王 龑

（浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 浙江 杭州 310014）

硫色曲霉是在土壤、谷物殼上分離發(fā)現(xiàn)并在谷物貯藏期生長繁殖產(chǎn)生赭曲霉毒素的一種絲狀真菌。赭曲霉毒素是由曲霉和青霉產(chǎn)生的一種真菌毒素，是各種食品和飼料中常見的生物污染物［1］。赭曲霉毒素包括7種結(jié)構(gòu)類似的化合物，其中赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是毒性最大、污染最嚴(yán)重的化合物［2-3］。OTA 主要污染糧谷類［4］，也可能污染咖啡豆［5-6］、蘋果［7］、可可［8］、巧克力［9］、堅果［10］、葡萄［11］、香腸［12］等。OTA 的產(chǎn)生菌有許多種［13］，其熔點為169 ℃，具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，很難輕易去除，即使加熱至125 ℃也不會對OTA造成明顯破壞。這表明大多數(shù)食品加工條件不能去除OTA［14］，因此OTA預(yù)防難度非常大。

OTA廣泛存在于環(huán)境中，可以通過食物、皮膚和呼吸吸入進(jìn)入人體［15］，進(jìn)入人體后OTA 可引起腸道消化不良癥，包括增加腸道滲透性和細(xì)菌轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致肝細(xì)胞退化，腸道和淋巴組織壞死［16］。有研究發(fā)現(xiàn)，OTA 可誘發(fā)腎損傷、DNA 損傷反應(yīng)和腎細(xì)胞細(xì)胞循環(huán)阻斷，進(jìn)而導(dǎo)致多種病理［17］。OTA 還具有誘發(fā)致畸、胚胎毒性、致癌性、肝毒性、免疫毒性和腎毒性等有毒特性［18］，因此其受到國家和國際一級的法律監(jiān)管［13］。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將OTA 歸類為可能的人類致癌物質(zhì)［19］。歐盟規(guī)定未加工的糧谷物中OTA 的最高允許量為5 μg·kg-1，其他可直接食用加工制品的最高允許量為3 μg·kg-1。嬰幼兒及有特殊醫(yī)療目的的食物中OTA 含量不超過0.5 μg·kg-1，葡萄酒中OTA 含量不超過2 μg·L-1。我國質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)《GB 2761-2017 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》［20］規(guī)定谷物、豆類及其制品中OTA 的最高允許量為5 μg·kg-1。鑒于OTA 的毒性和污染性，如何有效控制及預(yù)防其產(chǎn)生尤為關(guān)鍵，而OTA 的產(chǎn)生與所處環(huán)境和培養(yǎng)條件有很大關(guān)系［21-23］。因此，研究環(huán)境因子對OTA 生長和毒素產(chǎn)生的影響，對控制OTA的產(chǎn)生具有重要意義。

赭曲霉毒素可由30多種曲霉和青霉產(chǎn)生［13，24］，近年來報道的有赭曲霉［25］、硫色曲霉［26］、蜂蜜曲霉、黑曲霉、韋氏曲霉［27］以及炭黑曲霉［28］等。劉菲等［29］研究了不同培養(yǎng)基對赭曲霉生長及產(chǎn)毒能力的影響，通過比較不同培養(yǎng)基上赭曲霉產(chǎn)毒和生長的差異性，篩選到赭曲霉生長和產(chǎn)毒的最佳條件。陳倫佳等［30］研究了不同條件對炭黑曲霉產(chǎn)赭曲霉毒素A 能力的影響，通過單因素分析和響應(yīng)面優(yōu)化法研究炭黑曲霉在不同條件下的產(chǎn)毒能力，得到了炭黑曲霉產(chǎn)毒的最佳條件。朱柳楊等［31］研究了黑曲霉產(chǎn)赭曲霉毒素A 在不同環(huán)境因素下的產(chǎn)量，確定了黑曲霉產(chǎn)赭曲霉毒素A 的最佳條件。然而，目前關(guān)于在不同條件下研究硫色曲霉產(chǎn)赭曲霉毒素的報道很少，硫色曲霉的生長和產(chǎn)毒特性也不清楚。

因此，本研究分別探討了不同固體培養(yǎng)基以及不同天然培養(yǎng)基對硫色曲霉生長和產(chǎn)毒的影響，為硫色曲霉產(chǎn)赭曲霉毒素的研究填補(bǔ)了空白，以期為控制硫色曲霉的生長和產(chǎn)毒提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 本試驗所用硫色曲霉分離自水稻種植的土壤樣品，通過形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定方法確定為硫色曲霉GZ-R1。

