吳志鵬,林麗彬,柯益彬,韓麗紅 (莆田學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)教研室,福建 莆田 351100)

紙層析法肝臟組織氨基移換實驗是生物化學(xué)實驗課程中常見的一個實驗。傳統(tǒng)的實驗過程所用的層析液是苯酚。但苯酚對黏膜、皮膚具有較強的腐蝕作用。苯酚還可抑制中樞神經(jīng)損傷肝臟和腎臟,同時苯酚易揮發(fā)會散發(fā)出非常難聞的氣味,特別是在一個實驗室里有多人用苯酚進行紙層析時,對學(xué)生的身體健康會有不好的影響。近年來,有不少學(xué)者為了優(yōu)化本實驗進行了一些有益的嘗試。比如游云悠等[1]比較不同的緩沖液類型、轉(zhuǎn)氨基時間等對轉(zhuǎn)氨基的影響。劉美艷、陳舒麗、陳剛等[2～4]也對氨基酸紙層析實驗的改進進行了初步研究。本文探索用低毒且氣味小的乙醇溶液代替苯酚作為層析液,在紙層析法肝臟組織氨基移換實驗中的運用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮動物肝臟,水浴鍋,勻漿器,噴霧器,電吹風(fēng)機,點樣毛細管,表面皿,圓型濾紙,鑷子,直尺,圓規(guī)等。0.1mol/L丙氨酸,0.1mol/L谷氨酸,0.1mol/L α-酮戊二酸,0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液,0.5%茚三酮溶液,70%～90%乙醇層析溶液,苯酚層析溶液(水飽和苯酚溶液)。

1.2 方法

轉(zhuǎn)氨酶液的制備和氨基移換反應(yīng):用常規(guī)方法進行轉(zhuǎn)氨酶液的制備,氨基移換反應(yīng)中對照管中的酶經(jīng)過沸水浴滅活,測定管中的酶一直在37℃水浴鍋中保持較大活性。對照管和測定管同時加入1.5mL的0.01mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液和反應(yīng)底物0.5mL的0.1mol/Lα-酮戊二酸、0.5mL的0.1mol/L丙氨酸溶液。

配制70%～90%乙醇層析溶液:用95%的乙醇溶液加蒸餾水分別配制70%的乙醇溶液、80%的乙醇溶液、90%的乙醇溶液各500mL這3種不同濃度的乙醇溶液各加入2.5g的尿素和0.5g的茚三酮最終配制成70%～90%乙醇層析溶液。

苯酚層析和70%～90%乙醇層析:取4張干凈平整的圓濾紙,先用圓規(guī)從圓濾紙中心畫上半徑為1cm的圓,再用鉛筆如下圖1所示作三條過圓心的直虛線與同心圓相交的6個點,分別標記1～6作為點樣原點。用濾紙做引流的燈芯插在圓心處如圖2層析裝置示意圖所示。取干凈的毛細玻璃管在標記1處點樣原點小心點上少量0.1mol/L丙氨酸標準液,用另一根干凈的毛細玻璃管在標記4處點樣原點小心點上少量0.1mol/L谷氨酸標準液。同樣在2、6兩處點樣原點均小心點上少量的測定管過濾液,在3、5兩處點樣原點均小心點上少量對照管過濾液。1張圓濾紙上完樣品后用苯酚層析,另外3張圓濾紙上完樣品后分別用70%乙醇層析液、80%乙醇層析液、90%乙醇層析液層析。這四張圓濾紙對應(yīng)各點上的點樣量一致。乙醇層析時間為35min,苯酚層析時間為45min。

圖1 圓濾紙上的六個點樣原點

圖2 層析裝置示意圖

顯色和Rf值計算:層析一旦結(jié)束立刻用鉛筆標記各圓濾紙溶劑前沿位置。苯酚層析的圓濾紙先小心用吹風(fēng)機吹干,吹干后再用噴霧器均勻噴撒0.5%茚三酮溶液,把吹風(fēng)機調(diào)到熱風(fēng)狀態(tài),對已經(jīng)噴撒茚三酮溶液圓濾紙吹干顯色。70%～90%乙醇層析的3張圓濾紙,因為乙醇層析溶液里面提前溶解茚三酮,直接用吹風(fēng)機在加熱狀態(tài)下吹干顯色。確定各色斑中心并按下列計算Rf值公式統(tǒng)計各斑點氨基酸的Rf值(Rf=色斑中心至點樣原點的距離/溶劑前沿至點樣原點的距離)。

