陳 衛(wèi) 楊傳松 劉 英

江油市人民醫(yī)院川北醫(yī)學(xué)院附屬江油醫(yī)院，四川 江油 621700

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是現(xiàn)階段臨床最為常見(jiàn)的與年齡等因素密切相關(guān)的神經(jīng)元變性疾病，臨床多表現(xiàn)為漸進(jìn)性認(rèn)知功能損害［1］。老年斑、大腦內(nèi)神經(jīng)纖維糾纏是AD的主要病理特征［2］。此外，有研究顯示大腦炎性反應(yīng)過(guò)程多表現(xiàn)為神經(jīng)元炎性反應(yīng)，其可能在AD 的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到十分重要的作用，其中大腦膠質(zhì)細(xì)胞激活可能是其主要病理基礎(chǔ)［3］。研究指出，β淀粉樣蛋白可導(dǎo)致神經(jīng)毒性細(xì)胞釋放反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)，引起AD病情進(jìn)展［4］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）在AD 發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到十分重要的作用，有研究指出lncRNA-BACE1-AS（BACE lantisense RNA）在AD腦組織呈明顯異常高表達(dá)狀態(tài)［5］。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）是人體內(nèi)重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族成員，可有效改善和修復(fù)神經(jīng)元損傷。有研究指出microRNA 可作為疾病診斷的重要標(biāo)志物，其在細(xì)胞間信號(hào)傳遞過(guò)程中起十分重要的作用［6］，但其在診斷AD中的應(yīng)用仍鮮有報(bào)道，本次研究以江油市人民醫(yī)院收治的AD患者為對(duì)象，分析聯(lián)合檢測(cè)血漿和腦脊液lncRNA BACE-AS、BDNF、miR-193b水平在阿爾茨海默病診斷中的價(jià)值及與認(rèn)知功能的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取江油市人民醫(yī)院符合入組及排除標(biāo)準(zhǔn)的50例AD患者及100例健康者為對(duì)象，其中AD組患者男27例，女23例；年齡（68.34±8.39）歲；文化程度：小學(xué)7例，初中14例，高中及以上29例；認(rèn)知功能障礙程度：輕度19例，中度17例，重度14例。健康對(duì)照組男51 例，女49 例；年齡（69.13±8.83）歲；文化程度：小學(xué)19 例，初中41 例，高中及以上40 例。2組性別、年齡及文化程度比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者臨床癥狀符合美國(guó)精神障礙與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)中AD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）可正常配合完成相關(guān)檢查；（3）年齡≥60 歲；（4）AD 患者簡(jiǎn)易智能精神狀態(tài)檢查量表（mini-mental state examination，MMSE）≤26分；（5）患者法定監(jiān)護(hù)人對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）除AD 外其他類型癡呆者；（2）抑郁癥或精神分裂癥者；（3）藥物依賴或慢性酒精中毒所致認(rèn)知障礙者；（4）存在難以控制的或急性軀體疾病者；（5）入組前半年內(nèi)服用可能影響認(rèn)知功能的藥物者；（6）主動(dòng)申請(qǐng)退出研究者。

1.2 方法

1.2.1 測(cè)定lncRNA BACE-AS、BDNF、miR-193b 水平：所有受試者入組后采集空腹靜脈血，3 000 r/min離心10 min（儀器Centrifuge 5702）后收集血漿，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血漿BDNF水平，并采用超速離心法收集血腫外吐小體，RT-PCR法檢測(cè)外吐小體中l(wèi)ncRNA BACE-AS 和miR-193b 水平。采集AD 組患者腦脊液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)腦脊液BDNF水平，RT-PCR 法檢測(cè)腦脊液lncRNA BACE-AS 和miR-193b水平。

1.2.2 認(rèn)知功能評(píng)定：采用阿爾茨海默病評(píng)定量表認(rèn)知分量表（Alzheimer’s disease assessment scalecognitive score，ADAS-Cog）［7］對(duì)AD 患者的認(rèn)知功能進(jìn)行評(píng)估。