1.1.2 試劑 馬鈴薯購自農(nóng)貿(mào)市場；葡萄糖、蔗糖購自北京化工廠；定量濾紙購自杭州特種紙業(yè)有限公司；微纖維濾紙購自北京北化黎明膜分離技術(shù)有限責(zé)任公司；甲醇分析純AR、甲醇色譜純購自美國Thermo Fisher 公司；吐溫80、甘油、瓊脂粉、乙酸以及酵母提取物購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 HR60-IIA2型生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；LS-B50L-I 型立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；ZWY-2102C 型雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智誠分析儀器制造有限公司；B5-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；YP3002 型電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；DGG-9053A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；SHZ-III 型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；SC18G 型冷凍離心機(jī)，美國Sigma 公司；1DW-86LZ86 型超低溫保存箱，日本三洋公司；1260 型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）、熒光檢測器（fluorescence detection， FLD）、TCC18 色譜柱，英國安捷倫公司；ULTRA-TURRAX T 25 digital型分散器，德國IKA 公司；SZ2-1LST型電子顯微鏡，日本Olympus 公司；氮氣吹掃儀，杭州奧威儀器有限公司；微量進(jìn)樣瓶，英國安捷倫公司；0.22 μm 微孔濾器，天津科藝隆實驗設(shè)備有限公司；SK06G型超聲波清洗器，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 酵母浸膏蔗糖（yeast extract with supplements，YES）培養(yǎng)基（1 L）：酵母提取物20 g、蔗糖150 g、瓊脂20 g。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基（1 L）∶200 g馬鈴薯浸出液、葡萄糖20 g、瓊脂20 g。

察氏酵母膏瓊脂（czapek yeast extract agar，CYA）培養(yǎng)基（1 L）：蔗糖30 g·L-1、NaNO33 g·L-1、K2HPO41.0 g·L-1、MgSO40.5 g·L-1、KCl 0.5 g·L-1、FeSO40.01 g·L-1、酵母膏1 g·L-1、瓊脂15 g·L-1。

哥倫比亞瓊脂（columbia agar，CA）培養(yǎng)基（1 L）：NaNO32 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCL 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

氯硝胺孟加拉紅瓊脂（double rich broth with charcoal，DRBC）培養(yǎng)基（1 L）：購于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

天然培養(yǎng)基：將玉米、小麥、水稻、花生進(jìn)行打碎處理，取處理和未處理的樣品各25 g，置于100 mL三角瓶中。

以上培養(yǎng)基均置于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 菌種活化及孢子液的制備 將封存于-80 ℃甘油管的菌株在PDA培養(yǎng)基上復(fù)蘇，28 ℃下培養(yǎng)6～8 d，活化備用。用滅菌棉簽刮下，放到滅菌的0.1%的吐溫80 中，渦旋震蕩制成均勻的孢子懸液，并用血球計數(shù)板計數(shù)，稀釋到1×10-7個·mL-1備用。

1.2.3 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)以及OTA 提取 取10 μL 硫色曲霉孢子液分別滴在YES、PDA、CYA、DRBC、CA 等固體平板中心，在不同溫度下（15、20、25、30、37 ℃）培養(yǎng)8 d，觀察菌落形態(tài)，測定菌落直徑。用5 mm 打孔器在距離接種點同等距離打孔，每個平板打孔取樣5個。將打孔樣品加入2 mL甲醇，充分振蕩混勻。用0.22 μm有機(jī)微孔濾器過濾至進(jìn)樣瓶，高效液相色譜-熒光（high performance liquid chromatography-fluorescence detection， HPLC-FLD）檢測OTA含量。

1.2.4 不同pH 值的培養(yǎng) 取10 μL硫色曲霉孢子液分別滴在YES培養(yǎng)基上，在不同pH 值下（4.5、6、8、10）培養(yǎng)9 d，觀察菌落形態(tài)，直徑大小。用5 mm 打孔器在距離接種點同等距離打孔，每個平板打孔取樣5個。將打孔樣品加入2 mL甲醇，充分振蕩混勻。用0.22 μm有機(jī)微孔濾器過濾至進(jìn)樣瓶，HPLC-FLD檢測OTA含量。

