張秀峰 王厚東 裘建明 魯振鋒 邵書先 沈忠

肛瘺是肛腸科常見病，可發(fā)生于任何年齡段人群，多見于青壯年。肛瘺急性期表現(xiàn)為肛周腫痛、破潰流膿，且具有反復(fù)發(fā)作的特點，嚴重影響患者生活。目前臨床上治療肛瘺的主要方式是外科手術(shù)，經(jīng)典術(shù)式為肛瘺切開術(shù)和切除術(shù)，但術(shù)后切口愈合較慢、疼痛明顯且持續(xù)時間長、住院時間長、復(fù)發(fā)率較高，同時手術(shù)會損傷肛門括約肌，有發(fā)生肛門功能減退，甚至肛門失禁的風(fēng)險。自體濃縮生長因子（concentrated growth factor，CGF）是通過離心的方法從自體外周靜脈血中提取的、含有高濃度生長因子的產(chǎn)物，具有加速傷口愈合的功效。本研究對CGF 凝膠治療肛瘺的效果及作用機制作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）抗體（批號：AF0240）、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體（批號：AF0239）、α 平滑肌肌動蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）抗體（批號：AF1032）、cfos 抗體（批號：AF5354）均購自美國Affinity 公司；LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑（批號：L3000075）購自美國Thermo Fisher 公司；YF?594 Click-iT 5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine，Edu）Imaging Kits 細胞增殖檢測試劑盒（批號：40276ES60）購自上海翌圣生物科技股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：CW2569）購自北京康為世紀生物科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）購自江蘇親科生物研究中心有限公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ（批號：RR820A）購自日本Takara 公司；Edu-594 細胞增殖檢測試劑盒（批號：C0078s）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。qRTPCR 儀購自美國Bio Rad 公司；Medifuge 離心機購自意大利Silfradent 公司；酶標儀購自美國MD 公司；Ts2-FC倒置熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)購自日本尼康公司。

1.2 實驗動物 30 kg 雄性長白豬6 只，由江蘇吳江田宇生物科技有限公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2021-0007]提供，飼養(yǎng)于清潔級動物房標準籠中，予標準飼料，自由攝食、飲水。飼養(yǎng)條件：溫度26 ℃，濕度50%，環(huán)境噪聲＜60 dB。本實驗經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物管理與倫理委員會審查通過（批準文號：IACUC-20211018-16）。

1.3 肛瘺造模 （1）依據(jù)相關(guān)文獻報道的掛線法進行肛瘺造模[1]。6 只長白豬術(shù)前禁食1 d。全麻成功后取仰臥位，固定四肢；清理豬肛管內(nèi)殘留糞便，常規(guī)備皮、消毒及鋪巾。于左側(cè)距離肛緣約2 cm 處作一大小約0.5 cm 的切口，使用血管鉗鈍性分離皮下組織至齒狀線上，注意避開肛門括約?。皇褂醚茔Q尖端于齒狀線上刺破直腸黏膜，鉗夾引入絲線；在絲線引導(dǎo)下穿入橡皮筋并固定。同法在右側(cè)對稱部位及尾部做2個掛線，見圖1（插頁）。術(shù)后第30 天造影檢查結(jié)束后切除尾部瘺管進行病理學(xué)檢查，以明確瘺管是否形成；取左右兩側(cè)瘺管分成凝膠組和對照組進行動物實驗。（2）術(shù)后第14 天去除橡皮筋，第30 天采用瘺管造影檢查評估瘺管是否形成，見圖2（插頁）。全麻成功后取仰臥位，兩后肢充分外展，清理下端直腸內(nèi)殘留糞便，輕柔置入60 mL 注射器外套筒，注意避免損傷腸黏膜；取合適的X 線攝片體位后，將對比劑自瘺管外口緩慢注入，防止外漏，邊注入邊攝片，觀察瘺管管腔是否顯影。

圖1 掛線法肛瘺造模

圖2 瘺管造影檢查評估瘺管是否形成（A：合適的攝片體位；B：瘺管造影檢查顯示瘺管內(nèi)及腸腔內(nèi)對比劑殘留；C：切取的瘺管組織）

1.4 CGF 凝膠的制備 抽取上腔靜脈血10 mL，按照Medifuge 離心機操作要求選擇CGF 模式進行差速離心，取上層凝膠（即CGF 凝膠），使用無菌剪刀修剪去除黏附的紅細胞層，見圖3（插頁）。細胞活性預(yù)實驗結(jié)果提示CGF 凝膠最佳濃度為20%，故細胞實驗部分以20% CGF 凝膠濃度進行研究。