1.2.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)：診斷金標(biāo)準(zhǔn)為美國(guó)國(guó)立神經(jīng)、語(yǔ)言交流障礙及卒中研究所和阿爾茨海默病及相關(guān)疾病協(xié)會(huì)（National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke/Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association，NINCDS/ADRDA）擬診標(biāo)準(zhǔn)。血清lncRNA BACE-AS/GAPDH 診斷標(biāo)準(zhǔn)：≥0.66；血清BDNF 診斷標(biāo)準(zhǔn)：≥6.58 μg·L-1；血清miR-193b/GAPDH 診斷標(biāo)準(zhǔn)：＜0.83。血清lncRNA BACE-AS、BDNF、miR-193b 水平聯(lián)合診斷標(biāo)準(zhǔn)：三者中任何一個(gè)確診即判斷為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用率表示計(jì)數(shù)資料，均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量資料，分別行卡方及t 檢驗(yàn)。以分組結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，Logistic 回歸模型分析各指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)價(jià)值，繪制ROC 曲線分析各指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合診斷意義，并采用Pearson 相關(guān)性分析AD 患者腦脊液中各指標(biāo)與患者認(rèn)知功能的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組對(duì)象血漿lncRNA BACE-AS、BDNF、miR-193b水平比較AD組患者血漿lncRNA BACE-AS 及BDNF水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），miR-193b水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 2組血漿lncRNA BACE-AS、BDNF、miR-193b水平比較 （±s）Table 1 Comparison of plasma lncRNA BACE-AS，BDNF and miR-193b levels in the two groups （±s）

表1 2組血漿lncRNA BACE-AS、BDNF、miR-193b水平比較 （±s）Table 1 Comparison of plasma lncRNA BACE-AS，BDNF and miR-193b levels in the two groups （±s）

組別AD組對(duì)照組t值P值n 50 100 lncRNA BACE-AS/GAPDH 0.70±0.18 0.62±0.15 2.877 0.005 BDNF/（μg·L-1）7.12±2.69 6.17±2.1 2.372 0.019 miR-193b/GAPDH 0.77±0.59 0.94±0.42 2.032 0.044

2.2 各指標(biāo)診斷AD 結(jié)果以lncRNA BACE-AS 作為診斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)AD 陽(yáng)性71 例，BDNF 作為診斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)AD 陽(yáng)性77 例，miR-193b 作為診斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)AD 陽(yáng)性75 例，聯(lián)合診斷作為診斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)AD 陽(yáng)性78 例，見(jiàn)表2。

表2 各指標(biāo)診斷AD結(jié)果Table 2 Diagnostic AD results of each index

2.3 各指標(biāo)的診斷效能lncRNA BACE-AS、BDNF及miR-193b 三指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)診斷AD 的敏感度及AUC 均明顯高于各指標(biāo)單獨(dú)使用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3及圖1。

圖1 各指標(biāo)診斷AD的ROC曲線Figure 1 ROC curves for diagnosing AD by each index

表3 各指標(biāo)的診斷效能Table 3 Diagnostic performance of each index

2.4 不同認(rèn)知功能AD 患者腦脊液各指標(biāo)水平比較所有AD 患者均完成ADAS-Cog 評(píng)分評(píng)定，依據(jù)ADAS-Cog評(píng)分結(jié)果將患者分為輕度、中度和重度認(rèn)知功能障礙3組。隨著AD患者認(rèn)知功能障礙加重，腦脊液lncRNA BACE-AS及BDNF水平顯著升高（P＜0.05），miR-193b水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 不同認(rèn)知功能AD患者腦脊液中各指標(biāo)檢測(cè)水平（±s）Table 4 Detection levels of cerebrospinal fluid in patients with different cognitive function AD （±s）

表4 不同認(rèn)知功能AD患者腦脊液中各指標(biāo)檢測(cè)水平（±s）Table 4 Detection levels of cerebrospinal fluid in patients with different cognitive function AD （±s）

類型輕度認(rèn)知障礙中度認(rèn)知障礙重度認(rèn)知障礙n 19 17 14 lncRNA BACE-AS/GAPDH 0.60±0.25 0.87±0.18 0.99±0.31 BDNF/（μg·L-1）6.24±1.83 8.12±2.25 10.80±3.94 miR-193b/GAPDH 0.58±0.32 0.47±0.20 0.31±0.25

2.5 腦脊液lncRNA BACE-AS、BDNF、miR-193b水平與AD 患者認(rèn)知功能的相關(guān)性相關(guān)性分析顯示，lncRNA BACE-AS、BDNF 與AD 患者認(rèn)知功能障礙呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），miR-193b 與認(rèn)知功能障礙呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 腦脊液lncRNA BACE-AS、BDNF、miR-193b與AD患者認(rèn)知功能的相關(guān)性Table 5 Correlation between cerebrospinal fluid lncRNA BACE-AS，BDNF and miR-193b and cognitive function in AD patients

2.6 血漿和腦脊液lncRNA BACE-AS、BDNF、miR-193b水平的相關(guān)性Pearson相關(guān)性分析顯示，血漿和腦脊液lncRNA BACE-AS、BDNF、miR-193b水平均呈正相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表6。

表6 血漿和腦脊液lncRNA BACE-AS、BDNF、miR-193b的相關(guān)性Table 6 Correlation of blood and cerebrospinal fluid lncRNA BACE-AS，BDNF and miR-193b