1.2.5 天然培養(yǎng)基培養(yǎng)和OTA 提取 取10 μL 硫色曲霉孢子液分別滴在花生、玉米、水稻、小麥天然培養(yǎng)基上，在不同水分活度（0.90、0.92、0.94、0.96、0.98）下培養(yǎng)9 d。磨碎，取1 g 粉碎的樣品加入2 mL 甲醇，充分振蕩混勻。用0.22 μm有機(jī)微孔濾器過濾至進(jìn)樣瓶，HPLC-FLD檢測OTA含量。

1.2.6 液相色譜檢測 提取液用0.22 μm 濾膜過濾到棕色液相進(jìn)樣瓶中，直接上樣。選用Agilent 1260型高效液相色譜儀、C18反向色譜柱（25 cm×4.6 mm，內(nèi)徑5 μm）和熒光檢測器；設(shè)定工作參數(shù)：激發(fā)波長333 nm，發(fā)射波長460 nm；進(jìn)樣量20 μL；流動相為乙腈∶水∶酸（99∶99∶2）；流速1 mL·min-1；柱溫30 ℃［32］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有處理均設(shè)3 個重復(fù)，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）分析，使用最小顯著差異法（least significant difference，LSD）進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）；所有分析圖均采用GraphPad Prism 8.0軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基下硫色曲霉的生長情況

硫色曲霉在YES、PDA、CYA、DRBC、CA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)到第8 天時，菌落大小差異較大，顏色多呈黃、白色，孢子產(chǎn)量一般或極少，都有不同程度褶皺。菌落形態(tài)觀察如圖1-A所示。測量不同固體培養(yǎng)基上硫色曲霉的直徑，結(jié)果如圖1-B所示。

圖1 硫色曲霉在不同固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)8 d的生長情況Fig.1 Growth of A. sulphureus in different culture medium after incubated eight days

由表1 可知，硫色曲霉在YES 培養(yǎng)基上生長最快，菌落直徑最大，為7.15 cm，且有褶皺，菌絲發(fā)達(dá)，適宜用于觀察硫色曲霉的生長情況。硫色曲霉在PDA 和CYA 培養(yǎng)基上的生長速度僅次于YES 培養(yǎng)基，菌落直徑分別為6.20 和5.75 cm，這兩種培養(yǎng)基適用于硫色曲霉生長特性的研究，且CYA培養(yǎng)基孢子產(chǎn)量最高，適于孢子計數(shù)。硫色曲霉在DRBC和CA培養(yǎng)基上長勢相對較慢，且無褶皺，菌落直徑分別為4.10 和3.20 cm，DRBC 培養(yǎng)基上幾乎不產(chǎn)生孢子，這兩種培養(yǎng)基不適宜觀察硫色曲霉的生長特性，但可用于硫色曲霉的分離和計數(shù)。

表1 硫色曲霉在不同培養(yǎng)基上第8天的生長情況Table 1 Growth situation of A. sulphureus on the eighth day in different medium

2.2 不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)時間對硫色曲霉生長情況的影響

由圖2-A 可知，在YES、PDA、CYA、DRBC、CA 培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)時間的延長，硫色曲霉的生長直徑呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，菌落直徑越來越大，培養(yǎng)第8 天時，生長直徑最大。由圖2-B可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，硫色曲霉的生長速率呈現(xiàn)波動降低的趨勢，均在第4 天時最大，此時生長最快的是YES 培基，生長速率為61%，最慢的是CA 培養(yǎng)基，生長速率為33%；在不同培養(yǎng)基上，硫色曲霉生長速率始終呈現(xiàn)正值，在第5、第6天時生長速率在20%～30%左右，在第7、第8天時生長速率為15%左右，在第8天時，除CA 培養(yǎng)基外，其他培養(yǎng)基的生長速率均降至最低。

2.3 不同pH值對硫色曲霉生長情況的影響

硫色曲霉在YES 培養(yǎng)基上有最大生長直徑，因此在YES 培養(yǎng)基上培養(yǎng)硫色曲霉并觀察不同pH 值對硫色曲霉生長情況的影響。培養(yǎng)到第8 天時，在YES 培養(yǎng)基上不同pH 值下硫色曲霉的生長情況如圖3 所示。pH 值為4.5 時，硫色曲霉不生長，隨著pH 值的增加，硫色曲霉的生長直徑變大，在pH 值為8 時，有最大生長直徑5.80 cm，在pH 值為10 時，生長直徑又變小。表明偏中性和弱堿性環(huán)境適合硫色曲霉生長，酸性環(huán)境抑制硫色曲霉生長。