圖3 自體濃縮生長因子凝膠的制備

1.5 動物實驗

1.5.1 動物分組與處理 將每只長白豬肛門左右側(cè)瘺管按隨機數(shù)字表法分為凝膠組和對照組。全麻成功后取仰臥位，固定四肢及尾部。清理殘留糞便，在肛門內(nèi)置入一塊潔凈紗布，防止術(shù)中近端腸道糞便污染手術(shù)區(qū)域；消毒肛周、肛管及下段腸道。先以食指探查瘺管內(nèi)口位置，然后將手指置于肛門中保護，在搔刮過程中避免損傷正常的肛管及腸道黏膜；使用刮匙自外口伸入瘺管，充分搔刮瘺管管壁；充分暴露內(nèi)口，直視下予3-0 可吸收縫線間斷縫合關(guān)閉內(nèi)口；將CGF凝膠從外口處填入搔刮后的瘺管中，外口處縫合1 針，以防止凝膠脫落，見圖4（插頁）。對照組僅行瘺管搔刮及關(guān)閉內(nèi)口。

圖4 自體濃縮生長因子凝膠的使用

1.5.2 療效觀察 觀察兩組瘺管創(chuàng)面愈合情況，檢測術(shù)后第7 天瘺管外口組織樣本PDGF、PCNA、α-SMA、c-fos mRNA 及蛋白表達水平以及細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）信號通路因子[包括絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MEK）1/2、磷酸化MEK（p-MEK）1/2、ERK1/2、磷酸化ERK（p-ERK）1/2]蛋白表達水平。（1）使用B 超檢查隨訪瘺管創(chuàng)面愈合情況。（2）采用qRT-PCR 法檢測各因子mRNA 表達水平。采用Trizol 裂解提取各組取瘺管外口組織總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以特異性引物擴增PDGF、PCNA、α-SMA、c-fos，進行qRT-PCR，以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算PDGF、PCNA、α-SMA、c-fos mRNA 表達水平。引物序列見表1。（3）采用Western blot 法檢測各因子蛋白表達水平。取瘺管外口組織樣本，提取蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度。蛋白變性后，使用30 μg 蛋白樣品進行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜并封閉，然后分別加入一抗（PDGF、PCNA、α-SMA、c-fos、p-MEK1/2、MEK1/2、p-ERK1/2、ERK1/2均為1∶1 000；GAPDH 為1∶5 000），在4 ℃下孵育過夜；加入羊抗兔二抗（1∶2 000，HRP 標記），室溫孵育；采用增強化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像、顯影。利用Image J 圖像分析系統(tǒng)進行分析，以目的條帶與GAPDH的灰度比值計算目的蛋白表達水平。

表1 引物序列

1.6 細胞實驗

1.6.1 細胞培養(yǎng)與分組 人皮膚成纖維細胞（human skin fibroblast，HSF）（批號：iCell-0051a）購自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司。將HSF 置于含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液中，在5% CO2、37 ℃、飽和濕度的環(huán)境下培養(yǎng)。調(diào)整細胞濃度，按5×105個/孔的密度接種于6 孔板中并培養(yǎng)24 h；然后按隨機數(shù)字表法分為對照組（10%FBS）、20% CGF 組、20% CGF+小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）組、20% CGF+siRNA ERK 組。按照LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，分別配制siRNA ERK 及siRNA 復(fù)合物，在對應(yīng)組細胞中加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物，同時在對應(yīng)組中使用20% CGF 進行干預(yù)，8 h 后收集細胞進行后續(xù)檢測。

1.6.2 CGF 對HSF 細胞增殖能力的影響檢測 采用免疫熒光法。配制10 μmol/L EdU 工作液并加入各組細胞中孵育4 h。95%乙醇溶液固定細胞，PBS 洗滌，TritonX-100 透化；配制Click 反應(yīng)液，室溫避光孵育30 min；使用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色2 min。使用倒置熒光顯微鏡進行觀察、拍照，統(tǒng)計每個視野中的細胞總數(shù)和陽性細胞數(shù)。HSF 細胞增殖百分比=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組瘺管創(chuàng)面愈合情況比較 凝膠組瘺管創(chuàng)面全部愈合，對照組有1 只假性愈合，其余創(chuàng)面均愈合，見圖5。凝膠組創(chuàng)面愈合時間為（10.50±1.38）d，明顯短于對照組的（17.00±1.41）d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 B 超檢查隨訪創(chuàng)面愈合情況（A：可見條索狀愈合瘢痕組織；B：可見低回聲區(qū)，提示假性愈合）

2.2 兩組瘺管外口組織樣本PDGF、PCNA、α-SMA、cfos mRNA 表達水平比較 凝膠組瘺管外口組織樣本PDGF、PCNA、α-SMA、c-fos mRNA 表達水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 兩組瘺管外口組織樣本PDGF、PCNA、α-SMA、c-fos mRNA表達水平比較

2.3 兩組瘺管外口組織樣本PDGF、PCNA、α-SMA、cfos 及ERK 信號通路因子蛋白表達水平比較 凝膠組瘺管外口組織樣本PDGF、PCNA、α-SMA、C-fos 及p-MEK1/2、p-ERK1/2 蛋白水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；兩組瘺管外口組織樣本MEK1/2、ERK1/2 蛋白表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見圖6 和表3～4。