3 討論

AD 是現(xiàn)階段臨床最為常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，以漸進(jìn)性認(rèn)知損傷及記憶力下降、社會(huì)和生活功能降低為主要臨床特征。人體內(nèi)β淀粉樣蛋白沉積導(dǎo)致tau 蛋白過(guò)度磷酸化、胞外老年斑等，進(jìn)而導(dǎo)致胞內(nèi)神經(jīng)元纏結(jié)，其可作為治療AD的潛在良好靶標(biāo)，但AD的具體發(fā)病機(jī)制及病因尚未被完全揭示［8］。在AD發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中大腦炎性反應(yīng)起十分重要的作用，其中神經(jīng)元炎性反應(yīng)最為重要，其病理改變常導(dǎo)致大腦膠質(zhì)細(xì)胞大量激活，出現(xiàn)反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生［9］。β淀粉樣蛋白可能導(dǎo)致反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生，從而導(dǎo)致細(xì)胞釋放神經(jīng)毒性細(xì)胞因子，加重AD 病情進(jìn)展［10］。一般情況下，AD 患者起病相對(duì)隱匿，病程較長(zhǎng)，呈漸進(jìn)性進(jìn)展，且患者早期癥狀與正常老年人的老齡化現(xiàn)象較為類似，因而常被本人及家屬誤認(rèn)為正?，F(xiàn)象，導(dǎo)致未及時(shí)診斷而錯(cuò)過(guò)最佳的干預(yù)時(shí)機(jī)，因此，對(duì)AD 患者盡早準(zhǔn)確診斷及鑒別是有效改善臨床癥狀的重要途徑［11-13］。

BDNF是人體內(nèi)重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中起十分重要的作用，可有效刺激神經(jīng)元生長(zhǎng)、分化及維持正常生理功能［14］。此外，BDNF 可有效抵抗傷害性刺激，加速修復(fù)損傷的神經(jīng)元［15-16］。BDNF 可有效通過(guò)血腦屏障，且腦內(nèi)BDNF 水平與外周血中BDNF 水平呈顯著正相關(guān)［17］。隨著近年來(lái)研究的不斷深入，miR 在AD 發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中所起的作用日益受到學(xué)者的關(guān)注［18-20］。miR主要通過(guò)改變其轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)而參與AD的發(fā)生、發(fā)展。隨著芯片及測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，miR的檢測(cè)成本顯著降低，因而AD 發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中越來(lái)越多的miR 被重視［21］。有學(xué)者提出細(xì)胞外通訊RNA 假說(shuō)，認(rèn)為在細(xì)胞的增殖及分化過(guò)程中細(xì)胞外RNA起十分重要的作用［22］。miR193-b在AD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)中參與多種神經(jīng)細(xì)胞的損傷過(guò)程，其水平異常升高可能加速神經(jīng)元凋亡［23-24］。lncRNA BACE1-AS 是體內(nèi)重要的保守性非編碼翻譯轉(zhuǎn)錄物，可與BACE1 形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，并增加其穩(wěn)定性，有助于修復(fù)患者神經(jīng)細(xì)胞［25］。

本研究顯示，AD 患者血漿lncRNA BACE-AS、BDNF 水平顯著高于對(duì)照組，且miR-193b 水平顯著低于對(duì)照組。采用Logistic 聯(lián)合檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)血漿lncRNA BACE-AS、BDNF、miR-193b水平在AD篩查過(guò)程中具有十分重要的意義，三指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)可有效提高診斷價(jià)值，改善診斷AD的敏感度及特異度。對(duì)AD 組腦脊液lncRNA BACE-AS、BDNF、miR-193b水平進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著AD患者認(rèn)知功能減退，其腦脊液lncRNA BACE-AS、BDNF水平顯著增加，miR-193b水平顯著降低。此外，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)lncRNA BACE-AS、BDNF與AD患者認(rèn)知功能呈顯著正相關(guān)，與miR-193b 水平呈顯著負(fù)相關(guān)，提示lncRNA BACE-AS、BDNF、miR-193b 水平在AD 發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起十分重要的作用，可能參與患者認(rèn)知功能的改變。因此，對(duì)AD 患者體內(nèi)lncRNA BACE-AS、BDNF、miR-193b 水平采用Logistic 模型進(jìn)行綜合分析，有助于提高診斷價(jià)值。

聯(lián)合檢測(cè)血漿lncRNA BACE-AS、BDNF、miR-193b 水平可顯著提高AD 的診斷價(jià)值，腦脊液lncRNA BACE-AS、BDNF水平與AD認(rèn)知功能呈顯著正相關(guān)，miR-193b 水平與AD 認(rèn)知功能呈顯著負(fù)相關(guān)。本次研究樣本數(shù)較少，有待后續(xù)加大樣本量進(jìn)行深入研究。