圖2 硫色曲霉在不同培養(yǎng)基上的生長直徑（A）和生長速率（B）Fig.2 Growth diameter （A） and Growth rates （B） of A. sulphureus on different media

圖3 在YES培養(yǎng)基下硫色曲霉在不同pH時培養(yǎng)第8天的生長直徑Fig.3 Growth diameter of A. sulphureus in YES medium at different pH values after incubated eight days

2.4 不同培養(yǎng)基上硫色曲霉的產(chǎn)毒能力

硫色曲霉在不同固體培養(yǎng)基上的產(chǎn)毒差異明顯，由此可知硫色曲霉的產(chǎn)毒條件和外界環(huán)境是密不可分的。由圖4可知，培養(yǎng)9 d時硫色曲霉在PDA 培養(yǎng)基上產(chǎn)毒量最高，OTA 含量為10.03 mg·kg-1，這是因為PDA 培養(yǎng)基主要成分為馬鈴薯淀粉和葡萄糖，可以為硫色曲霉提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和碳源，提高其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。其次是DRBC、CA 培養(yǎng)基上產(chǎn)毒量較高，OTA含量分別為6.77 和6.16 mg·kg-1，而 在CYA 和YES培養(yǎng)基上未檢測到OTA毒素。

圖4 硫色曲霉在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)第9天的OTA含量Fig.4 The OTA content of A. sulphureus in different medium after incubated nine days

2.5 不同天然培養(yǎng)基上硫色曲霉的產(chǎn)毒能力

低水分活度的天然培養(yǎng)基不產(chǎn)生毒素。為了提高培養(yǎng)基的水分活度，向天然培養(yǎng)基中加入適量的水。表2顯示了加水后天然培養(yǎng)基上的水分活度（aw）變化，加水后24 h天然培養(yǎng)基上的水分活度大幅度增高，花生、玉米、小麥、水稻初始aw分別為0.26、0.34、0.33、0.33，加水3 d 后aw均穩(wěn)定在0.97～0.98 范圍內(nèi)，水分活度基本保持不變，此時可用于研究硫色曲霉的產(chǎn)毒能力。

表2 天然培養(yǎng)基上水分活度的變化Table 2 Variation of water activity on natural media

圖5 顯示了培養(yǎng)9 d 時，硫色曲霉在不同天然培養(yǎng)基上的OTA 產(chǎn)毒能力。用花生、玉米、小麥、水稻作為天然培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)毒試驗，硫色曲霉在花生培養(yǎng)基上產(chǎn)毒量最高，OTA 含量為14.04 mg·kg-1；其次是小麥培養(yǎng)基，OTA 含量為9.02 mg·kg-1；玉米和水稻培養(yǎng)基上產(chǎn)毒基本相當(dāng)，OTA含量分別為6.41和6.00 mg·kg-1。

圖5 硫色曲霉在不同天然培養(yǎng)基上培養(yǎng)第9天的OTA含量Fig.5 The OTA content of A. sulphureus in different natural media after incubated nine days