2 結(jié)果

2.1 苯酚作為層析液分離鑒定氨基酸

苯酚作為層析液分離鑒定氨基酸顯色結(jié)果如圖3所示。圖3中1處和4處分別顯示標準丙氨酸和的標準谷氨酸的色斑,它們作為特定氨基酸的判斷依據(jù)。圖3中2處和6處是測定管樣品層析結(jié)果,因為轉(zhuǎn)氨酶(ALT)有活性,轉(zhuǎn)氨酶會把反應(yīng)底物中部分丙氨酸的氨基轉(zhuǎn)移給a一酮戊二酸從而生成了谷氨酸。由于丙氨酸過量,因此圖中2處和6處都有丙氨酸和谷氨酸的兩個色斑。圖3中3處和5處是對照管樣品層析結(jié)果,由于其轉(zhuǎn)氨酶被滅活,沒有谷氨酸生成。故都只有一個丙氨酸的色斑。

圖3 苯酚作為層析液分離圖譜

2.2 70%～90%乙醇層析液分離鑒定氨基酸

70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇作為層析液分離鑒定氨基酸顯色結(jié)果分別如圖4～6所示。圖中各處顯示色斑的意義和原理與圖3一樣。

圖4 70%乙醇層析圖譜

2.3 苯酚和80%乙醇層析液層析圖片Rf值計算結(jié)果

確定個色斑中心后再用直尺分別量出圖3和圖5中從點樣原點到層析色斑中心的距離(x),以及從點樣原點到溶劑前沿的距離(y),計算各樣品的Rf值(Rf=x/y)。

表1 苯酚層析分離鑒定圖3各氨基酸的Rf值(x、y單位cm)

表2 80%乙醇層析分離鑒定圖5各氨基酸的Rf值(x、y單位cm)

圖5 80%乙醇層析圖譜

3 討論

紙層析法肝臟組織氨基移換實驗是生物化學(xué)實驗課程中常見的一個實驗。同時不斷改進的紙層析法也用于分離油菜籽中脂肪酸、大豆磷脂的分析與檢測以及甲基營養(yǎng)菌5222產(chǎn)L-絲氨酸等[5～8]。

對比圖4圖5和圖6,在點樣量和層析時間相同的前提下, 80%乙醇層析圖譜(圖5)效果最好。紙層析是以濾紙為支持物,與濾紙纖維結(jié)合的水為固定相,參與層析的有機溶劑作為流動相。在圖4圖5和圖6的實驗中,有機溶劑分別是70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、90%乙醇溶液。由于乙醇溶液濃度不一樣,相應(yīng)的水濃度也不一樣。要形成較穩(wěn)定的固定相需要合適的水濃度與濾紙纖維進行有效結(jié)合。較穩(wěn)定的固定相有利于不同氨基酸的層析分離。實驗表明80%乙醇溶液是比較合適層析液,其層析的圖譜比70%乙醇溶液和90%乙醇溶液乙醇溶液得到的圖譜更加清晰,色斑更加集中,更有利于下一步各色斑Rf值計算。乙醇溶液中添加少量的尿素,尿素可以增強濾紙纖維素吸附水的能力,有利于不同氨基酸的紙層析分離。

圖6 90%乙醇層析圖譜

通過比較圖3和圖5中標準氨基酸色斑Rf值與對照組和實驗組中的相應(yīng)色斑Rf值對應(yīng)關(guān)系,當(dāng)兩者Rf值相等時,可判斷對照組和實驗組中的相應(yīng)色斑與標準氨基酸一樣。在以苯酚作為層析液實驗中,丙氨酸的Rf值是0.64,谷氨酸的Rf值是0.34,因此可以判定對照組和實驗組中的色斑所代表的氨基酸與標準氨基酸一致。在以80%乙醇作為層析液實驗中,丙氨酸的Rf值是0.61,谷氨酸的Rf值是0.38,因此也可以判定對照組和實驗組中的色斑所代表的氨基酸與標準氨基酸一致。實驗結(jié)果表明在進行肝臟組織氨基移換作用實驗中,80%乙醇溶液作為新型層析液與傳統(tǒng)的苯酚作為層析液試驗結(jié)果具有相同的可靠性。需要說明的是,由于苯酚和乙醇是兩種不同的層析液,故同一種氨基酸其Rf值在不同層析液中是有所差異的。

80%乙醇溶液中還直接添加了茚三酮,故層析一旦結(jié)束,可以直接用吹風(fēng)機在加熱狀態(tài)下吹干顯色。而苯酚層析后,需把圓濾紙先小心用吹風(fēng)機吹干,吹干后再用噴霧器均勻噴撒0.5%茚三酮溶液,再用吹風(fēng)機在加熱狀態(tài)下吹干顯色。前者步驟更簡便,所用器材也少。因此可以節(jié)約成本和縮短實驗時間。關(guān)鍵是乙醇層析液相比于苯酚層析液具有低毒環(huán)保優(yōu)點。