表3 兩組瘺管外口組織樣本PDGF、PCNA、α-SMA、c-fos蛋白表達水平比較

表4 兩組瘺管外口組織樣本ERK信號通路因子蛋白表達水平比較

圖6 兩組瘺管外口組織樣本PDGF、PCNA、α-SMA、c-fos 及ERK 信號通路因子蛋白表達的電泳圖

2.4 干擾ERK 逆轉(zhuǎn)CGF 對HSF 細胞增殖能力的影響 與對照組比較，20% CGF 組、20% CGF+siRNA 組HSF 細胞增殖百分比均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與20% CGF+siRNA 組比較，20% CGF+siRNA ERK 組HSF 細胞增殖百分比明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖7。

圖7 干擾ERK 逆轉(zhuǎn)CGF 對HSF 細胞增殖能力的影響[A：免疫熒光圖，×200；B：各組HSF 細胞增殖百分比比較（n=3），與對照組比較，aP＜0.05；與20% CGF+siRNA 組比較，bP＜0.05]

3 討論

近年來，肛瘺發(fā)病率有明顯增高趨勢[2]。肛瘺發(fā)病時，患者肛周腫痛流膿且反復(fù)發(fā)作，會對工作和生活造成嚴重影響[3]。外科手術(shù)是目前治療肛瘺的主要方式，經(jīng)典術(shù)式為肛瘺切開術(shù)和肛瘺切除術(shù)，其中肛瘺切開術(shù)的復(fù)發(fā)率為3.3%～39.0%，切口愈合時間為47～67 d[4-7]；而肛瘺切除術(shù)的復(fù)發(fā)率為6.0%～23.8%，切口愈合時間為21～36 d[8-11]?？梢姡丿浶g(shù)后切口愈合時間較長，患者疼痛明顯且持續(xù)時間長，住院時間久，復(fù)發(fā)率較高，同時手術(shù)創(chuàng)傷也可能導(dǎo)致肛門功能減退，甚至肛門失禁等并發(fā)癥。

近年來臨床上涌現(xiàn)了一些基于生物材料填充瘺管治療肛瘺的方法，主要包括生物膠、肛瘺栓、脫細胞基質(zhì)等[12-14]。這些方法治療肛瘺的原理是通過生物材料的修復(fù)作用促進肛瘺的愈合。但這些方法治療肛瘺的復(fù)發(fā)率仍然較高，且生物材料價格較為昂貴，并且作為異源性物質(zhì)，其組織相容性也欠佳。自體富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是通過離心的方法從自體血液中提取獲得的血小板濃縮物，含有高濃度的生長因子，具有加速傷口愈合的功效[15]。Moreno-Serrano 等[16]采用PRP 治療23 例肛瘺患者，隨訪1 年發(fā)現(xiàn)其治愈率達62%，且無患者發(fā)生括約肌損傷。CGF是最新一代的富血小板產(chǎn)物，相較于PRP，其包含更豐富的生長因子[17]。本研究將CGF 凝膠填塞入搔刮后的瘺管中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)凝膠組瘺管愈合時間較對照組明顯縮短，且無假性愈合發(fā)生。

組織修復(fù)過程存在一個極其復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制，各種生長因子參與創(chuàng)面愈合的調(diào)控，其中PDGF 是目前公認的與創(chuàng)面愈合關(guān)系密切的生長因子之一。PDGF 對于間充質(zhì)細胞、成纖維細胞和平滑肌細胞至關(guān)重要，具有促進細胞增殖和分化、刺激IL-6合成、促進新生血管形成、修復(fù)血管內(nèi)膜等作用[18-20]。本研究將CGF 凝膠填塞入瘺管后發(fā)現(xiàn)組織樣本中PDGF 蛋白表達水平明顯升高，進而促進組織生長和血管生成。此外，PDGF 與ERK 在組織修復(fù)中的作用密切相關(guān)[21-22]。ERK 是絲裂原活化蛋白激酶家族成員，它的信號傳遞涉及細胞生長、發(fā)育及分裂的調(diào)控[23-24]，而ERK 信號通路的激活介導(dǎo)成纖維細胞的增殖和遷移，可促進肉芽組織生長，進而促進創(chuàng)面愈合[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)，ERK 信號通路因子p-MEK1/2、p-ERK1/2 蛋白表達水平以及下游信號分子PCNA、α-SMA、c-fos mRNA 及蛋白表達水平均明顯高于對照組，進而促進細胞增殖及血管形成。在HSF 細胞實驗中進一步證實，CGF 能明顯提高HSF 細胞增殖能力，而使用siRNA 干擾ERK 信號通路后，CGF 對HSF 細胞增殖能力的影響明顯減弱；提示CGF 可以通過激活ERK 信號通路來提高HSF 細胞增殖能力，且這種作用可以被siRNA ERK 逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，CGF 凝膠治療肛瘺有效，其作用機制是通過上調(diào)ERK 信號通路因子水平來促進HSF 增殖，從而加速瘺管愈合。由于肛瘺術(shù)后是否治愈需要長期觀察，但本研究受限于動物實驗，觀察時間較短，因此存在一定的局限性。今后仍需深入研究CGF 凝膠在肛瘺微創(chuàng)治療中的應(yīng)用價值。