3 討論

3.1 不同固體、天然培養(yǎng)基中硫色曲霉的生長情況

為研究硫色曲霉的生長條件和產(chǎn)毒情況，本研究分別在不同固體培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基中培養(yǎng)硫色曲霉，觀察其菌落形態(tài)、生長速率和產(chǎn)毒條件，結(jié)果表明，硫色曲霉在YES 培養(yǎng)基上生長最好，菌絲發(fā)達(dá)，在PDA培養(yǎng)基上生長僅次于YES 培養(yǎng)基，可能是因為YES 培養(yǎng)基上的酵母浸膏營養(yǎng)豐富，含有多種有利于微生物分泌代謝產(chǎn)物的因子，如多肽、氨基酸、碳源、氮源和微量元素等，同時有蔗糖作為碳源，從而使硫色曲霉生長較好［33］；而PDA 培養(yǎng)基中雖然碳源充足，但氮源與無機(jī)鹽較少，故長勢相對較弱，但兩者均可為菌體提供充足的營養(yǎng)成分，用來觀察硫色曲霉的生長特性。前期研究表明，硫色曲霉在YES 培養(yǎng)基上生長最好，因此選擇YES 培養(yǎng)基培養(yǎng)硫色曲霉并改變培養(yǎng)基中的pH值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同pH 中的硫色曲霉生長差異較大，在pH 值為8 時，硫色曲霉有最大的生長直徑，這可能是因為環(huán)境中不同的pH值會影響到細(xì)胞膜所帶的電荷，從而導(dǎo)致細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收也出現(xiàn)差異性［34］。Akkermans 等［35］在2017 年研究了pH 對微生物生長的抑制作用，發(fā)現(xiàn)pH 為中性和弱堿性時，微生物的生長速率較高。這與本研究中硫色曲霉在弱堿性條件下有最大生長直徑，而在酸性和堿性條件下，其菌落直徑會減小的結(jié)果也較為一致。固體培養(yǎng)基中，硫色曲霉在PDA 培養(yǎng)基上產(chǎn)毒最佳，可能是因為PDA 培養(yǎng)基中含有馬鈴薯和葡萄糖，而馬鈴薯中含有淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、粗纖維，還含有豐富的鈣、磷、鐵、鉀等礦物質(zhì)及VC、VA和B 族類維生素，營養(yǎng)豐富［36］；其次是因為葡萄糖作為優(yōu)質(zhì)碳源可為硫色曲霉生長提供豐富的碳源，進(jìn)而使其產(chǎn)毒量較高，所以PDA 是觀察硫色曲霉產(chǎn)毒的最佳培養(yǎng)基。硫色曲霉在CYA 和PDA 培養(yǎng)基上生長較好，僅次于YES培養(yǎng)基，但在CYA和YES培養(yǎng)基上不產(chǎn)毒，這是因為盡管CYA培養(yǎng)基中所含有的碳源可以滿足硫色曲霉的生長，但其培養(yǎng)基中所含有的硝酸鈉會抑制OTA 的產(chǎn)生［37］，所以CYA 和PDA 培養(yǎng)基可用于觀察硫色曲霉的生長，而PDA 培養(yǎng)基可同時用于觀察硫色曲霉的生長和產(chǎn)毒。

3.2 硫色曲霉在天然培養(yǎng)基上的產(chǎn)毒量比較

天然培養(yǎng)基不適宜觀察硫色曲霉的生長情況，因為天然培養(yǎng)基本身的成分會對硫色曲霉DNA和RNA的提取造成影響，也不利于觀察其孢子形態(tài)。硫色曲霉在天然培養(yǎng)基上的產(chǎn)毒量較高，在花生培養(yǎng)基上產(chǎn)毒量最高，可以達(dá)到14.04 mg·kg-1，小麥、玉米、水稻也會因為硫色曲霉的污染而產(chǎn)生赭曲霉毒素，但花生中更容易因硫色曲霉污染而產(chǎn)生赭曲霉毒素，這可能是由花生中脂肪、蛋白質(zhì)含量最為豐富所致［38］。高婧等［39］研究不同群體密度的赭曲霉孢子侵染糧食的規(guī)律時發(fā)現(xiàn)，低密度和高密度赭曲霉污染花生、大豆、玉米、小麥等農(nóng)作物后，花生和大豆的發(fā)芽率下降最多，說明脂肪及蛋白質(zhì)含量高的糧食可能更容易受到赭曲霉的污染，這與本研究發(fā)現(xiàn)的硫色曲霉的侵染規(guī)律類似。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，固體培養(yǎng)基上，硫色曲霉在YES 培養(yǎng)基上生長最好，菌絲最發(fā)達(dá)，但不產(chǎn)毒，可用于觀察硫色曲霉的生長特性。改變YES 培養(yǎng)基的pH 發(fā)現(xiàn)，pH 值為8 時最適宜硫色曲霉生長，偏中性和弱堿性環(huán)境適合硫色曲霉生長，酸性環(huán)境抑制其生長。在PDA培養(yǎng)基上的生長情況僅次于YES 培養(yǎng)基，同時有最高產(chǎn)毒量，所以PDA 培養(yǎng)基可用于OTA 的生長和產(chǎn)毒特性研究。谷物等農(nóng)產(chǎn)品會因為硫色曲霉的污染而產(chǎn)生赭曲霉毒素，硫色曲霉在天然培養(yǎng)基上的OTA 產(chǎn)毒能力表現(xiàn)為花生＞小麥＞玉米＞水稻。